間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨的實驗研究

1、間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨的實驗研究                作者：李章華，彭昊，廖文，張玉富，趙強，王常勇 【關(guān)鍵詞】  組織工程化骨摘  要：目的探討間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的成骨能力。方法從羊髂嵴處抽取1015 ml骨髓組織，用Percoll分離液按梯度離心法分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)、增殖后種植在多孔磷酸三鈣上，構(gòu)建組織工程化骨，植入8只羊的左后肢跖骨缺損區(qū)（長21 mm）作為實驗組；單純植入多孔磷酸三鈣陶瓷材料的8只羊作為對

2、照組；分別在術(shù)后6、12、24周處死動物行放射學(xué)、組織學(xué)和生物力學(xué)檢測。結(jié)果放射學(xué)和組織學(xué)檢測，術(shù)后6周實驗組即可見有新骨生成，對照組則無明顯新骨生成；骨缺損部位新生骨樣組織、編織骨和板狀骨出現(xiàn)的時間實驗組也都較對照組早，并且不經(jīng)軟骨介導(dǎo)即能直接成骨，而對照組從兩端以“爬行替代”方式成骨。術(shù)后24周，放射學(xué)和生物力學(xué)檢測顯示實驗組骨缺損幾乎完全修復(fù)，對照組只有部分愈合。結(jié)論間充質(zhì)干細(xì)胞不僅在體外具有良好的增殖能力，回植入體內(nèi)后仍然具有良好的成骨能力，不需經(jīng)過軟骨過程就能直接形成新骨，顯示了間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨組織工程種子細(xì)胞良好的應(yīng)用前景。    關(guān)鍵詞：組織工程化

3、骨；  骨缺損；  新生骨；  間充質(zhì)干細(xì)胞    Abstract：ObjectiveTo investigate the osteogenic ability in vivo of mesenchymal stem cells（MSCs）MethodTenfifteen ml bone marrow aspirates were harvested from the iliac crest of sheep and enriched for MSCs by density gradient centrifugation over

4、a Percoll cushion（1073 g/ml）After cultured and proliferated,the tissueengineered bones were constructed with these cells and seeded onto porous 13tricalcium phosphate ceramics（13TCP）Then,the constructs were implanted into left metatarsus defect（21 mm in length）of 8 sheep as an experimental groupPoro

5、us TCP composed with bone marrow was implanted into defects of same size and position in 8 sheep as a control groupSheep were sacrificed in the 6th,12th,and 24th week postoperatively,and the implanted samples were examined by radiograph,histology,and biomechanical analysisResultNew bone tissue was o

6、bserved either radiographically or histologically at the defect area of experimental group as early as the 6th week postoperatively;but was not observed in the control groupBecause of the new bone formed in a direct manner without progression through a cartilaginous process intermediately,osteoid ti

7、ssue,woven bone and lamellar bone,occurred earlier in the experimental group than in the control group,in which the bone defects were repaired in a “creep substitution” mannerAt the 24th week,radiographs and biomechanical tests revealed an almost complete repair of the defect in experimental group,b

8、ut only a partial repair in the control groupConclusionMSCs have good reproductive activity not only in vitro,but also in vivoThe new bone formed in a direct manner without progression through a cartilaginous process intermediately when MSCs were transplanted in vivoThe results demonstrated that MSC

9、s was an excellent seed cells for bone tissue engineering    Key words：Tissueengineered bone;  Bone defect;  Regenerated new bone;  Mesenchymal stem cells    迄今為止，大節(jié)段的骨缺損修復(fù)仍然是骨科醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。現(xiàn)有的自、異體骨移植法都有一定的局限性，因此有必要尋找一種新的修復(fù)骨缺損的方法。多孔磷酸三鈣陶瓷具有良好的生物降解性、生物相容性，而且無

