調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)及其流式檢測

1、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg及其流式檢測方法1、Treg細胞概述高效免疫抑制劑的發(fā)現(xiàn)及其聯(lián)合應用使臨床器官移植的急性排斥反應大大降低,移植物的存活時間明顯延長;器官移植成為挽救終末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途徑。但是免疫抑制劑具有明顯的毒副作用(如對重要臟器的損傷、降低抗腫瘤及抗感染免疫力等及對治療慢性排斥反應效果較差等問題,均限制了免疫抑制劑的長期應用。因此,相關(guān)生命科學工作者嘗試通過誘導移植免疫耐受途徑來避免免疫抑制劑的長期應用及克服移植免疫排斥反應。在上個世紀九十年代中期,由Sakaguchi等首先證實了天然CD4 CD25 調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell,Treg為一

2、類具有免疫抑制作用的T細胞,約占外周CD4+T細胞的510%。該類細胞以“主動”的方式參與免疫應答/免疫耐受的調(diào)控,不僅參與自身免疫耐受調(diào)節(jié),而且在腫瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。2、Treg細胞的來源研究證實,天然的CD4 +CD25+Treg細胞來源于胸腺,小鼠出生后第3天切除胸腺,外周缺乏CD4+ CD25+Treg細胞,產(chǎn)生抗自身抗體并出現(xiàn)自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。而在第0天和第7天切除胸腺,并不表現(xiàn)自身免疫性疾病。這說明出生3d內(nèi)是胸腺產(chǎn)生CD4+CD25+Treg細胞的關(guān)鍵時期,這時切除胸腺引起自身反應性CD4+T細胞的過度增殖。但是,出生第0天胸腺產(chǎn)生的自身反應性CD

3、4+T細胞不足,出生第7天胸腺已經(jīng)產(chǎn)生了足夠的CD4+CD25+Treg細胞,所以這時切除胸腺,小鼠不出現(xiàn)自身免疫性疾病。Papiernik等證實,CD4+CD25+Treg 細胞產(chǎn)生于胸腺,然后遷移到外周發(fā)揮作用,CD4+CD25 胸腺細胞與外周的CD4+CD25+Treg細胞一樣,表現(xiàn)對經(jīng)由TCR的抗原刺激呈低反應性,并且顯示抑制其他T 細胞增殖的能力。CD4+CD25+ Treg細胞的產(chǎn)生需要TCR與胸腺皮質(zhì)上皮細胞的MHC II類分子間的高親和力作用,MHC II類分子缺陷的小鼠缺乏CD4+CD25+Treg細胞。CD4+CD25+T細胞除了在胸腺產(chǎn)生以外,還可以在未成熟的樹突狀細胞、

4、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低劑量抗原誘導下由外周CD4+CD25-細胞轉(zhuǎn)變而來,該類細胞稱為誘導的CD4+CD25+Treg細胞。3、Treg細胞的常用的分子標記CD25:Treg細胞調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)平衡,增加免疫耐受。研究表明,多種T 細胞分子抗原參與Treg細胞的特異性功能效應。傳統(tǒng)鑒定Treg細胞主要是通過CD4和CD25來標記。但隨著研究的進一步深入,發(fā)覺只通過CD4+CD25+雙陽性來定義的Treg細胞并不完全準確FOXP3: FOX(forkhead box是脊椎動物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子的總稱,是一個具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子大家族,通常和細胞生長發(fā)育的調(diào)控有關(guān)。FOX 家

5、族成員都有一個叉頭樣結(jié)構(gòu)域,能與DNA結(jié)合。FOXP3是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員,2001年由Brunkow等首次報道。研究發(fā)現(xiàn),它的表達及功能與調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,TR細胞密切相關(guān)。如果FOXP3基因發(fā)生突變,將影響TR細胞的發(fā)育成熟,導致IPEX綜合征(immune dysregulation,polyendocrinop -athy,enteropathy,X linked syndrome。 FOXP3主要表達于胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等淋巴器官和組織。在小鼠特異性表達于CD4+CD25+T細胞,而不表達于CD8+T細胞。在人類FOXP3不僅可表達于CD4+

