食品波譜學(xué)課程論文

1、高效液相色譜法在食品分析中的應(yīng)用摘要：隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，食品檢測(cè)方法被不斷開發(fā)出來，高效液相色譜法（HPLC）作為色譜分析法的一個(gè)分支，是一種熱門的新型分離分析技術(shù)。本文將從高效液相色譜的原理及特點(diǎn)進(jìn)行綜述，將會(huì)著重介紹高效液相色譜在食品樣品分析中的應(yīng)用及操作方法，并對(duì)高效液相色譜法的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞：高效液相色譜，食品分析，應(yīng)用Application of High Performance Liquid Chromatography in food analysisAbstract: With the continuous development of science and

2、 technology, food detection methods have been developed, high performance liquid chromatography (HPLC) as a branch of chromatographic analysis, is a popular new separation and analysis technology. In this paper, the principle and characteristics of high performance liquid chromatography (HPLC) was s

3、ummarized. The application and operation method of high performance liquid chromatography (HPLC) in food sample analysis was introduced. The application prospect of high performance liquid chromatography (HPLC) was also discussed.Key woeds:high performance liquid chromatography (HPLC) ;food analysis

4、;application1 高效液相色譜概述1.1背景1903n年俄國植物化學(xué)家Tswett 首次提出“色譜法”（Chromatography）和“色譜圖”（Chromatogram）的概念。1930年以后，相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術(shù)。1952年，英國學(xué)者M(jìn)artin和Synge基于他們?cè)诜峙渖V方面的研究工作，提出了關(guān)于氣-液分配色譜的比較完整的理論和方法，把色譜技術(shù)向前推進(jìn)了一大步，這是氣相色譜在此后的十多年間發(fā)展迅速的原因。1960年中后期，氣相色譜理論和實(shí)踐發(fā)展，以及機(jī)械、光學(xué)、電子等技術(shù)上的進(jìn)步，將高壓泵和化學(xué)鍵和固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了高效液相色譜。1

5、970年中期以后，微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜，進(jìn)一步提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度。1.2原理高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography ,HPLC）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種以液體為流動(dòng)相的分離分析技術(shù)。其基本原理是各組分在固定相和流動(dòng)相中的吸附能力存在差異，當(dāng)溶于流動(dòng)相中的各組分流經(jīng)固定相時(shí)，各組分在兩相之間進(jìn)行反復(fù)多次吸附與分配，由于各組分在兩相間的分配系數(shù)不同，各組分就會(huì)先后流出色譜柱，結(jié)合柱后檢測(cè)器加以檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)各組分被分離檢測(cè)的目的。1高效液相色譜儀主要由輸液泵、色譜柱、檢測(cè)器、記錄器等組成。它將具有不同極性的單一溶劑或不同

6、比例的混合溶劑、緩沖液等作為流動(dòng)相，用輸液泵將流動(dòng)相壓入裝有填充劑的色譜柱，注入樣品溶液，經(jīng)流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在填充劑上分離后，各成分先后進(jìn)入檢測(cè)器，記錄色譜圖，進(jìn)行定性定量分析2。進(jìn)樣器梯度淋洗參比色譜柱樣品色譜柱 壓力表氫焰監(jiān)測(cè)器溶劑槽高壓 輸液泵記錄儀視差折光監(jiān)測(cè)器紫光監(jiān)測(cè)器自動(dòng)收集器圖1 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖高效液相色譜中包括多種分離模式。按色譜過程的分離機(jī)制，可以將液相色譜法分為吸附色譜、分配色譜、空間排阻色譜、離子交換色譜及親和色譜等類別。根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別，也可分為正相色譜和反相色譜兩種模式。流動(dòng)相的極性大于固定相的極性時(shí)，稱為反相色譜；反之，稱為正相色譜。31.3特

7、點(diǎn) 高效液相色譜法（HPLC）作為色譜分析法的一個(gè)分支，是一種新型的分離分析技術(shù)，它是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上引入氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用高效微粒固定相、新型高壓輸液泵和高靈敏度檢測(cè)器，從而具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高的特點(diǎn)。其綜合了氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，并加以發(fā)展，尤其對(duì)高沸點(diǎn)仍不氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質(zhì)具有良好的分析效果，其分析速度快、操作簡(jiǎn)單、靈敏度好、分離效能高，分離和測(cè)定一次完成，可以和多種波譜分析儀器聯(lián)用，易于自動(dòng)化，現(xiàn)在的色譜儀器已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)從進(jìn)樣到數(shù)據(jù)處理的全自動(dòng)化操作。因此多被應(yīng)用于食品分析、生物化學(xué)、環(huán)境分析、藥物及臨床分析等4。色譜法最大的缺點(diǎn)便是定性

