ABO血型正、反定型

1、 ABO血型正、反定型操作規(guī)程目的 保證ABO血型鑒定準(zhǔn)確，確保臨床輸血安全。適用范圍 XXX醫(yī)院輸血科職責(zé) 具有專業(yè)技術(shù)的工作人員主要負責(zé)本院輸血（或備血）標(biāo)本的ABO血型鑒定（但只對該單份標(biāo)本負責(zé)）。相關(guān)文件 試劑采購、保存和使用管理程序 設(shè)備采購、使用管理程序 消毒與清潔管理程序 標(biāo)本采集、運輸、保存和報廢管理程序緊急用血管理程序相關(guān)記錄 儀器設(shè)備的采購、使用和維護記錄 儀器的溫度記錄 恒溫水溫箱的換水和消毒記錄 消毒液的配置記錄 清潔消毒記錄 試劑采購、使用記錄 標(biāo)本交接和報廢記錄 緊急用血記錄實驗原理 ABO血型是根據(jù)紅細胞表面存在的凝集原決定的。存在A凝集原的稱為A型，存在B凝集原

2、的稱為B型。而血清中還存在凝集素。當(dāng)A凝集原與抗A凝集素相遇或B凝集原與抗B凝集素相遇時，會發(fā)生紅細胞凝集反應(yīng)。一般A型血清中含有抗B凝集素，B型血清中含有抗A凝集素，因此可以用標(biāo)準(zhǔn)血清中的凝集素與被測者的紅細胞反應(yīng)（稱為正定型），用標(biāo)準(zhǔn)紅細胞與被測者血清中的凝集素反應(yīng)（稱為反定型），以確定其ABO血型。 儀器器械 玻璃試管、玻片、記號筆、一次性塑料滴管、顯微鏡、普通離心機、試管架、恒溫水溫箱、試劑保存冰箱、標(biāo)本保存冰箱。試劑 抗A標(biāo)準(zhǔn)血清、抗B標(biāo)準(zhǔn)血清、A型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞、B型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞、O型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞、生理鹽水。以上試劑均為有合格證件的正品。標(biāo)本收集與處理1受檢者血清：采集受檢者靜脈血23ml

3、，經(jīng)1000r/min離心1分鐘或室溫靜置1小時后取上清。225%的受檢者紅細胞：采集受檢者靜脈血或末梢血，用生理鹽水制成25紅細胞鹽水懸液備用，制備方法見本節(jié)質(zhì)量控制和注意事項。 3標(biāo)本出現(xiàn)中度以上溶血者，為不合格標(biāo)本，不能用于檢測。實驗方法與步驟 1.ABO血型的正定型（試管法）： 、取2支試管，分別標(biāo)上抗A和抗B； 、制備待測標(biāo)本25%的紅細胞懸液（取1支試管，加入2ml生理鹽水，再加入1滴待測標(biāo)本紅細胞，混勻備用）； 、在抗A管中加入2滴抗A標(biāo)準(zhǔn)血清，在抗B管中加入2滴抗B標(biāo)準(zhǔn)血清；、在抗A和抗B管中分別加入1滴已制備好的待測標(biāo)本25%紅細胞懸液；、混勻后，立即對稱放入離心機中進行10

4、00r/min離心1分鐘，或室溫靜置1小時，再輕輕搖動試管，使沉于管底的紅細胞浮起，先肉眼觀察有無凝集現(xiàn)象，如內(nèi)眼不見凝集，應(yīng)將反應(yīng)物倒于玻片上，再以低倍鏡檢查。根據(jù)有無凝集現(xiàn)象判定結(jié)果如下。注意凝集強度，此有助于A、B亞型、類B或cisAB的發(fā)現(xiàn)。ABO血型抗A標(biāo)準(zhǔn)血清抗B標(biāo)準(zhǔn)血清A型B型O型AB型凝集強度判斷標(biāo)準(zhǔn) 4十 紅細胞凝集成一大塊，血清清晰透明。 3十 紅細胞凝集成數(shù)小塊，血清尚清晰。 2十 紅細胞凝塊分散成許多小塊，見到游離紅細胞。 1十 肉眼可見大顆粒，周圍有較多游離紅細胞。 土鏡下可見數(shù)個紅細胞凝集在一起，周圍有很多 游離紅細胞。 MF 混合凝集外觀(mixed field)

