葛根素對(duì)體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究

1、葛根素對(duì)體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究 【摘要】 目的:了解葛根素對(duì)體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞增殖活性、氧化應(yīng)激和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子1（TGF1）分泌的影響。方法:體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞，分對(duì)照組，腹膜透析液（PDS）組及葛根素1、2、3組（葛根素終濃度依次為50、100、200gml-1）5組觀察。檢測(cè)各組間皮細(xì)胞的增殖活性，上清MDA、SOD、GSH水平以及TGF1的含量并進(jìn)行比較。結(jié)果:在PDS干預(yù)下腹膜間皮細(xì)胞MTT還原能力明顯下降，上清液MDA水平較對(duì)照組顯著升高，SOD、GSH水平較對(duì)照組顯著降低。葛根素組MDA水平顯著低于PDS組，SOD、GSH水平顯著高于PDS組。腹膜間皮細(xì)胞在

2、PDS干預(yù)下分泌TGF1較對(duì)照組顯著增加，葛根素組TGF1分泌與PDS組比較有顯著下降。結(jié)論:葛根素可以拮抗商業(yè)性PDS對(duì)腹膜間皮細(xì)胞增殖活性的抑制作用，可以抑制氧化應(yīng)激和TGF1分泌。 【關(guān)鍵詞】 葛根素；人腹膜間皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子1；腹膜透析液；氧化應(yīng)激腹膜透析是終末期腎病患者首選的腎臟替代治療方式之一1。然而隨著透析時(shí)間的延長(zhǎng)，腹膜纖維化形成成為導(dǎo)致患者腹膜功能喪失和透析退出的主要原因。研究表明，腹膜透析液（peritoneal dialysis solution,PDS）的生物不相容性導(dǎo)致的腹膜間皮細(xì)胞損傷是腹膜纖維化發(fā)生的起始因素。有效保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞能夠阻止或延緩腹膜纖維化的進(jìn)展

3、，給腹膜透析患者帶來(lái)益處。我們通過(guò)觀察葛根素對(duì)腹膜間皮細(xì)胞增殖活性、氧化應(yīng)激以及轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子1（TGF1）分泌的影響，明確葛根素是否具有拮抗PDS對(duì)腹膜間皮細(xì)胞的損傷，從而保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞，發(fā)揮潛在的抗腹膜纖維化作用。1 材料與方法1.1 材料2.5%Baxter PDS為廣州百特醫(yī)療用品公司產(chǎn)品，pH5.2,內(nèi)含葡萄糖0.139molL-1、乳酸4.97molL-1；葛根素注射劑為浙江康恩貝制藥股份有限公司產(chǎn)品，規(guī)格250mg支-1；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、RPMI 1640粉劑以及胰蛋白酶等購(gòu)自GIBCO公司；TGF1 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自晶美生物有限公司；四甲基偶

4、氮唑鹽（MTT）、二甲亞砜（DMSO）為Sigma公司產(chǎn)品；GSH、SOD、MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；微量蛋白BCA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物有限公司；抗細(xì)胞角蛋白抗體、抗波形蛋白抗體、第八因子抗體和抗白細(xì)胞CD45抗體購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；完全培養(yǎng)基為含20%FBS、105 UL-1青霉素和100gml-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液。全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Sunrise)為Biobank公司產(chǎn)品。1.2 方法1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用x-s表示，組間差異比較采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，P0.05表示存在顯著性差異。2 結(jié)果2.1 間皮細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)

5、胞經(jīng)PDS干預(yù)后，其MTT還原能力顯著低于對(duì)照組，A值為（01770010）vs （04000103）,P001；葛根素1、2、3組間皮細(xì)胞MTT還原能力A值依次為（02440035）、（03010034）和（03350041），顯著高于PDS組（均P001）。葛根素1、2、3組間皮細(xì)胞MTT還原能力與對(duì)照組比較顯著降低（P005）。間皮細(xì)胞增殖活性葛根素2組顯著高于葛根素1組（P001），葛根素3組顯著高于葛根素2組（P005）。見圖1(圖中及其后表中葛根素1、2、3組依次簡(jiǎn)稱為葛1組、葛2組、葛3組)。*與PDS組比較，P0.01圖1 葛根素對(duì)間皮細(xì)胞MTT還原能力的影響（略）2.2 氧化