8、能力較差。為克服這一缺點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)展起來了色譜法與其他多種具有定性能力的分析技術(shù)的聯(lián)用。尤其是氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的快速發(fā)展，大大克服了色譜法的缺點(diǎn)。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合計(jì)算機(jī)各種軟件的開發(fā)，使HPLC與各種檢測(cè)儀器聯(lián)用，更加拓寬了HPLC的應(yīng)用范圍。近年來，高效液相色譜儀的各個(gè)組成部件都有新的發(fā)展，使HPLC分析更加靈敏準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便快速。特別是聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，使之在藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)及生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更具重要意義2。目前我國已逐漸將HPLC法列為食品檢測(cè)添加劑、污染物、無機(jī)成分、營養(yǎng)成分、毒素等的國標(biāo)方法5。高效液相色譜法適于分析分子量大、受熱不穩(wěn)定易分解的、高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、不同極性的有機(jī)化合物

9、；多種天然產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)；合成的和天然的高分子化合物等。它們涉及食品、環(huán)境污染物、合成藥物、生物化工產(chǎn)品及石油產(chǎn)品等，約占全部有機(jī)化合物的80%。32 高效液相色譜儀的使用方法以日本島津LC-20AT高效液相色譜儀為例，其包括CBM-20A系統(tǒng)控制器、LC-20AT溶液傳輸單元、DGU-20A3真空脫氣機(jī)、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、RF-10AXL熒光檢測(cè)器以及CTO-20A柱溫箱和Varian380-LC蒸發(fā)光檢測(cè)器等部分。本儀器采用高壓梯度通過高壓輸液泵分別獨(dú)立精確控制流量、調(diào)整溶劑濃度比例，實(shí)現(xiàn)高效率、高精度混合；即配備了可提供全波長(zhǎng)三維信息的二極管

10、陣列檢測(cè)器，全新的光路設(shè)計(jì)與有效的梯形狹縫池設(shè)計(jì)保證了高分辨率和高靈敏度；也配備了靈敏度更高、選擇性更好的熒光檢測(cè)器；還配備了具有高靈敏度、檢測(cè)范圍更廣的蒸發(fā)光檢測(cè)器。本儀器可以高效地分離分析高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定的有機(jī)及生化試樣；二極管陣列檢測(cè)器對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)；熒光檢測(cè)器可以檢測(cè)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，對(duì)如多環(huán)芳烴、維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)碳?xì)浠衔?、表面活性劑、聚合物、脂肪酸和氨基酸、油和揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品、不含發(fā)色團(tuán)的化合物有響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)操作開始前應(yīng)先確定好色譜條件，例如流動(dòng)相的成分及比例，檢測(cè)波長(zhǎng)和柱溫等等，其次是制

11、備好對(duì)照品和供試品溶液。接下來就可以將樣品進(jìn)行檢測(cè)了，高效液相色譜儀操作步驟：   1) 過濾流動(dòng)相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。  2) 對(duì)抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。  3) 打開HPLC工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動(dòng)相管道，連接檢測(cè)系統(tǒng)。  4) 進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點(diǎn)擊manual，進(jìn)入手動(dòng)菜單。  5) 有一段時(shí)間沒用，或者換了新的流動(dòng)相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽

12、取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點(diǎn)擊purge，再點(diǎn)擊start，沖洗時(shí)速度不要超過10 ml/min。6) 調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點(diǎn)擊injure，選用合適的流速，點(diǎn)擊on，走基線，觀察基線的情況。7) 設(shè)計(jì)走樣方法。點(diǎn)擊file，選取select users and methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個(gè)新的方法，點(diǎn)擊new method。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測(cè)器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點(diǎn)擊protocol

13、。一個(gè)完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時(shí)間，隨不同的樣品而不同。  8) 進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點(diǎn)擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點(diǎn)擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。9). 積分 單擊再解析，打開已經(jīng)完成的數(shù)據(jù)，會(huì)看到數(shù)據(jù)、方法、報(bào)告格式、批處理、全部文件形式。 點(diǎn)擊分析圖標(biāo)，選擇多色譜，提取所要波長(zhǎng)下的峰。 在積分頁面，選擇通道，半峰寬，斜率

14、，最小峰面積，一般選擇面積選項(xiàng)。識(shí)別頁面，利用時(shí)間窗或時(shí)間帶限制峰。3 高效液相色譜法在食品分析中的應(yīng)用高效液相色譜法在食品分析中有著廣泛的應(yīng)用，如分析食品中的營養(yǎng)成分、食品添加劑、有害物質(zhì)殘留等等3.1分析食品中的營養(yǎng)成分對(duì)食品中營養(yǎng)成分進(jìn)行檢測(cè)具有兩方面的意義：一方面為了避免人體中維生素、氨基酸等營養(yǎng)成分的缺乏，就要有目的的從不同食物中獲取營養(yǎng)成分，從而合理安排膳食。因此可以利用高效液相色譜法獲知食品中所含的成分種類及含量。另一方面可以通過食品中相關(guān)成分的檢測(cè)為合理的開發(fā)利用天然食品提供依據(jù)。賀利民6等使用美國TSP公司的Spectra SYSTEM UV3000HR可高速掃描的紫外可見檢