5、是指鏡下可見少數(shù)紅細胞凝集，而極大多數(shù)紅細胞仍呈分散分布。 一 表示陰性，鏡下未見凝集，紅細胞均勻分布。2.ABO血型的反定型（試管法）：、取3支試管，分別標(biāo)上A、B和O； 、在3支試管中分別加入2滴待測標(biāo)本的血清； 、將ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細胞輕輕地充分混勻后，在A管中加入1滴A型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞，在B管中加入1滴B型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞，在O管中加入1滴O型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞；、混勻后，對稱放入離心機中進行1000r/min離心1分鐘（或3400 r/min離心15秒）；、取出后，先觀察是否溶血（溶血可能是陽性結(jié)果，或者是細菌污染），再輕輕搖動試管，肉眼觀察有無凝集現(xiàn)象，肉眼不易分辨的用顯微鏡觀察；根據(jù)有無凝集現(xiàn)象判定結(jié)

6、果如下。注意凝集強度，此有助于A、B亞型、類B或cisAB的發(fā)現(xiàn)。ABO血型A型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞B型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞O型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞A型B型O型AB型凝集強度判斷標(biāo)準(zhǔn) （同ABO血型的試管法正定型）質(zhì)量控制和注意事項1、分型標(biāo)準(zhǔn)血清試劑必須為三證齊全的合格產(chǎn)品，質(zhì)量性能符合要求，且在有效期內(nèi)使用。試劑開封后必須貼上注有開封日期和開封人的標(biāo)簽，使用后應(yīng)及時置于28專用冰箱中保存，以免細菌污染和變質(zhì)而影響試驗結(jié)果。試劑開封后有效期為一周。2、商用分型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞試劑必須為三證齊全的合格產(chǎn)品，質(zhì)量性能符合要求，且在有效期內(nèi)使用；自制分型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞試劑必須以3個健康者同型新鮮紅細胞混和，用生理鹽水洗滌 13次，以除卻

7、存在于血清中的抗體及可溶性抗原，再制成25%的紅細胞懸液備用。試劑開封或制備后必須貼上注有開封或制備日期和開封人或制備人的標(biāo)簽，使用后應(yīng)及時置于28專用冰箱中保存，以免細菌污染和變質(zhì)而影響試驗結(jié)果。試劑開封或制備后有效期為一周。3、生理鹽水啟用后，有效期為二周。4、所有試劑在使用時，必須檢查是否有渾濁、變色、凝集等變質(zhì)現(xiàn)象；凡可疑者，必須更換新的試劑進行檢測。若分型標(biāo)準(zhǔn)血清使用時間較長后，最好用已知的ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細胞檢查結(jié)果是否與已知的血型相符；若分型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞使用時間較長后，最好用已知的分型標(biāo)準(zhǔn)血清檢查結(jié)果是否與已知的血型相符，以防標(biāo)準(zhǔn)血清或紅細胞制品污染、變質(zhì)失效而造成鑒定錯誤。5、試管、

8、滴管和玻片必須清潔干燥，防止溶血。6、操作方法應(yīng)按規(guī)定進行，一般應(yīng)先加血清，后加紅細胞懸液，以便容易核實是否漏加血清。7、IgM抗-A和抗-B與相應(yīng)紅細胞的反應(yīng)溫度以4為最強，但為了防止冷凝集現(xiàn)象的干擾，一般仍在室溫(2024)內(nèi)進行試驗，37可使反應(yīng)減弱。8、離心時間不宜過長或過短，速度不宜過快或過慢，以防假陽性或假陰性結(jié)果。用試管法進行ABO血型的正定型時不能測出亞型（如AX），需延長作用時間。9、在反定型試驗中，如果受檢者的血清或血漿與O型標(biāo)準(zhǔn)紅細胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)，則需要添加自身對照試驗。如果自身對照試驗為陽性，表明是自身冷凝集素導(dǎo)致。如果自身對照試驗為陰性，則表明被檢者血清或血漿中可能存

