苦參提取物對紅細胞形貌影響及相關(guān)機理研究

1、苦參提取物對紅細胞形貌影響及相關(guān)機理研究         作者：張曉宇，宋麗晶， 劉威， 何曉紅 【摘要】 目的應(yīng)用原子力顯微鏡（AFM）觀察苦參提取物（RSF）在低于臨界溶血濃度時對紅細胞表面形貌的影響，并探討其相關(guān)機理。方法紅細胞懸液與 0.5，2 g·L-1 劑量 RSF 作用后，應(yīng)用 AFM 觀察紅細胞形貌，測定細胞內(nèi) Ca2+ 濃度              

2、;                 作者：張曉宇，宋麗晶， 劉威， 何曉紅 【摘要】  目的應(yīng)用原子力顯微鏡（AFM）觀察苦參提取物（RSF）在低于臨界溶血濃度時對紅細胞表面形貌的影響，并探討其相關(guān)機理。方法紅細胞懸液與 0.5，2 g·L-1 劑量 RSF 作用后，應(yīng)用 AFM 觀察紅細胞形貌，測定細胞內(nèi) Ca2+ 濃度及膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性。結(jié)果AFM 形貌圖顯示 RSF 作用使紅

3、細胞凹陷加深；超微結(jié)構(gòu)觀察顯示 RSF 引起紅細胞膜表面凹凸增強及顆粒聚集；同時，紅細胞內(nèi) Ca2+ 濃度升高，Ca2+-Mg2+-ATPase 活性降低。結(jié)論RSF 中苦參堿類化合物與細胞膜中磷脂作用引起膜透性改變及膜表面蛋白質(zhì)聚集，改變紅細胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)，引起紅細胞表面形貌的改變，該變化與胞內(nèi) Ca2+ 濃度升高及膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性降低相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  AFM； 紅細胞； 苦參提取物； 鈣離子濃度； Ca2+-Mg2+-ATPase隨著中藥研究的深入，現(xiàn)代儀器及技術(shù)逐步應(yīng)用到中藥研究領(lǐng)域，拓展了中藥基礎(chǔ)研究的范圍，加深了中藥藥理作用機理的探討。近年來，一

4、些生物學(xué)家把利用原子力顯微鏡（AFM）對生物大分子直接觀察的技術(shù)引入中藥研究領(lǐng)域，與掃描電鏡相比, AFM 無需復(fù)雜制片過程及嚴(yán)格的真空觀察條件，具有納米水平分辨率，能夠?qū)崿F(xiàn)對活細胞表面超精細結(jié)構(gòu)三維數(shù)據(jù)分析，這些優(yōu)點使 AFM 成為研究物質(zhì)表面形貌的重要儀器。特別在探討中藥提取物等外源性物質(zhì)對紅細胞膜結(jié)構(gòu)性能影響方面，AFM 觀測成為一種精細而直觀的觀察手段15。    苦參Radix Sophorae Flavescentis為藥用豆科植物苦參的干燥根，主要化學(xué)成分及藥理活性成分為生物堿類和黃酮類6。其藥理活性以抗炎抑菌、抗病毒、抗腫瘤為主，臨床上廣泛用于治療

5、慢性肝炎、肝損傷、潰瘍、心率失常、黃疸、癰腫、發(fā)熱等病癥，其生物堿類提取物也用于殺蟲劑7,8?？鄥⑻崛∥锏乃幚碜饔眉坝行С煞痔崛∫呀?jīng)有了較為深入的研究，但該提取物對紅細胞表面形貌的影響、量效關(guān)系及相關(guān)機理還有待于進一步深入探索。本文應(yīng)用 AFM 觀察苦參提取物（RSF）在低于臨界溶血濃度下作用引起紅細胞形貌變化，并對 RSF 引起紅細胞內(nèi)的游離鈣濃度變化及對 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性的影響進行了較為深入的探討。1  儀器與材料1.1  儀器BerMad 2000 原子力顯微鏡（西班牙），JASCO V-550 UV-vis 分光光度計（日本） JASCO FP

6、 6500型熒光分光光度計（日本）。1.2  試藥新鮮人抗凝血由長春市中心血站提供，肝素購于華美公司，鈣熒光探針Flou-3-AM為美國分子探針公司產(chǎn)品，DMSO為美國sigma 產(chǎn)品，Ca2+-Mg2+-ATPase 測試試劑盒購于南京建成生物工程公司，苦參水提取物（RSF）由吉林省中醫(yī)中藥科學(xué)院中藥研究所提供。2  方法2.1  試劑配制及樣品處理RSF用PBE緩沖液 (Na2HPO4/NaH2PO4, 10 mmol·L-1, EDTA 1 mmol·L-1, pH=7.4) 溶解至終濃度10 g·L-1，超聲處理30 min，

7、16000 r/min 離心，上清液用于實驗。Fluo-3-AM溶于DMSO配成濃度為1 g·L-1儲備液，-20保存，使用濃度為5 mol·L-1。平衡鹽溶液HBS：NaCl, 123 mmol·L-1；CaCl2, 1 mmol·L-1 KCl, 5 mmol·L-1；MgCl2, 1 mmol·L-1；Glucose, 10 mmol·L-1；Hepes, 25 mmol·L-1, pH 7.4。無鈣平衡鹽溶液：NaCl, 125 mmol·L-1；KCl, 5 mmol·L-1； MgC