6、應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)PDS和葛根素干預(yù)后，上清液MDA、SOD、GSH水平見表1。其中PDS組MDA水平顯著高于對(duì)照組（P0.01），SOD、GSH水平均顯著低于對(duì)照組（均P0.01）。MDA水平葛根素1、2、3組均顯著低于PDS組（均P0.05），葛根素3組顯著低于葛根素1、2組（均P0.05）。SOD水平葛根素1、2、3組均顯著高于PDS組（均P0.05），葛根素2組顯著高于葛根素1組（P0.01）,葛根素3組顯著高于葛根素1、2組（均P0.05）。GSH水平葛根素1、2、3組均顯著高于PDS組（均P0.05），葛根素2組顯著高于葛根素1組（P0.05），葛根素3組顯著高于

7、葛根素1、2組（均P0.01）。 表1 不同劑量葛根素對(duì)間皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（略）與PDS組相比，1）P0.01，2）P0.052.3 上清液TGF1檢測(cè)結(jié)果培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)PDS和葛根素干預(yù)后，上清液中TGF1含量變化見圖2。上清液中TGF1含量PDS組為(21.235.79)ngmg-1,較對(duì)照組 為（8.032.56） ngmg-1顯著升高（P0.01）；葛根素1、2、3組依次為（15.223.86）、（12.923.52）和（9.701.71）ngmg-1，顯著低于PDS組（均P0.01）；葛根素組之間比較，葛根素3組顯著低于葛根素1、2組（均P0.01）。*與PDS組比較，P0

8、.01圖2 葛根素對(duì)間皮細(xì)胞TGF1分泌的影響（略）3 討論腹膜透析作為有效的腎臟替代治療方法已經(jīng)被越來(lái)越多的尿毒癥患者所接受，隨著腹膜透析時(shí)間的延長(zhǎng)，腹膜發(fā)生纖維化導(dǎo)致腹膜功能衰竭是患者退出治療的主要原因之一。PDS具有明顯的生物不相容性，其導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的關(guān)鍵因素。而有效保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞則可以明顯延緩腹膜纖維化的進(jìn)程。大量的研究表明，葛根素可以拮抗多種因素尤其是高糖相關(guān)因素對(duì)細(xì)胞造成的損傷46。葛根素能否拮抗PDS對(duì)腹膜間皮細(xì)胞的損傷目前并無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究在體外培養(yǎng)條件下通過(guò)向培養(yǎng)液中添加不同濃度的葛根素，觀察其對(duì)腹膜間皮細(xì)胞增殖活性、氧化應(yīng)激以

9、及TGF1分泌的影響，初步了解葛根素對(duì)腹膜間皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其潛在拮抗腹膜纖維化的作用。商業(yè)性PDS可以抑制腹膜間皮細(xì)胞的增殖活性，影響間皮細(xì)胞損傷后再修復(fù)，促進(jìn)腹膜纖維化的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，腹膜間皮細(xì)胞經(jīng)PDS干預(yù)后，其間皮細(xì)胞增殖活性較對(duì)照組顯著降低，證實(shí)商業(yè)性PDS可以抑制腹膜間皮細(xì)胞的增殖活性。在葛根素組腹膜間皮細(xì)胞增殖活性得到明顯改善，并且改善的程度呈明顯劑量依賴的特點(diǎn)，提示葛根素可以拮抗PDS對(duì)腹膜間皮細(xì)胞增殖活性的抑制作用，起到保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞的作用。研究顯示，含葡萄糖透析液可以通過(guò)氧化應(yīng)激導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞損傷。氧化應(yīng)激能顯著激活信號(hào)傳遞系統(tǒng)，刺激細(xì)胞肥大、早衰、凋亡以及抑

