重金屬鎘對短帶鞘藻-活性污泥共生體系脫氮除磷的沖擊效應(yīng)及機制11辯析

1、國家自然科學(xué)基金：胞外聚合物在重金屬鎘沖擊小球藻脫氮除磷過程中的作用及機制（ 1） 鎘沖擊對小球藻脫氮除磷效率的影響。（ 2） 鎘沖擊下氮磷在 EPS及藻細胞內(nèi)分布的變化。（ 3） EPS 在鎘沖擊下的分布特性變化。（ 4） EPS 與鎘的結(jié)合方式及其對 鎘在藻細胞內(nèi)分布的影響The role of EPS in removal of nitrogen and phosphorus by Chrolla Vulgris with thestress of heavy metal Cadmium and its mechanism藻類生物膜技術(shù)具有脫氮除磷的優(yōu)勢，但污水中重金屬等毒物可影響藻細胞

2、及其產(chǎn)生在細胞外的大分子聚合物（胞外聚合物，EPS），但目前對 EPS 在重金屬沖擊藻類脫氮除磷過程的作用及機制尚不明晰。本項目水環(huán)境中優(yōu)勢藻種小球藻為研究目標，為重金屬鎘為代表，在探明EPS 對小球藻脫氮除磷效率影響的基礎(chǔ)上，采用三維熒光光譜及傅立葉紅外光譜等方法，研究鎘沖擊下EPS 的分布特性變化（分子量分布、可溶態(tài)和結(jié)合態(tài)EPS 中主成份含量，親水與疏水性EPS 等）；明確鎘沖擊下，氮、磷在藻細胞內(nèi)及EPS 的分布比例變化；采用X-射線光電子能譜和掃描透射軟X 射線顯微鏡等技術(shù)手段深入研究EPS 與鎘結(jié)合的分子模式（結(jié)合位點、方式與主要結(jié)合物）以及EPS 對鎘在小球藻亞細胞內(nèi)分布的影響。

3、研究結(jié)果可從分子水平上闡明生物體EPS 與重金屬的作用機制，對指導(dǎo)藻類生物膜技術(shù)在污水脫氮除磷中的運用具有重要意義。藻類廣泛存在于水環(huán)境中， 其生物膜體系在城市污水脫氮除磷的過程中具有良好運用前景。水處理中與氮磷共存表面活性劑等有機污染物，但目前關(guān)于表面活性劑脅迫對藻類吸收氮磷的影響缺乏深入認識。本項目以小球藻為代表， 研究表面活性劑脅迫對藻類吸收氮磷的影響及分子機制。在了解其吸收不同形態(tài)氮磷動力學(xué)特征的基礎(chǔ)上， 考察表面活性劑脅迫下小球藻吸收氮磷的效率。通過測定細胞膜性狀，細胞核、線粒體及葉綠體的形態(tài)，以及葉綠素含量和凈光合作用速率，明確表面活性劑脅迫下氮磷吸收過程中藻細胞性狀的變化。構(gòu)建氮

4、磷誘導(dǎo)小球藻抑制性差減文庫， 通過全文庫測序進行表達序列標簽的同源比對和功能分類，篩選出小球藻氮磷吸收的關(guān)鍵基因，并以此為靶基因采用Real-time PCR 技術(shù)分析表面活性劑對其轉(zhuǎn)錄量的影響，從分子水平上深入闡明脅迫機制。研究成果可豐富水環(huán)境中藻類對氮磷的吸收理論，對指導(dǎo)藻類脫氮除磷的實際運用具有重要意義。（ 4） EPS 與鎘的結(jié)合方式及其對鎘在亞細胞內(nèi)分布的影響選擇對照組（無鎘）和加鎘組的小球藻，在 6d 的實驗過程中，（ 1）采用 X-射線光電子能譜（ XPS）研究藻細胞表面 C, O, N, S 以及 Cd 元素組成和化合價態(tài)變化，探明 EPS 與鎘結(jié)合的結(jié)合元素與位點； （2）測

5、定 EPS 中 Cd 的濃度變化，對比 Cd-EPS, Cd-木糖 , Cd-酪氨酸和 Cd-的 K 邊界 X- 射線熒光吸收光譜 （ XAFS）圖譜，確定Cd 與 EPS 的主要結(jié)合方式與主要結(jié)合物。 （3）采用掃描透射軟X射線顯微鏡（STXM ）觀察 EPS 對鎘在小球藻亞細胞內(nèi)分布的影響，從分子水平上闡明生物體 EPS 與重金屬的作用機制。（ 4）實驗方案：選擇對照組（無鎘）和加鎘組的小球藻，在6d 的實驗過程中，（ 1）采用 X- 射線光電子能譜（ XPS）研究藻細胞表面 C, O, N, S 以及 Cd 元素組成和化合價態(tài)變化。 先對每個樣品進行全掃描 （掃描范圍 0-1200ev，