9、在ABO系統(tǒng)以外其它系統(tǒng)的抗體干擾，此時需做其它相關(guān)試驗加以解決上述定型問題。10、對含有較多自身冷凝集素的受檢者，在使用標(biāo)準(zhǔn)血清進行正定型時往往被誤定為AB型，遇到此種情況，需用37生理鹽水洗滌受檢者的紅細胞23次，以去除吸附在紅細胞上的冷凝集素，然后再鑒定血型。11、觀察時應(yīng)注意紅細胞呈特異性凝集、繼發(fā)性凝固以及緡錢狀排列的區(qū)別。對于可疑結(jié)果，必須更換所用的試劑，重新檢測。12、對于可能存在不完全抗原的時候，應(yīng)在各反應(yīng)中加入凝聚胺試劑，以檢驗不完全抗原的存在。13、判斷結(jié)果后應(yīng)仔細核對、記錄，避免筆誤。14、25%紅細胞懸液的配制：先用生理鹽水洗滌紅細胞3次，再根據(jù)下表進行紅細胞懸液的配制

10、。懸液濃度（%）壓積紅細胞（滴）鹽水（滴）2140(2ml)51 16 (0.8ml)臨床應(yīng)用用于檢驗人的ABO血型歸屬。血型鑒定的影響因素及解決方法準(zhǔn)確的血型鑒定是臨床安全、有效輸血的重要保證之一，但影響血型鑒定結(jié)果的因素很多。如發(fā)現(xiàn)ABO正反定型結(jié)果不一致，應(yīng)先重復(fù)做1次試驗。重復(fù)做試驗時，應(yīng)嚴格執(zhí)行操作規(guī)程，使用質(zhì)量合格的試劑，并細心觀察和解釋試驗結(jié)果，就可解決明顯的問題。對一些疑難問題必須做如下進一步研究： 1、標(biāo)本血標(biāo)本的采集錯誤、稀釋和溶血。另從受檢者采集l份新鮮血液標(biāo)本，這樣可以糾正因污染或搞錯樣本造成的不合。標(biāo)本一般要求離體后盡快實驗，最長不能超過3天，每次輸血后受血者和供血者

11、的血標(biāo)本應(yīng)在28保存7天?；颊叩乃幬锸褂糜袝r也對實驗有一定影響，當(dāng)受血者使用肝素治療時，應(yīng)使用硫酸魚精蛋白對抗使標(biāo)本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等治療，應(yīng)注意將紅細胞洗滌。受檢者紅細胞上抗原位點過少(如亞型)或抗原性減弱(見于白血病或惡性腫瘤)，以及類B或cisAB等。如疑為A抗原或B抗原減弱，則可將受檢紅細胞與抗A或抗B血清做吸收及放散試驗，以及用受檢者唾液作A、B、H血型物質(zhì)測定（只對80HAB分泌型的人有用）。如受檢者為A型血而疑為有類B抗原時，可用下列方法進行鑒別：(1) 觀察細胞與抗A及抗B的凝集強度，與抗A的反應(yīng)要比與抗B的反應(yīng)強，這種區(qū)別用玻片法作試驗更