10、毒性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并適合細(xì)胞生長，因而是骨組織工程理想的支架材料1。然而，為了增加材料的生物活性還需要增加一些刺激骨生長的物質(zhì)，包括骨髓、干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨形態(tài)蛋白等。骨髓細(xì)胞中包括有造血干細(xì)胞和具有成骨潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，這種干細(xì)胞具有多向分化潛能，故而能分化為骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪和造血基質(zhì)等多種組織。本研究的目的就是探討間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的成骨能力。    1  材料與方法    11  材  料    111  實驗用品   

11、 LDMEM（Gibco，BRL，USA），胎牛血清（FCS，Gibco，BRL，USA），其它化學(xué)用品均購自Sigma公司。多孔磷酸三鈣陶瓷由法國地中海大學(xué)盧建熙博士提供，呈圓柱狀，長21 mm，直徑10 mm，孔隙率70，孔徑（450±50）m，連接徑（150±50）m，射線消毒，劑量25KGY。    112  動  物    成年綿羊16只，年齡（2±05）歲，體重（35±10）kg。術(shù)前予以標(biāo)準(zhǔn)的動物飼料和流動水。將動物隨機均分成兩組：第1組，磷酸三鈣陶瓷植入組;第

12、2組，磷酸三鈣陶瓷與自體間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合植入組。    12  方  法    121  分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞    在全麻、無菌條件下，用18號穿刺針從羊髂嵴處抽取1015 ml新鮮骨髓，肝素抗凝（200 UmL）。為了防止穿刺時骨髓被血液稀釋，應(yīng)分別在髂嵴上不同的3個點進行穿刺。按照前述的方法分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞2。首先把骨髓與含10 FCS的LDMEM培養(yǎng)基混合，培養(yǎng)基中含青、鏈霉素（100 UmL），細(xì)胞計數(shù)后用Percoll分離液（1073 gmL）梯度分離間充

13、質(zhì)干細(xì)胞。收集界面層細(xì)胞，洗滌后種植在75 cm×75 cm的培養(yǎng)瓶中，每瓶含細(xì)胞1×106個。然后將它培養(yǎng)在37 ，5 CO2和100濕度的孵箱中。第3 d換液，去除不貼壁的細(xì)胞，以后每周更換培養(yǎng)液2次。在第9、10或11 d時以8×103個mL的密度傳代，直至培養(yǎng)的第16 d。    122  構(gòu)建多孔磷酸三鈣陶瓷與細(xì)胞復(fù)合體    在培養(yǎng)的第16 d用胰酶和乙二胺四乙酸消化細(xì)胞，收集、重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108個mL（骨形成所需的標(biāo)準(zhǔn)起始細(xì)胞濃度），將細(xì)胞懸液均勻地滴加在磷酸

14、三鈣陶瓷材料上即成為陶瓷-細(xì)胞復(fù)合體。復(fù)合體先在37 、5 CO2和100濕度的孵箱中干孵育6 h，然后再加入含15 FCS的LDMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。    123  手術(shù)過程    手術(shù)在全麻、無菌條件下進行，手術(shù)過程與文獻(xiàn)報道相同3。術(shù)區(qū)脫毛、消毒，外側(cè)正中切口切開皮膚和軟組織，鈍性剝離骨膜，用線鋸在跖骨中段鋸取21 mm長的跖骨干缺損，包括附著在骨干上的骨膜。無菌生理鹽水沖洗骨缺損區(qū)，加壓鋼板固定，按實驗要求植入材料，逐層縫合。術(shù)后頭2 d動物放置在空調(diào)室內(nèi)，禁止負(fù)重，2 d后開放性圈養(yǎng)，允許其在疼痛可忍受的

15、程度下活動，羊飼料和流動水飼養(yǎng)。術(shù)后6、12、24周處死動物取材。    124  熒光標(biāo)記    分別在處死前15 d和前7 d連續(xù)皮下注射四環(huán)素3 d，劑量50mgkg。    125  X線片分析    術(shù)后即刻攝片，以后分別在第6、12、24周攝片。所有的X線片均由3個人單獨進行放射學(xué)評價。主要根據(jù)X線片上骨與植入物界面的骨連接情況、植入物表面的骨痂生長情況和骨橋的生長情況進行評估。骨缺損區(qū)每面骨連接形成得1分，最低分0分（在缺損區(qū)的任一面上均無骨