6、通道時間 100ms, 通過能 160ev, 布長為 1.0eV），觀測藻細胞表面的主要化學(xué)元素。然后詳細考察藻細胞加入 Cd 前后，XPS 窄區(qū)掃描（通道時間 250ms，通過能 20ev，步長 100ev， 曲線用 Peakfit v4.12 軟件進行峰擬合） 中 C1S, O1S, N1S,S2p 以及Cd3d 的結(jié)合能位移，從而探明Cd 加入后，藻細胞表面主要元素的存在狀態(tài)。（ 2）提取藻細胞 EPS，并選擇 EPS 中可能存在與 Cd 作用的幾種主要成份木糖，酪氨酸和為研究對象，對比 Cd-EPS, Cd-木糖 , Cd-酪氨酸和 Cd-的 K 邊界 X-射線熒光吸收光譜 （XAFS

7、 ）圖譜，從譜圖中曲線的中峰位置和曲線輪廓確定Cd與 EPS 的主要結(jié)合方式與主要結(jié)合物。（ 3）采用掃描透射軟 X 射線顯微鏡（ STXM ）觀察 EPS 對鎘在小球藻亞細胞內(nèi)分布的影響，從分子水平上闡明生物體 EPS 與重金屬的作用機制。其中（ 2）和（3）擬分別采用上海同步輻射光源 （ STXM ）中 BeamlineBL14W1D和 BL08U1A 工作站進行實驗研究。一立項依據(jù)：水體中氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)的污染已引起普遍關(guān)注，我國城鎮(zhèn)污水即將執(zhí)行一級A排放標準（ GB18918-2002），氮磷（ NH 4+-N，TP，TN ）的排放標準分別從 15，1.0，20 mg/L 提高到8， 0

8、.5， 15 mg/L，因此對污水脫氮除磷提出了更高的技術(shù)要求。與傳統(tǒng)的微生物脫氮除磷過程相比較，結(jié)合了藻類吸收氮磷優(yōu)勢的藻菌生物膜技術(shù)因其效率高、 能耗低和藻類可資源化利用的優(yōu)勢受到關(guān)注。藻細胞能利用水體中多種無機氮磷和有機氮磷化合物作為氮源和磷源，利用二氧化碳和碳酸鹽作為碳源進行光自養(yǎng)生長， 并且藻類細胞可以用來去除污水中的營養(yǎng)物質(zhì)并以有機物的形式將其儲存在藻細胞中。20世紀中期， Oswald5 和McGriff 6 最早提出利用微藻處理污水的想法。 20世紀 80年代以來，生物技術(shù)的飛速發(fā)展使藻類大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)逐步完善。 國內(nèi)外對發(fā)揮藻類凈化污水的潛力進行了研究并取得很大進展 7-9

9、。藻菌生物膜在自然界水體和各種污水處理生物反應(yīng)器中普遍存在, 它們在自然水體的凈化和污水處理中發(fā)揮了非常重要的作用 , 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，單細胞的小球藻（ Chlorella vulgaris ）相對其他等淡水藻種對氨氮和磷酸鹽具有較高的去除率，在與地衣芽孢桿菌（ Bacillus licheniformis ）組成藻菌共生體系后，由于細菌促進了藻類生物量和分泌胞外物質(zhì)， 該體系對氨氮和正磷酸鹽的去除率達到 90.2%和 94.8%。藻細胞主要由細胞壁， 細胞膜，葉綠體和細胞核等亞細胞器組成，其中細胞壁是藻類吸收利用氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)的第一層通道。藻類細胞壁內(nèi)部為纖維素結(jié)構(gòu)，而外層多被多聚糖類