12、為明顯；(2) 用受檢者紅細胞與自身血清作試驗，血清中的抗B不凝集自身紅細胞上的類B抗原；(3) 檢查唾液中是否有A、B物質(zhì)，如果是分泌型，可檢出A物質(zhì)而無B物質(zhì)；(4) 核對患者的診斷，類B抗原的形成與結(jié)腸癌、直腸癌、革蘭陰性桿菌感染有關(guān)。受檢者血清中蛋白紊亂(高球蛋白血癥)，或?qū)嶒灂r溫度過高，常引起紅胞呈緡錢狀排列。如試驗結(jié)果紅細胞呈緡錢狀排列，加等滲鹽水l滴?；旌停墒咕囧X現(xiàn)象消失。注意不應(yīng)先加鹽水l滴于受檢者血清中而后和紅細胞做試驗，以免使血清中抗體被稀釋。細菌污染或遺傳因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。如發(fā)現(xiàn)多凝集現(xiàn)象，應(yīng)考慮由遺傳產(chǎn)生的Cad抗原活性；被細菌酶激活

13、的T或TK受體；或產(chǎn)生機制不太明了的Tn受體所引起。多凝集紅細胞具有以下特點：(1)能被人和許多家兔的血清凝集；(2)能與大多數(shù)成年人的血清凝集，不管有無相應(yīng)的同種抗體。(3)不被臍帶血清凝集。(4)通常不與自身的血清凝集。(5)如有條件可用外源凝集素加以鑒別。 檢者血清中缺乏應(yīng)有的抗-A及或抗B抗體，如丙種球蛋白缺乏癥，老年人血清中抗體水平大幅度下降等。如果試驗結(jié)果未見凝集，應(yīng)將細胞及血清試驗至少在室溫和4放置30min，用顯微鏡檢查核實。血清中有意外抗體，如自身抗I，常引起干擾。用A1、A2、B、O紅細胞及自身紅細胞檢查受檢者血清。如果懷疑是抗I，用O型(或ABO相合的)臍血紅細胞檢查。各

14、種原因引起的紅細胞溶解，誤判為不凝集。部分溶血時，可溶性血型物質(zhì)中和了相應(yīng)的抗體。將紅細胞洗滌數(shù)次，配成25%生理鹽水細胞懸液，用抗A、抗B、抗Al，抗A十B及抗H做試驗可以得到其它有用的信息。對受檢紅細胞作直接抗球蛋白試驗，如結(jié)果呈陽性，表示紅細胞已被抗體致敏。2、試劑運輸、貯存等條件不適可導(dǎo)致試劑變質(zhì)失效，造成配血錯誤。實驗前進行試劑外觀、效價等項目質(zhì)量控制。不同抗凝劑制備的標(biāo)準(zhǔn)紅細胞質(zhì)量也不同；另外，紅細胞懸液過濃或過淡，抗原抗體比例不適當(dāng)，使反應(yīng)不明顯，易誤判為陰性反應(yīng)。應(yīng)依據(jù)要求正確配制紅細胞濃度。分型血清效價太低、親和力不強，如抗A血清效價不高，可將A亞型誤定為O型、AB型誤定為B

15、型。實驗前應(yīng)進行試劑效價等項目質(zhì)量控制。 3、冷凝集素在ABO血型鑒定和交叉配血的過程中，冷凝集素是影響ABO血型正反不符和交叉配血不合的常見原因，尤其是在冬天氣溫較低時，某些病人血清中含有冷凝集素而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。正常人血清中冷凝集素效價一般不高，且在4以下時才有活性。但由于人免疫系統(tǒng)的差異，在惡性腫瘤或病原體感染后有時冷反應(yīng)性自身抗體可異常增高，造成溶血性貧血。這種冷凝集素效價在4可高于1000，用37生理鹽水洗滌紅細胞，操作時再置于37水浴中輕輕搖動可以排除冷凝集素的干擾。 4、自身免疫性溶血性貧血 紅細胞被自身抗體強烈致敏后將干擾ABO定型，且自身抗體的存在會導(dǎo)致交叉配血不合，選擇合適