16、連接），最高分4分（缺損區(qū)的前、后、側(cè)面及中央均形成骨連接）。記錄骨痂達(dá)到最厚時的時間，并計算出6、12和24周時骨痂的平均厚度。     126  生物力學(xué)測試    測試過程按照標(biāo)準(zhǔn)程序進行4。收集標(biāo)本后：立即去除軟組織即可進行生物力學(xué)的測試。858Mini Bionix 生物力學(xué)實驗機（MTS，USA）上行垂直壓縮試驗，負(fù)荷10 N，速度10 mmmin。通過圖表記錄器可以獲得一個壓應(yīng)變的曲線圖，然后計算出每個標(biāo)本的壓縮應(yīng)力及其彈性模量，再計算出平均的壓縮應(yīng)力和彈性模量。對側(cè)正常的跖骨作為對照組。  

17、;  127  組織學(xué)及組織形態(tài)學(xué)分析    分別在術(shù)后6、12和24周處死動物。將每個標(biāo)本的中間部分（包含骨與植入物相連的2個界面）切下來固定在10的甲醛溶液中。脫鈣切片標(biāo)本置于10的甲酸中脫鈣，梯度酒精逐級脫水、清洗、石蠟包埋，Masson三色染色和天狼星紅染色（需在偏振光顯微鏡下觀察）。不脫鈣切片標(biāo)本在4的中性多聚甲醛液中固定2周后，用流動水沖洗12 h，再用梯度丙酮逐級脫水，-20 下聚甲基丙烯酸甲酯包埋。等聚甲基丙烯酸甲酯凝固后在低溫下切片，切片厚200300 m，用膠水將切片粘在一個塑料支架上，手工將它磨至（50±51）m

18、，直接在熒光顯微鏡下觀察。然后用超薄切片機把剩余的標(biāo)本切片，切片厚15 m，直接在光學(xué)顯微鏡下觀察。    128  統(tǒng)計學(xué)分析    所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析。P005代表差異有顯著性。SAS612統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。    2  結(jié)  果    21  放射學(xué)分析    術(shù)后即刻攝片能清楚地分辨出宿主骨與植入物，并看到它們之間的透亮帶。隨著新骨的形成，陶瓷材料變

19、得越來越小，并且透光性增加。術(shù)后6周，第2組磷酸三鈣陶瓷周圍可見有斑塊狀不透光區(qū)。12周后，骨缺損區(qū)由不透光的骨痂包繞。24周后，所有動物骨缺損區(qū)放射學(xué)檢測顯示為完全性骨連接，磷酸三鈣陶瓷顆粒幾乎看不見（圖1）。相比之下，第1組動物的骨愈合速度明顯慢于第2組動物，24周時，多為不完全骨愈合（圖2）。    第2組動物，術(shù)后12周時骨痂最厚，隨后骨痂厚度反而減小。但第1組動物，其骨痂厚度則不斷增加，24周時才達(dá)到最大值。經(jīng)測量每只羊骨缺損區(qū)骨痂的最大厚度及其平均值，可以看到，自體間充質(zhì)干細(xì)胞植入對新骨生成具有明顯的促進作用，其差別具有顯著性（表1）。表1 

20、 放射學(xué)與生物力學(xué)評價22  生物力學(xué)測試    標(biāo)本的抗壓縮強度隨時間逐步增加。24周后，第2組標(biāo)本抗壓縮強度接近正常骨的抗壓縮強度。兩組標(biāo)本3個時間點間比較均具有顯著性差異（P005）（表1）。第2組標(biāo)本無論是抗壓縮強度還是彈性模量均明顯大于第1組動物標(biāo)本，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P005）（表1）。    23  組織學(xué)評估    231  光學(xué)顯微鏡下觀察    2個實驗組新骨生成情況在組織學(xué)上存在差異性。復(fù)合體植入骨缺損區(qū)12周后，第2組磷酸