6、CD25+T細胞,還可表達于CD8+CD28-T細胞。但在CD4+T細胞中的表達明顯高于CD8+T細胞。目前,Foxp3(forkhead box P3,Scurfin是目前公認的Treg 細胞的最敏感的標志。CD127:最近發(fā)現(xiàn)通過表達CD4, CD25和傳導信號FoxP3來定義調(diào)節(jié)性T 細胞時,在一類特殊的細胞群體時會出現(xiàn)問題。我們發(fā)現(xiàn)IL-7受體(CD127在外周血CD4+T的一個亞群中會下調(diào)表達。我們證實這些細胞FoxP3陽性,且這群細胞包括那些CD25弱陽性或陰性群體。聯(lián)合使用CD4,CD25和CD127可得到高純度的調(diào)節(jié)性T細胞,比以前的通過其他標志物來區(qū)分方法顯著提高。這些細胞在

7、功能抑制實驗中可發(fā)揮高度抑制功能。實際上,通過CD4和CD127表達來區(qū)分的細胞數(shù)量(包括CD25+CD4+和CD25-CD4+三倍于通過CD4+CD25hi區(qū)分的調(diào)節(jié)性T細胞亞群。最后,我們使用CD127定量檢測I型糖尿病病人調(diào)節(jié)性T細胞,發(fā)現(xiàn)CD127可作為人調(diào)節(jié)性T細胞的標志物。4、FOXP3流式檢測方法美國eBioscience公司是最早擁有FOXP3流式檢測抗體的公司之一,公司通過不斷改進和優(yōu)化,建立了一套完美的針對FOXP3流式檢測特殊的試劑和方案。(1實驗材料實驗設備1流式上樣管2混勻振蕩器3離心機4移液器、Tips5流式細胞儀所需試劑1細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑(CD4、

8、CD25或CD8等2FOXP3熒光標記抗體3溶血素:(eBioscience目錄號00-4333用于裂解紅細胞淋巴細胞分離液:若樣品為人的全血,建議先用分離液分離出單個核細胞后再做后續(xù)檢測5固定劑和破膜劑:(eBioscience FOXP3檢測專用試劑,目錄號為00-5521或00-5523;在FOXP3染色前,將其中的Fixation/Perme -abilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1:3的比例混合,配制好的溶液保存時間不要超過一天6其他試劑:Flow Cytometry Staining Buffer(00

9、-4222或PBS,Permeabil -ization Buffer(Cat.No 00-8333等(2實驗操作步驟注:對于不同的FOXP3克隆號抗體,在操作上可能存在著一些細微的差別。具體實驗時,請參考相應的抗體說明書上的操作步驟。此操作以人Foxp3 (clone PCH101, cat. XX-4776.為例。1在每個流式上樣管中加入100ul準備好的細胞懸液,細胞數(shù)約為1x106個。2按照細胞表面抗原染色方法標記表面抗原(如CD4、CD8、CD25等。3用預冷的Flow Cytometry Staining Buffer或預冷的PBS洗滌細胞。4旋渦震蕩重懸細胞后加入1ml的固定/破

10、膜工作液(Fixation/Permeabilization,并再次旋渦混勻。5避光4孵育30-60分鐘。6加入2ml Permeabilization Buffer(Cat.No 00-8333工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。7重復第5步操作洗滌細胞。8可選加入稀釋好的2%(2ul的正常大鼠血清(用Permeabilization Buffer工作液進行稀釋100ul,在避光4孵育15分鐘9封閉液無需洗去,直接加入稀釋好的熒光標記FOXP3抗體(用Permeabilization Buffer工作液進行稀釋20ul,避光4孵育至少30分鐘。建議進行預實驗摸索出抗體的最適濃度。10加入2ml Permeabilization Bu