10、物質(zhì)等有機物包裹組成。Wingender等人用縮寫 “ EPS”作為術(shù)語來代表細胞外不同的類別的大分子，如多糖，蛋白質(zhì)，核酸和其他高分子化合物。 EPS顯著影響了藻類的物理化學(xué)性質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)，表面電荷，絮凝，沉降性能，脫水性能和吸附能力。 EPS與細胞通過復(fù)雜的相互作用，形成大量的一個巨大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)水，保護細胞免受脫水。EPS 以不同形式粘附在藻細胞表面 , 增強藻細胞表面的電負性。 EPS中碳水化合物和羰基化合物占 60%80%以上，Huang 等16 通過大量研究發(fā)現(xiàn)這些復(fù)雜的胞外多糖基本上都由常見的單糖單位組成。 EPS 的成分和釋放濃度主要與藻細胞的種類、 生長期有關(guān)，Hoyer 等1

11、8 實驗發(fā)現(xiàn)集胞藻在生長期間釋放出質(zhì)量濃度 1.8mg·L-1 的EPS，而小球藻的釋放質(zhì)量濃度則達到 81 mg·L-1 。大部分藻類在指數(shù)生長期 EOM 的釋放速率高于穩(wěn)定期 19 。在生長后期，隨著藻細胞的衰老，粘附于藻細胞壁上的EOM 脫落，釋放到水中。EPS作為包裹在藻細胞壁外的重要物質(zhì)，對藻類吸收利用氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)必然產(chǎn)生影響。李和 ganczarczyk（ 1990）觀測到的大量 EPS存在于非晶相污泥絮體與周圍的細胞，這表明基質(zhì)必須通過EPS層傳遞細胞。一般情況下，組分的擴散EPS系數(shù)低于水，這意味著 EPS影響到營養(yǎng)物質(zhì)的代謝產(chǎn)物，高濃度的EPS不利于底物

12、傳質(zhì)。此外， EPS給藻類提供了大量可以與其他組份子結(jié)合的官能團( 如羧基、氨基、醛基、羥基、巰基、磷?；棒驶?。研究表明，在 EPS所有官能團中 , 多糖提供的羧基最為豐富, 占藻細胞表面將近 70%的可滴定位點 41 。EPS可吸附許多金屬和有機物質(zhì)， 如蛋白質(zhì)中的芳烴、 烷烴和碳水化合物的疏水性區(qū)域，同時 EPS存在官能團的不同也構(gòu)成了EPS不同的親疏水性 ,影響 EPS對物質(zhì)的吸附和傳遞。 補充文獻具體說明。在利用藻類去除氮磷過程中， 氮磷營養(yǎng)物常與重金屬， 表面活性劑、芳香烴、農(nóng)藥等有毒污染物共存， 因此，在藻類吸收氮磷過程中這些毒物的沖擊作用影響不容忽視。課題組前期研究表明，

13、在低濃度的毒物作用 （如重金屬鎘和季銨鹽表面活性劑）可對小球藻的生長存在一定刺激效應(yīng)，促進其吸收氮磷的效率。 而當毒物超過一定濃度后， 則對小球藻的生長存在抑制效應(yīng)。這個濃度閾值的濃度與藻種、毒物種類和濃度有關(guān)。研究中還觀察到，低濃度毒物刺激下小球藻的EPS分泌物量有增加的趨勢，據(jù)此可以推斷EPS影響了藻類吸收利用氮磷的過程。重金屬是水處理中一類高出現(xiàn)頻率和濃度的毒物，文獻報道重金屬對藻類具有生態(tài)毒性并且由于藻類帶有表面負電荷，藻類極容易吸附重金屬離子。 重金屬對藻類的毒性與其存在濃度和形態(tài)有關(guān)。Xu 等研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的農(nóng)藥與Cu作用后，結(jié)合成 IM-Cu 因此降低了 Cu對斜生柵藻的毒性。

14、依次推斷，EPS可通過與Cd形成新的化合物而增加或者減緩毒物的毒性，另一方面， Cd于EPS后也可以改變 EPS的結(jié)構(gòu)和組成， 也因此影響了其性質(zhì) （化學(xué)組成， 親疏水性和電荷性等） 。這個過程對脫氮除磷的影響是復(fù)雜而重要的。藻類生物膜技術(shù)具有脫氮除磷的優(yōu)勢，但污水中重金屬等毒物可影響藻細胞及其產(chǎn)生在細胞外的大分子聚合物 （胞外聚合物， EPS），但目前對 EPS在重金屬沖擊藻類脫氮除磷過程的作用及機制尚不明晰。近年來，一些新的研究手段不斷應(yīng)用到EPS的研究中。如三維熒光光譜(3DEES)。3DEES亦稱總發(fā)光光譜或激發(fā)發(fā)射矩陣圖, 能夠獲得激發(fā)波長和發(fā)射波長同時變化時的熒光強度信息， 并且可