21、三鈣材料周圍新骨生成較第1組多。大量的新生骨組織沿著陶瓷材料的孔隙及其連接徑從材料的四周向中央長入，新生骨與陶瓷的兩端緊密相連，就如X線片所見的一樣，一個連續(xù)性的骨橋從骨斷端長入陶瓷材料的孔隙中。在橫切面和縱切面上都可以看到新生的編織骨和哈佛氏系統(tǒng)存在。新生骨與陶瓷材料的孔隙間很少有間隙和纖維組織存在，但偶爾有成骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞出現(xiàn)。在磷酸三鈣陶瓷的中央?yún)^(qū)域還可以看到塊狀的新生骨互相連接，將磷酸三鈣陶瓷分成數(shù)不清的小島狀，但陶瓷材料仍然存在。而第1組動物，只是在接近宿主骨端的陶瓷內(nèi)有一定程度的骨生成，陶瓷的中央仍然空缺或由纖維組織填充。24周時，第2組動物植入材料的中央和表面都可見成熟的骨細(xì)胞

22、和再生的板狀骨，宿主骨和新生骨分界清晰（因為它們的骨紋理不同）。尤其令人驚訝的是，24周時該組動物標(biāo)本切片極少能發(fā)現(xiàn)磷酸三鈣陶瓷的痕跡（圖3、5）。第1組中，植入材料中只是偶爾有成熟的骨細(xì)胞出現(xiàn)，新生的編織骨，仍占主導(dǎo)地位，特別是在植入材料的中段。另外，還可見有少量的未吸收的陶瓷顆粒（圖4、6）。    232  偏振光顯微鏡下觀察    偏振光顯微鏡下，型膠原表現(xiàn)為黃色、橙紅色或紅色的粗纖維，并且其顏色隨纖維的直徑大小變化，纖維越粗大，顏色越清晰；型膠原表現(xiàn)為細(xì)小的綠色纖維；型膠原顯色微弱。第2組動物，術(shù)后6周骨折區(qū)主要由

23、型膠原纖維占據(jù)；術(shù)后12周，型膠原纖維增加明顯，但呈無序狀排列；隨著時間的增加，型膠原增多、增粗，并呈螺旋狀排列；24周時，粗大的型膠原纖維占據(jù)了全部骨缺損區(qū)，排列更加緊密、有序。無論是橫切片還是縱切片，細(xì)小的型膠原纖維都已看不見（圖7）。第1組動物，術(shù)后12周骨缺損區(qū)以型膠原纖維為主，雖然型膠原纖維也有增加，偶爾還有型膠原纖維出現(xiàn)；但直到術(shù)后24周，型膠原纖維仍占據(jù)了骨缺損區(qū)的部分區(qū)域（圖8）。    233  熒光顯微鏡下觀察    四環(huán)素鹽酸鹽作為新生骨的特異性的標(biāo)記物，能選擇性地與鈣鹽結(jié)合，并沉積在新生的骨組織中。在

24、熒光顯微鏡下，標(biāo)記有四環(huán)素鹽酸鹽的新生骨組織發(fā)出明亮的金黃色熒光，每次標(biāo)記表現(xiàn)為一條明亮的金黃色熒光帶，兩條熒光帶間的空隙代表兩次標(biāo)記間新生的骨組織。實驗結(jié)果顯示，第2組熒光帶亮度（圖9）及其帶間寬度都強于第1組（圖10）。    3  討  論    骨缺損修復(fù)的最大障礙就在于缺乏生成新骨所需的足夠的骨誘導(dǎo)因子。絕大部分的修復(fù)反應(yīng)都需要骨髓中成骨祖細(xì)胞參與，而骨缺損區(qū)往往缺乏成骨祖細(xì)胞和成骨細(xì)胞，因此常常修復(fù)能力不足導(dǎo)致骨折不愈合。    常用的骨移植方式包括自體骨移植、異體骨移植和