15、測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了維生素A、D和E的同時(shí)紫外區(qū)掃描，據(jù)此選擇各自最大吸收性波長(zhǎng)，探討了南中國深海小魚中脂溶性維生素A、D和E的3波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定，質(zhì)量濃度為0.1010mg/L范圍內(nèi)，維生素A、D、E均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為0.050.62mg/L，回收率在90.0%110%之間，方法準(zhǔn)確度和精密度完全符合分析檢測(cè)要求。李艷艷3等采用日本島津LC-20A高效液相色譜儀對(duì)豆奶粉中的四種大豆異黃酮（大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素）進(jìn)行了測(cè)定。大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素的線性范圍分別是0.74100.00µg/mL，0.74200.00µg/mL，0.167500.0

16、0µg/mL，0.198160.00µg/mL（r0.9996），線性關(guān)系良好；加樣回收率（n=9）分別為100.01%，100.01%，99.48%，99.91%，方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，適用于豆奶粉中這四種大豆異黃酮成分的含量測(cè)定和產(chǎn)品質(zhì)量控制。3.2分析食品中的添加劑近年來，食品安全問題頻頻曝光，食品生產(chǎn)過程中添加劑的過量使用及非法添加物的使用是導(dǎo)致食品安全問題貧乏的重要因素之一。目前食品添加劑存在的安全風(fēng)險(xiǎn)主要包括兩個(gè)方面：一是法定允許使用的食品添加劑過量、超范圍使用，二是不法生產(chǎn)者將一些工業(yè)用的化學(xué)品或未達(dá)到食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)的原料非法添加到食品中。這些不法添加劑的使用

17、可能會(huì)危害身體健康，因此必須加強(qiáng)對(duì)食品添加劑的檢測(cè)。劉敏等7采用簡(jiǎn)單高效的前處理技術(shù)，并結(jié)合高效液相色譜法對(duì)多種食品添加劑及違法添加物進(jìn)行了定性和定量研究。以調(diào)味品、餅干、加工肉制品三類具有一定代表性的基質(zhì)復(fù)雜的樣品作為檢測(cè)對(duì)象，以8種抗氧化劑為目標(biāo)分析產(chǎn)物，用凝膠滲透色譜（GPC）凈化經(jīng)C18柱高效液相色譜分析，三種樣品的添加回收率均在75.62%104.19%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，檢出限為0.311.46µg/g。3.3分析有害物質(zhì)殘留在一些食品中會(huì)有農(nóng)藥獸藥以及霉菌毒素等有害物質(zhì)殘留，危害人體健康。因此對(duì)對(duì)食品中這些物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)是十分必要的。應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)和免疫親

18、和柱萃取，檢測(cè)限為10ng/kg，可檢測(cè)酸奶等食品中是否含有黃曲霉素；應(yīng)用高效液相色譜與大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜聯(lián)用，檢測(cè)限為0.12pg/kg，可檢測(cè)粗提物食品中的玉米烯酮霉素。8目前檢測(cè)食品中的獸藥殘留主要用ODS-C18色譜柱的方法，檢測(cè)呋喃唑酮的殘留量使用的流動(dòng)相中乙腈、水和磷酸的體積比為40:6:1.動(dòng)物性肌肉中的金霉素、四環(huán)素、土霉素和強(qiáng)力霉素等殘留也可通過固相萃取-高效液相色譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，液相檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)獸藥殘留的準(zhǔn)確度高，回收率達(dá)到85%以上。4 結(jié)語綜上所述，高效液相色譜法作為目前市場(chǎng)上進(jìn)行食品安全檢測(cè)的一種高效方便、準(zhǔn)確實(shí)用的分析分離手段，得到了廣泛應(yīng)用。通過液相色譜檢測(cè)技術(shù)可以進(jìn)行多種食品營養(yǎng)成分分析和食品添加劑及有害物質(zhì)檢測(cè)等問題，提升食品質(zhì)量。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，食品檢測(cè)技術(shù)也會(huì)越來越多樣，越來越便捷準(zhǔn)確，高效液相色譜法在食品中的應(yīng)用也將會(huì)越來越廣泛。參考文獻(xiàn)：1高效液相色譜法-離子色譜法在環(huán)境分析和食品分析中的應(yīng)用研究，熊建飛2高效液相色譜法在食品分析和藥物分析中的應(yīng)