10、制細(xì)胞增生。Gotloib等通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)向腹腔注射脫氧膽酸，在明顯增加透出液MDA水平的同時(shí)觀察到腹膜間皮細(xì)胞明顯減少，提示氧化應(yīng)激參與了腹膜的損傷。相反，抑制氧化應(yīng)激產(chǎn)生則可能起到保護(hù)腹膜的作用。Gnal等10通過(guò)使用含曲美他嗪的透析液，發(fā)現(xiàn)在抑制氧化應(yīng)激的同時(shí)能夠顯著減輕透析液對(duì)腹膜的損傷。大量的研究證實(shí)，葛根素具有明顯的抗氧化應(yīng)激作用。從本研究也可以看出，在培養(yǎng)液中加入葛根素可以明顯抑制PDS誘導(dǎo)的間皮細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)生，而且這種作用呈現(xiàn)濃度依賴，提示葛根素可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激對(duì)腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。TGF1是一種重要的致纖維化細(xì)胞因子，正常的腹膜間皮細(xì)胞有TGF1的表達(dá)和分泌。非生物

11、相容性透析液可以導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞TGF1過(guò)度分泌和表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌并減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生1112。從本研究的結(jié)果可以看出，在培養(yǎng)液中添加PDS后其上清液中TGF1的含量與對(duì)照組比較顯著升高（P0.01）,說(shuō)明商業(yè)性PDS具有刺激腹膜間皮細(xì)胞TGF1分泌的作用，與以往的研究結(jié)果13一致。本研究中通過(guò)向培養(yǎng)液中添加葛根素后與PDS組比較，間皮細(xì)胞分泌TGF1明顯減少（P0.01），提示葛根素具有抑制PDS導(dǎo)致的腹膜間皮細(xì)胞TGF1過(guò)度分泌的作用。有研究顯示，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)可以抑制腹膜間皮細(xì)胞TGF1的分泌14。葛根素抑制TGF1分泌的作用是否與其抑制氧化

12、應(yīng)激有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。綜上所述，葛根素可以明顯拮抗商業(yè)性PDS對(duì)腹膜間皮細(xì)胞增殖活性的抑制作用，可以抑制氧化應(yīng)激和TGF1分泌，具有潛在的保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞和拮抗腹膜纖維化的作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1OREOPOULOS D G.The optimization of continuous ambulatory peritoneal dialysis (clinical conference)J.Kidney Int，1999,55(3):11311149.STYLIANOU E，JENNER L A，DAVIES M，et al.Isolation，culture and characteri

13、zation of human peritoneal mesothelial cellsJ.Kidney Int，1990,37(6): 15631570.POLLOCK C.Pathogenesis of peritoneal sclerosisJ.IJAO，2005,28(2): 9096.徐敏華,葉希韻,張隆，等.葛根黃酮對(duì)糖基化終產(chǎn)物致細(xì)胞損傷的修復(fù)J.華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2006,（2）：9397.王堅(jiān)，陳敏，李曉冬,等.葛根素、大黃素對(duì)糖基化產(chǎn)物引起的牛視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞損傷的影響J.中藥藥理與臨床，2000，16(6):910.張斌,魏欣冰,劉慧青,等.羥乙基葛根素對(duì)腦

14、星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化性損傷的保護(hù)作用J.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006,41(2):171174.BREBOROWICZ A,RODELA H，OREOPOULOS D G.Toxicity of osmotic solutes on human mesothelial cells in vitroJ.Kidney Int,1992,41(5):12801285.ISHIBASHI Y，SUGIMOTO T，ICHIKAWA Y，et al.Glucose dialysate induces mitochondrial DNA damage in peritoneal mesothelial cellsJ.P

15、erit Dial Int，2002,22(1):1121.GOTLOIB L，WAJSBROT V，CUPERMAN Y，et al.Acute oxidative stress induces peritoneal hyperpermeability，mesothelial loss，and fibrosisJ.J Lab Clin Med，2004,143(1):3140.10GUNAL A I，CELIKER H，USTUNDAG B，et al.The effect of oxidative stress inhibition with trimetazidine on the pe

16、ritoneal alterations induced by hypertonic peritoneal dialysis solutionJ.J Nephrol，2003,16(2):225230.11JAYYOUSI R A，MEDCALF J F，HARRIS K P.Role of transforming growth factor beta in peritoneal fibrosisJ.Nephrology,2002，7(5)：216219.12NAIKI Y，MAEDA Y，MATSUO K,et al.Involvement of TGFbeta signal for peritoneal sclerosing in continuous ambulatory peritoneal dialysisJ.J Nephrol,2003，16(1)：95102.13HUNJOO H A，LEE H B.Effect of high g