8、l2, 1 mmol·L-1；Glucose, 10 mmol·L-1；Hepes, 25 mmol·L-1, pH 7.4。紅細胞懸液： 取抗凝血，離心收集紅細胞，用 HBS 緩沖液清洗 2 次，2 000 r/min 離心 5 min，棄上清液，沉積的紅細胞用 HBS 稀釋至 24 倍體積，4 保存，用前洗滌，以 HBS 緩沖液配制成 4% (VV) 的紅細胞懸液。2.2  RSF對紅細胞溶血率的測定取紅細胞懸液，按等體積加入已處理RSF至終濃度為5，10，15，20 g·L-1，參比采用同體積HBS緩沖液代替紅細胞懸液。37 溫育2 h，

9、期間保持混合充分，離心，測定上清液540 nm處吸光度A。完全溶血紅細胞懸液按文獻9方法制備，以完全溶血吸光度值為A100%，未加藥物樣品吸光度值為A0，相對溶血率大于 5 % 為溶血，紅細胞相對溶血率計算公式如下：相對溶血率 = (A-A0) / (A100%-A0) ×100%。2.3  AFM 樣品制備及測定取紅細胞懸液，根據(jù)溶血反應(yīng)實驗結(jié)果選擇RSF終濃度2，0.5，0.1 g·L-1為作用濃度，于37 共溫育0.5 h，溫育期間保持混合充分。離心，棄上清，用無鈣HBS 緩沖液洗滌紅細胞2次，并重懸于無鈣HBS 緩沖液中，移取 5 l懸液滴于干凈蓋玻片表面

10、，滴加 2.5 %(VV) 戊二醛溶液5 l固定 5 min。多余溶液用濾紙從玻片邊緣小心吸去，去離子水洗滌 3 次，空氣中自然風(fēng)干，應(yīng)用 AFM 對樣品進行掃描成像。實驗采用 180 m 掃描器，力常數(shù)為 42 N·m-1，頻率 250 300 kHz，OMCL-AC160TS-W 硅探針，輕敲模式 (tapping mode)；用儀器自帶軟件采集和處理圖像數(shù)據(jù)，所有圖像只經(jīng)過平滑處理。2.4  紅細胞內(nèi)鈣離子濃度測定紅細胞與 RSF 作用方式同“2.3”項收集細胞，重懸于含5 mol·L-1 Fluo-3-AM 的無鈣 HBS 液中，37 避光孵育 45 mi

11、n，用無鈣 HBS 液洗滌2次，除去游離的 Fluo-3-AM。重懸于原體積無鈣 HBS 液中，立即測定不同濃度藥物處理后紅細胞熒光強度變化，激發(fā)波長 490 nm，發(fā)射波長 526 nm，狹縫 5 nm，檢測過程中溫度為 25。記錄熒光強度值，用以下公式計算紅細胞內(nèi)游離鈣濃度：    Ca2+i=kd·F-FminFmax-F    其中，F(xiàn)min 和 Fmax 最小和最大熒光強度，按照文獻10方法測得，F(xiàn)為樣品熒光強度。其中kd為 Fluo-3 與 Ca2+ 解離常數(shù)，25 時kd = 450 nmol/L。2.5

12、60; 紅細胞膜表面Ca2+- Mg2+- ATPase 活性的測定紅細胞與 RSF 作用及洗滌方法同“2.3”項，離心收集紅細胞，蒸餾水破膜 1 h，3000 r/min 離心收集，洗滌 2 次，棄上清液，將沉淀的紅細胞膜用一定體積預(yù)冰生理鹽水懸浮，冰浴保存，按試劑盒說明書方法測定 Ca2+- Mg2+- ATPase 活性。每劑量組測定 3 個平行數(shù)據(jù)，統(tǒng)計采用單因素方差分析，以P<0.05為差異顯著。3  結(jié)果3.1  RSF 的溶血作用實驗結(jié)果顯示，RSF 作用劑量為 5，10，15，20 g·L-1 時，其相對溶血率分別為0.0%，5.69%，9.

13、87%，19.98%，初步確定 RSF 的臨界溶血濃度為 5 g·L-1。為避免中藥溶液色澤對測定結(jié)果的干擾，試驗中采用相同濃度的藥物溶液作為參比。3.2  RSF 對紅細胞影響的 AFM 觀察應(yīng)用 AFM 觀測了正常紅細胞及與 RSF 溫育后紅細胞樣品的整體形態(tài) (7.2 m ×7.2 m) 及細胞膜局部精細結(jié)構(gòu) (600 nm ×600 nm)。正常紅細胞樣品 AFM 觀察結(jié)果見圖 1，圖 1 a 為完整細胞形貌圖，圖 1 b 為該細胞的直徑及高度曲線圖。從圖中可以看出，紅細胞的整體輪廓呈中心凹陷的扁圓盤形狀，表面比較光滑。高度約1.0 m，直徑約 6.5 m，凹陷深度 0.30 m 左右。    圖1c 是在納米范圍內(nèi)對正常紅細胞膜表面局部區(qū)域成像，圖中顯示細胞膜表面是由大小不同的顆粒狀物質(zhì)密集排列的凹凸表面，顆粒為球形或橢球形，顆粒之間有凹陷，顆粒整齊，沒有很高的突起和很深的凹陷；顆粒在整個膜表面均勻分布。凸出的顆粒狀物質(zhì)直徑小于 30 nm，表面起伏小于 30 nm，與已有文獻報道吻合1，顆粒狀物質(zhì)對應(yīng)膜外周蛋白，凹陷區(qū)域?qū)?yīng)于細胞膜脂質(zhì)區(qū)。    圖2 為紅細胞與 0.5 g·L-1 和 2 g·L-1 濃度 RSF 分別作用30 min 后的 AF