16、的試驗方法對紅細胞上結(jié)合的抗體做放散處理，確定抗體的特異性。如果抗體屬于同種抗體，則交叉配血時應(yīng)選取該抗原陰性的獻血者的血液。如果該抗體無法確定特異性，則交叉配血時要根據(jù)患者自身紅細胞與自身血清的對照反應(yīng)選取較弱反應(yīng)的獻血者血液，因為自身抗體的干擾而發(fā)生ABO正反定型不相符時，可用3745生理鹽水洗滌紅細胞三次，或者用放散后的紅細胞（放散方法需不破壞紅細胞結(jié)構(gòu)），血清定型則可用洗滌或放散后的紅細胞將血清中的自身抗體吸收后再進行。 5、弱凝集 血型試驗是抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)患者紅細胞上抗原異?；蜓逯写嬖贏BO血型以外的不規(guī)則抗體時，可能會導(dǎo)致減弱的或缺少的凝集反應(yīng)?？乖惓０ǎ簛喰?，這種亞型紅細

17、胞抗原性較弱，可以通過亞型定型試劑來具體定型。紅細胞抗原形成不足或敏感性降低，如新生兒、老年人及少數(shù)惡病質(zhì)患者。鑒定血型時要注意正反定型的結(jié)合，加用抗H和抗A，B型標(biāo)準(zhǔn)血清、A2紅細胞等檢查唾液中的血型物質(zhì)，必要時作吸收放散試驗以確定。若血清中存在不規(guī)則抗體可在反定型用O細胞加以鑒定，有些亞型因為抗原的某些位點缺失，也會產(chǎn)生相對于缺失抗原位點的抗體，這些抗體的產(chǎn)生有助于亞型的判定。 6、細菌性凝集 常見有類B凝集，A型或O型病人因大腸桿菌O86感染，從而使紅細胞上獲得類B抗原，能與抗B抗體發(fā)生凝集，表現(xiàn)為B 或AB型。其不受溫度影響，病情好轉(zhuǎn)類B凝集即消失。另外紅細胞被細菌或細菌酶污染，紅細胞

18、上的T抗原被激活，與供血者中抗T抗體發(fā)生凝集。此種凝集在4和37之間隨著溫度的升高凝集程度逐漸減弱，在37時最弱或消失。 7、混合外觀凝集現(xiàn)象 出現(xiàn)混合外觀凝集的情況時一般要核對標(biāo)本，必要時可重新抽取血樣?；颊咴诮谟羞^骨髓移植或輸血史、胎盤出血和白血病等應(yīng)在疾病恢復(fù)后再確定血型。其他原因如嵌合現(xiàn)象、A3亞型及Tn多凝集反應(yīng)等在定型時可幫助正確判斷血型。 8、不規(guī)則抗體及亞型 血型試驗是抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)患者血清中存在ABO型以外的IgM或IgG和IgM混合型不規(guī)則抗體時，必然會導(dǎo)致ABO正反定型不一致?？赏ㄟ^測定唾液中的血型物質(zhì)來鑒定ABO血型。由于受檢者紅細胞上有弱抗原，且抗原表達性特別弱，在紙片定型中很可能被錯誤定型，另外抗A/抗B/抗AB血清的效價低或Ac/Bc/Oc等其他因素的影響，正反定型不相符，也可能被錯定或無法確認，應(yīng)用試管鹽水法鏡檢顯示抗-A/抗-B/抗-AB管呈弱的混合外觀，正反定型相符，且經(jīng)吸收放散試驗進一步確定相應(yīng)的亞型。由于某些亞型紅細胞與抗A，B血清呈現(xiàn)出特異性反應(yīng)，因此同時采用抗A，B血清，而在反定型時加入O細胞可以檢出部分不規(guī)則抗體。對ABO血型正反定型不一致的標(biāo)本，正定型時加入抗-H有助于檢測紅細胞表面H抗原的量，對鑒別亞型具有重要意義，同時有助于發(fā)現(xiàn)稀有血型，如孟買型等。 9、假凝集血清在室溫和37中，使紅細