藥用微生物學(xué)綜述

1、微生物生物轉(zhuǎn)化在藥物合成中的應(yīng)用摘要：微生物在藥物的合成開發(fā)中具有十分重要的作用，除了其次級代謝產(chǎn)物成為疾病的藥物來源外，微生物的酶在藥物合成中的應(yīng)用也越來越多，微生物的酶生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)溫和、立體選擇性強(qiáng)和效率高的優(yōu)點(diǎn)，已成功地應(yīng)用于甾體藥物和手性藥物的合成中，在某些中藥的開發(fā)中也有廣闊的前景。微生物對藥物合成的貢獻(xiàn)越來越大，仍然具有更深的潛力。關(guān)鍵詞：微生物； 生物轉(zhuǎn)化； 甾體； 手性藥物 The Applications of Microbial Biotransformation in Pharmaceutical SynthesisAbstract：Microorganisms pl

2、ay a very important role in the development of synthetic drugs. In addition to their secondary metabolites as a new medicine source, the application of microbial enzymes in drug synthesis is also increasing. The microbial transformation has been successfully applied to the synthesis of the steroid d

3、rugs and chiral drugs, and has broad prospects in the development of Traditional Chinese Medicines because of the advantages of mild reaction, stereo selectivity and high efficiency. Microorganisms make a bigger and bigger contribution to drug synthesis, and still have a greater potential.Key Words:

4、 Microorganism; Transformation; Steroid; Chiral drugs微生物生物轉(zhuǎn)化是指利用生物體系，如細(xì)胞和酶等作為催化劑，實(shí)施有機(jī)合成目的的合成方法，具有傳統(tǒng)化學(xué)合成不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如選擇性好、催化效率高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等。微生物轉(zhuǎn)化提供了許多常規(guī)化學(xué)方法不能或不易完成的合成方法1?，F(xiàn)代生物轉(zhuǎn)化研究一般認(rèn)為始于巴斯德時(shí)代，但工業(yè)化生物轉(zhuǎn)化最重要的里程碑應(yīng)該是二十世紀(jì) 50 年代利用微生物對甾體化合物的結(jié)構(gòu)改造。此后，一些重要生物技術(shù)的發(fā)展導(dǎo)致了有些傳統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)工藝被由生物催化劑催化的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)所代替，目前微生物生物轉(zhuǎn)化已在復(fù)雜分子藥物（典型如

5、甾體藥物）的合成或半合成、手性藥物拆分或不對稱合成以及中藥現(xiàn)代化合成等方面有了較為成功的巨大發(fā)展，大大簡化了生產(chǎn)路線，降低了成本。微生物轉(zhuǎn)化與復(fù)雜分子藥物合成分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的藥物，如甾體藥物等，依靠傳統(tǒng)的化學(xué)工藝進(jìn)行合成，不僅合成路線復(fù)雜，一些特殊位點(diǎn)上的反應(yīng)也難以進(jìn)行，如甾體C11位羥化反應(yīng)，化學(xué)法很難進(jìn)行，而采取微生物轉(zhuǎn)化法則比較容易。1.1 甾體藥物的微生物合成甾體藥物的微生物合成是微生物轉(zhuǎn)化法在醫(yī)藥合成領(lǐng)域的一大重要成功典范，促進(jìn)了甾體合成藥物的發(fā)展。目前對甾體激素類藥物的合成比較重要的反應(yīng)有氧化反應(yīng)（主要為甾體骨架上的羥基化反應(yīng)）、還原反應(yīng)和水解反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)室主要研究2個(gè)甾體藥物的羥

6、化反應(yīng)：去氫表雄酮的C7和C15位羥基化和坎利酮的C15和C11位羥基化反應(yīng)1。表1為常見催化甾體羥基化的微生物。1.1.1 去氫表雄酮的雙羥化反應(yīng)Peart2等人利用尖孢鐮孢變種病菌UAMH 9013對去氫表雄酮等11個(gè)底物進(jìn)行培養(yǎng)，通過雄甾烷-3，17 -二酮、雄甾烷-4,6-二烯-3,17-二酮和3,5-cycloandrost-6-en-17-one對結(jié)果進(jìn)行探討，證明了可能存在的C7和C15羥化酶。Hu, Haifeng3等人通過利用炭疽菌（Colletotrichum lini (AS 3.4486)）對去氫表雄酮底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，合成了7, 15-二羥基雄烯醇酮。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該

7、方法的產(chǎn)率約為90%，去氫表雄酮的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到75%。1.1.2 坎利酮的生物轉(zhuǎn)化通過對坎利酮進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾可得到臨床治療心血管疾病的藥物Eplerenone，其中的C11羥化反應(yīng)可經(jīng)過微生物轉(zhuǎn)化來完成。為了獲得其新的結(jié)構(gòu)衍生物，人們通過赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）羥化酶轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對坎利酮進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究，發(fā)現(xiàn)了不同的酶系轉(zhuǎn)化形成多個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，包括15-羥基坎利酮、11-羥基坎利酮和11-羥基-6,7-二氫坎利酮等化合物4。Bie, Songtao5等人利用赭曲霉菌（Aspergillus ochraceus）對底物坎利酮進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，使得坎利酮轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵中間體11-羥基