25、人工合成骨移植。異體骨來源充足但有些患者無法接受，而且療效也欠佳。自體骨移植對患者來說來源有限且存在供區(qū)感染等風(fēng)險。相比之下，組織工程化骨只需要少量的自體細(xì)胞就能制造出大塊骨組織5，而且還避免了上述的問題。    骨髓細(xì)胞中包括有造血干細(xì)胞和具有成骨能力的干細(xì)胞。100多年前就已知自體骨髓移植具有成骨潛能并成功地用其進行動物和人體骨缺損的修復(fù)實驗。Goujon在1896年首次發(fā)現(xiàn)自體骨髓移植能生成新骨。Burwell及其他一些學(xué)者則用自體骨髓與自體骨、異體骨和陶瓷復(fù)合修復(fù)牙槽和骨缺損6、7。Connolly和Shindell也曾成功地進行自體骨髓注射治療脛骨骨不連

26、。但由于骨髓不能形成必要的機械連接，因而較少用其進行骨缺損填充再造或原發(fā)性或惡性骨腫瘤切除后重建。另外，由于難以在骨折區(qū)長期保留骨髓，臨床單獨應(yīng)用骨髓治療的成功率也不肯定。本研究中，第1組動物實驗終末21 mm骨缺損仍未完全修復(fù)，進一步證實大節(jié)段骨缺損的修復(fù)需要大量有成骨潛能的祖細(xì)胞。因此，在臨床運用骨髓細(xì)胞進行骨重建前應(yīng)該增加其具有成骨潛能的祖細(xì)胞。    雖然一些學(xué)者認(rèn)為骨髓細(xì)胞本身就具有促進新骨形成的作用，但富集骨髓細(xì)胞中最有活力的成分?D?D間充質(zhì)干細(xì)胞才是最重要的。已有學(xué)者嘗試過在鼠、兔、狗等動物體內(nèi)用間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨移植物來修復(fù)骨缺損8。通過比較新鮮

27、骨髓細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力，結(jié)果證實種植有間充質(zhì)干細(xì)胞的陶瓷能促進新骨更快、更廣泛形成。究其原因為間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)擴增后數(shù)量巨增，成骨能力增強。附著在載體上的干細(xì)胞能在整個陶瓷上快捷、均勻地生成新骨。這種增加原始植入祖細(xì)胞的方法正是組織修復(fù)或再生所必需的。本實驗最大的優(yōu)點也正是增加了局部祖細(xì)胞的數(shù)量，使其達(dá)到組織修復(fù)或重建所必需的細(xì)胞數(shù)量，這對臨床中許多骨髓源性成骨祖細(xì)胞減少的情況特別重要，其中包括年齡的增加、骨質(zhì)疏松和其它的代謝性疾患3。由于細(xì)胞整體數(shù)量減少使得細(xì)胞庫中可用于組織修復(fù)的細(xì)胞數(shù)量減少，而且還可能讓這些患者處于損害性治療狀態(tài)（即為了修復(fù)組織而抽取患者一定量的祖細(xì)胞后對患者

28、產(chǎn)生的損害）。而從患者體內(nèi)抽取間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)擴增后再回植到特定的部位，既可以增加骨的生成，又克服了組織再生能力的自然性減弱。    本實驗的結(jié)果說明，間充質(zhì)干細(xì)胞不僅在體外具有良好的增殖能力，回植入體內(nèi)后仍然具有良好的成骨能力，不需經(jīng)過軟骨過程就能直接形成新骨，并且新骨生長均勻，與宿主骨融合良好，顯示了間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨組織工程種子細(xì)胞良好的應(yīng)用前景。    （本文附圖見加頁1）    參考文獻(xiàn)：    1  Ohsawa K,Neo M,Matsuoka H,e

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