15、對多組分復(fù)雜體系中熒光光譜激發(fā)、發(fā)射、重疊的對象進行光譜識別和表征， 是一種很有用的光譜指紋技術(shù)。 借助 3DEES,學(xué)者研究了水處理過程中藻類EPS中主要成份糖類，脂質(zhì)和類腐殖酸結(jié)構(gòu)及其變化。 X射線能譜（ XPS）作為一種非常靈敏的固體表面分析技術(shù)，是確定樣品元素組成和化合價態(tài)的有效手段。借助XPS可研究藻細胞表面 EPS中的主要化學(xué)元素及其與 Cd結(jié)合后的變化。同時借助同步輻射光源技術(shù)，采用X- 射線熒光光譜觀測加入 Cd后， Cd-EPS譜線與 Cd與 EPS主要成份結(jié)構(gòu)單元木糖，的譜線峰結(jié)構(gòu)與譜線輪廓的變化，以及采用掃描透射軟X 射線顯微鏡觀測 EPS對鎘在小球藻亞細胞內(nèi)分布的影響。

16、綜上所述，本項目以水環(huán)境中優(yōu)勢藻種小球藻為研究目標，為重金屬鎘為代表，在探明 EPS對小球藻脫氮除磷效率影響的基礎(chǔ)上，采用三維熒光光譜及傅立葉紅外光譜等方法，研究鎘沖擊下EPS 的分布特性變化（分子量分布，可溶態(tài)EPS 和結(jié)合態(tài)EPS，親水與疏水性等性質(zhì)） ；明確鎘沖擊下，氮、磷在藻細胞內(nèi)及 EPS 的分布比例變化；采用X-射線光電子能譜， X- 射線熒光光譜和掃描透射軟 X 射線顯微鏡等技術(shù)手段深入研究EPS 與鎘結(jié)合的分子模式（結(jié)合位點、方式與主要結(jié)合物）以及EPS 對鎘在小球藻亞細胞內(nèi)分布的影響。研究結(jié)果可從分子水平上闡明生物體EPS與重金屬的作用機制， 對指導(dǎo)藻類生物膜技術(shù)在污水脫氮除

17、磷中的運用具有重要意義。EPS在藻類包括羧基在內(nèi) , 這些基團有些可以失去質(zhì)子而帶負電荷, 靠靜電引力吸附金屬離子 ; 有的帶孤對電子 , 可與金屬離子形成配位鍵而絡(luò)合金屬離子,這些已為不少實驗證實。例如, 金屬離子 ( 如Cd2+、Ni2+ 、Pb2+等) 在 pH 值接近羧酸的解離常數(shù)時能被最大量、或接近最大量地被藻細胞吸收, 用傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜分析表明 , 鎘與藻細胞表面的羧基基團形成了橋連或二齒狀結(jié)構(gòu)42 。在褐藻類中 , 第二個最為重要的酸性功能基團是巖藻衣聚糖上的磺酸基團, 其在褐藻生物吸附中也扮演了重要的角色; 此外 , 在低 pH 值中 , 多聚糖上的羥基基團作用也不容小視

18、43 。此前 , 人們一直認為 , 金屬離子是通過物理吸附結(jié)合到吸附劑高度發(fā)達的表面 44 。然而近來的研究表明 , 事實遠非如此簡單 , 如果這種解釋成立的話 , 那么所依靠的應(yīng)該是藻細胞高度發(fā)達的細胞壁。 通過藻細胞對亞甲基藍的吸附來計算螺旋藻的藻細胞面積發(fā)現(xiàn) , 在藻細胞吸附重金屬的總量中 , 物理吸附不超過其中的 3.7%45。陽離子可與分子或帶有自由電子對的陰離子 ( 堿基對 ) 起絡(luò)合或螯合反應(yīng)。藻類細胞對金屬離子的吸附也存在這種現(xiàn)象。 如海藻細胞硫酸根、 氨基、羧基與金屬離子有絡(luò)合現(xiàn)象22,Haug 等50 在研究褐藻 ( Laminaria digitata) 時發(fā)現(xiàn) , 金屬離子與藻酸鹽上基團的親和力依Cu2+> Ba2+> Ca2+>Co2+順序而減小 , Haug 和Smidsrod 解釋為金屬離子越大 , 越有利于同相互之間距離較遠的功能基團組成的絡(luò)合位點相結(jié)合。運用 X