8、坎利酮，最終獲得了很高的轉(zhuǎn)化率。1.1.3 甾醇側(cè)鏈的降解6微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體雄-4-烯-3, 17-二酮 ( 4-AD) 和雄甾-1, 4-二烯-3, 17-二酮 ( ADD) 對于我國制藥行業(yè) 具有重要意義。對 4-AD和 ADD的活性部位進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造, 可以合成出多種甾體藥物。微生物對甾醇作用產(chǎn)生 4-AD 和 ADD主要包括側(cè)鏈的降解, C-3位羥基氧化成酮基以及 C-5, 6位雙鍵的氫化。其中, 起決定作用的是側(cè)鏈的降解。甾醇側(cè)鏈的降解開始于 C-27位的羥化, 然后經(jīng)過氧化, 最終截?cái)嘤?C-17位。選擇性控制微生物降解側(cè)鏈的途徑主要有以下兩種

9、: 加入酶抑制劑以及利用誘變技術(shù)。諾卡氏菌、分枝桿菌、節(jié)桿菌和假單胞桿菌等微生物都能將甾醇類化合物作為碳源利用, 而使甾醇降解。其中分枝桿菌應(yīng)用最為廣泛。1.2 其余復(fù)雜藥物的合成除甾體藥物外，一些分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，難以通過化學(xué)法全合成的中藥，如青蒿素，也可通過微生物轉(zhuǎn)化來合成。青蒿素是我國從中藥中自主開發(fā)的抗瘧藥物，許多科研工作者都試圖通過結(jié)構(gòu)改造，以提高青蒿素的資源利用率。迄今已制備了數(shù)百個(gè)青蒿素的衍生物，并篩選出雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿虎酯及青蒿酯鈉等幾個(gè)高效抗瘧衍生物，但是由于青蒿素的有效活性基團(tuán)過氧橋的不穩(wěn)定性，使得對青蒿素結(jié)構(gòu)改造無法在酮基以外的部位進(jìn)行，目前可用的化學(xué)改造

10、方法都停留在對酮基的還原及對羥基的取代反應(yīng)上。1 Chris7等人依次利用改造篩選過的高產(chǎn)大腸桿菌（Escherichia coli，25g/L）和酵母（Saccharomyces cerevisiae，40g/L）發(fā)酵來半合成青蒿素，通過大腸桿菌合成中間體紫穗槐二烯，然后轉(zhuǎn)移到酵母中發(fā)酵，最后進(jìn)行簡單地化學(xué)修飾，得到抗瘧疾藥青蒿素。下圖為主要合成流程。C. J. Paddon8等人利用基因修飾的酵母菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)青蒿素，得到高水平產(chǎn)率的產(chǎn)物，為青蒿素的工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)提供了新的途徑。微生物轉(zhuǎn)化與手性藥物合成在自然狀態(tài)下, 手性藥物的兩種形態(tài)雖然化學(xué)組成一樣, 但它們各自的毒性、生理活性和藥理作

11、用往往存在著差別。合成手性藥物的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)大致可分為兩類：一類是把外消旋體拆分為兩個(gè)光活性的對映體；另一類是從外消旋或前手性的前體出發(fā)，通過催化反應(yīng)得到不對稱的光活性產(chǎn)物9。通過微生物酶催化不對稱合成反應(yīng)或拆分外消旋體合成醫(yī)藥手性中間體具有獨(dú)特的優(yōu)勢。常用的微生物酶主要為脂肪酶，典型的包括細(xì)菌脂肪酶，如來自綠膿桿菌(P. aeruginosa)、熒光假單胞桿菌(P. fluorescens)、假單胞菌(Pseudomonas)、洋蔥伯克氏菌(B. cepacia)、染色粘性菌(C. viscosum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等以及來自真菌的南極假絲酵母(C.ant

12、arctica B)和皺褶假絲酵母(C. rugosa)的脂肪酶，在這方面已有大量的報(bào)道10。2.1 手性藥物的外消旋體拆分通過微生物酶選擇性拆分（Enantioselective resolution）外消旋體得到手性藥物，就是利用生物酶或含有活性酶的微生物菌體作為生物催化劑，將其中一個(gè)對映體進(jìn)行選擇性轉(zhuǎn)化，達(dá)到外消旋體拆分的目的。微生物酶選擇性拆分反應(yīng)具有高度的立體專一性，副反應(yīng)小，產(chǎn)率高，產(chǎn)品分離提純簡單，產(chǎn)物光學(xué)純度很高，而且反應(yīng)過程大多在溫和的條件下進(jìn)行，可以彌補(bǔ)化學(xué)拆分法拆分消旋體的許多不足11。Yousefi12等人利用固定在辛基瓊脂糖凝膠上的皺褶念珠菌脂肪酶（CRL）和米根霉脂

13、肪酶（ROL）對水解后外消旋的布洛芬酯進(jìn)行手性拆分，可明顯地分離出S-（+）-布洛芬（ee值95%），也證明了微生物酶手性拆分的可行性。酶法拆分外消旋體在實(shí)驗(yàn)室制備和工業(yè)生產(chǎn)中都已取得長足的進(jìn)步，但是仍然有其局限性。比如菌種篩選困難、酶制劑不易保存、產(chǎn)物后處理工作量大，以及通常只能得到一種對映體等缺點(diǎn)。盡管如此，利用微生物進(jìn)行手性藥物的合成及對映體的拆分仍是當(dāng)前研究熱點(diǎn)13。2.2 手性藥物的不對稱催化合成微生物酶催化不對稱合成（Asymmetric synthesis）是指一個(gè)有機(jī)反應(yīng)，其中底物分子整體中的非手性單元由反應(yīng)劑以不等量地生成立體異構(gòu)產(chǎn)物的途徑轉(zhuǎn)化為手性單元。應(yīng)用生物催化轉(zhuǎn)化技術(shù)

14、進(jìn)行不對稱合成與化學(xué)合成法相比較具有的優(yōu)越性9有：轉(zhuǎn)化底物某一基團(tuán)的專一性強(qiáng)，即對不需要轉(zhuǎn)化的基團(tuán)無需保護(hù)；通過對用于某一轉(zhuǎn)化的微生物進(jìn)行菌種選育和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，可以得到極高的轉(zhuǎn)化率；生物催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)條件溫和對環(huán)境的污染很小。趙秋堂14比較了5種不同的R-沙美特羅的合成方法，其中以深紅酵母（Rhodotorula rubra）為催化劑不對稱合成R-構(gòu)型的環(huán)氧化合物，進(jìn)一步得到目標(biāo)分子。它利用了酶促反應(yīng)的高立體選擇性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性將化學(xué)合成的外消旋體、前體或潛手性化合物轉(zhuǎn)化為單一光學(xué)活性產(chǎn)物。但該法對化學(xué)和熱不穩(wěn)定、與有機(jī)溶劑不相溶等因素造成其難以推廣使用。其合成路線如下：近年來人

15、們越來越多地篩選得到可降解有機(jī)鹵化物的微生物，并從中分離得到鹵醇脫鹵酶，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)鹵醇脫鹵酶不但可以催化碳鹵鍵的斷裂進(jìn)行脫鹵反應(yīng)，而且可以高選擇性地催化接受除鹵離子外的一系列非自然親核試劑，如N3、NO2、CN等所介導(dǎo)的環(huán)氧化物開環(huán)反應(yīng)，用以生成一系列光學(xué)純的-取代醇。因此，鹵醇脫鹵酶在手性藥物合成方面的應(yīng)用備受矚目15。微生物是我們重要的醫(yī)藥資源之一，目前微生物已在醫(yī)藥合成領(lǐng)域取得了不錯的成就，在一些復(fù)雜藥物或手性藥物的合成上具有巨大的優(yōu)勢與特點(diǎn)，可以大大地簡化生產(chǎn)流程，降低生產(chǎn)成本，但是，微生物轉(zhuǎn)化在醫(yī)藥合成中也存在副產(chǎn)物分離復(fù)雜、對某些反應(yīng)條件不適應(yīng)等問題。然而，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步

16、發(fā)展，我們對微生物的進(jìn)一步認(rèn)識，必定會促進(jìn)藥物研究的快速發(fā)展。References: 1.胡海峰與朱寶泉, 微生物在藥物開發(fā)中的應(yīng)用. 中國天然藥物, 2006(03): 第168-171頁. 2.Peart, P.C., et al., Hydroxylation of steroids by Fusarium oxysporum, Exophiala jeanselmei and Ceratocystis paradoxa. Steroids, 2011. 76(12): p. 1317-1330. 3.Hu, H., R. Tao and Q. Zhang, Production of

17、7,15-dihydroxyandrostenolone by Colletotrichum lini and solvent extraction. 2008, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Peop. Rep. China . p. 10pp. 4.胡海峰, 李曉敦與朱寶泉, 微生物甾體羥化技術(shù)及其應(yīng)用. 國外醫(yī)藥(抗生素分冊), 2006(02): 第76-78+95頁. 5.Bie, S., J. Wang and F. Lu, High-efficiency preparation of 11-hydroxy canre

18、none from canrenone with Aspergillus ochraceus. 2013, Tianjin University of Science & Technology, Peop. Rep. China . p. 5pp. 6.張?jiān)Ｇ渑c王東青, 植物甾醇微生物轉(zhuǎn)化制備甾體藥物中間體的研究進(jìn)展. 微生物學(xué)通報(bào), 2006(02): 第142-146頁. 7.Paddon, C.J. and J.D. Keasling, Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development. 2014. 12(5): p. 355-367. 8.Paddon, C.J., et al., High-level semi-synthetic production of the pote