淺論siRNA反向轉(zhuǎn)染法提高原代懸浮細胞轉(zhuǎn)染效率的應(yīng)用

1、淺論siRNA反向轉(zhuǎn)染法提高原代懸浮細胞轉(zhuǎn)染效率的應(yīng)用 【關(guān)鍵詞】 小干擾RNA； 反向轉(zhuǎn)染法； 正向轉(zhuǎn)染法； 原代細胞； 懸浮細胞RNA干擾（RNA interference, RNAi)是指小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)進入細胞后，按照堿基互補配對原則與靶mRNA完全互補配對，進而引發(fā)靶mRNA的降解、抑制靶基因的表達。RNAi因其對靶基因的沉默具有高度的特異性和強大的抑制作用正越來越多地被應(yīng)用于多種疾病的預(yù)防和治療研究1。siRNA必須進入細胞內(nèi)才能發(fā)揮對基因的沉默作用2，因此，如何將外源性siRNA高效地轉(zhuǎn)入靶細胞就成為基因抑制成功與否的關(guān)鍵。

2、 基因轉(zhuǎn)染的方法很多,如磷酸鈣沉淀法、電穿孔、脂質(zhì)體法、顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。 逆轉(zhuǎn)錄病毒是目前效率最高的轉(zhuǎn)染載體，但由于其價格昂貴，構(gòu)建耗時而不作為實驗的首選。陽離子脂質(zhì)體法是較方便的轉(zhuǎn)染方法之一 3，在各種體外培養(yǎng)細胞的RNA干擾實驗中,多以陽離子脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染，但其對于原代懸浮細胞仍存在轉(zhuǎn)染效率低的問題，故本實驗在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下，運用反向轉(zhuǎn)染法4和傳統(tǒng)正向轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染小鼠脾淋巴細胞，比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率，尋找對原代懸浮細胞更高效的基因轉(zhuǎn)染方法。 1 材料與方法 1.1 實驗材料 810周清潔級 BALB/c 雌性小鼠（揚州大學(xué)比較學(xué)院實驗動物中心），小鼠淋巴細胞分離液（天津灝洋生物

3、制品科技有限公司），RPMI1640培養(yǎng)基，OptiMEM無血清液體培養(yǎng)基（Gibco公司），小牛血清（杭州四季青公司），Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司)，Cy3熒光標(biāo)記的siRNA片段（廣州銳博生物科技有限公司），24孔板（Corning公司）， 熒光倒置顯微鏡（Olympus公司），流式細胞儀（BD公司）。 1.2 研究方法斷頸處死小鼠，75%乙醇浸泡23 min,無菌超凈臺內(nèi)取出脾臟，將200目無菌不銹鋼篩網(wǎng)置于60 mm平皿中，加入適量Hanks液，脾臟剪成碎塊置篩網(wǎng)內(nèi)，無菌玻璃注射器活塞輕柔研磨，使得分散的單細胞透過篩網(wǎng)進入Hanks中；Fico

4、ll密度梯度離心法分離淋巴細胞，用PBS將所得細胞沉淀洗滌兩遍，重懸于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，計數(shù)及臺盼藍染色計算活細胞數(shù)。實驗共分為3組。實驗組采用反向轉(zhuǎn)染法，每孔加Cy3siRNA 1.5 l至不含血清的OptiMEM簡化培養(yǎng)基200 l中稀釋；用前搖勻RNAiMAX, 取3 l至每孔中，與液輕柔混勻成為轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫孵育20 30 min；用不含抗生素的RPMI1640完全培養(yǎng)基稀釋細胞，每孔細胞懸液為400 l，整細胞數(shù)為（11.5）106，加入液中，輕微前后推動平板使其混勻，每組設(shè)復(fù)孔。對照組按照傳統(tǒng)的正向轉(zhuǎn)染法操作，先將細胞在孔板中孵育24 h后再加入轉(zhuǎn)染復(fù)合

5、物，所加物質(zhì)用量及濃度與實驗組完全相同?？瞻捉M未轉(zhuǎn)染siRNA細胞。將3組細胞均置于5 % CO2、37飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，于46 h后更換含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h每組細胞各取1106，分別用0.4 %的臺盼藍染色5 min后,隨機各選取3個視野,顯微鏡下計數(shù)所有細胞。以下列公式計算細胞存活率：細胞活性=(總細胞數(shù)-著色細胞數(shù))/總細胞數(shù)100%。實驗平行重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染后24 h倒置顯微鏡下（1020）每組隨機取3個視野觀察各組細胞，從細胞形態(tài)、細胞膜完整性、細胞數(shù)目等方面評估生存狀態(tài)。轉(zhuǎn)染后24 h，熒光倒置顯微鏡觀察各組Cy3siRNA轉(zhuǎn)染細胞的熒光攜帶率。Cy3為紅

6、色熒光標(biāo)記物，應(yīng)用Cy3siRNA轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細胞后，根據(jù)細胞內(nèi)紅色熒光的數(shù)量來判斷轉(zhuǎn)染陽性細胞的數(shù)量5。于可見光下固定一個視野, 計數(shù)細胞總數(shù), 轉(zhuǎn)換熒光光源計數(shù)攜帶紅色熒光的細胞數(shù),轉(zhuǎn)染效率有熒光表達的細胞數(shù)/細胞總數(shù)100%, 每組選取3孔細胞，每孔細胞隨機選擇5個觀察視野，重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染后24 h實驗組和對照組各取 1106細胞，4 PBS洗細胞2次。流式細胞儀計數(shù)發(fā)紅色光的細胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率。2 結(jié)果2.1 細胞活性測定 細胞轉(zhuǎn)染后24 h臺盼藍拒染率計算結(jié)果顯示：實驗組細胞活性為89.5%，對照組和空白組分別為84.5%和94.9%，3組之間細胞活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.0

7、5）。見圖1。 2.2 細胞生存狀態(tài)觀察 倒置顯微鏡下觀察比較轉(zhuǎn)染后24 h實驗組、對照組和空白組之間細胞生存狀態(tài)，結(jié)果顯示3組無明顯差異。2.3 熒光顯微鏡下細胞熒光表達率 實驗組和對照組細胞內(nèi)均可見紅色熒光，實驗組帶有紅色熒光的細胞數(shù)量明顯多于對照組，空白組無熒光信號；實驗組與對照組經(jīng)重復(fù)實驗得到平均轉(zhuǎn)染率分別為69.58%和39.83%，表明實驗組較對照組轉(zhuǎn)染效率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。見圖2，表1。表1 實驗組和對照組的轉(zhuǎn)染效率（略）2.4 流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染后24 h，實驗組和對照組的Cy3siRNA對小鼠淋巴細胞的轉(zhuǎn)染效率分別為63%和29%，實驗組轉(zhuǎn)染效率明

8、顯高于對照組（P0.05）。見圖3。 3 討論 高效的siRNA轉(zhuǎn)染是研究基因沉默是否成功的前提。目前，RNAi由于轉(zhuǎn)染效率低而成為其發(fā)展的瓶頸并限制其進一步應(yīng)用6。所以選擇最合適的轉(zhuǎn)染方法是整個實驗非常重要的一步。siRNA轉(zhuǎn)染的方法很多，磷酸鈣沉淀法雖然操作簡便，但轉(zhuǎn)染效率低，重復(fù)性差；電穿孔法適用于所有細胞，電壓越高，轉(zhuǎn)染效率越高，而細胞的存活率越低，成功的電穿孔均伴隨高水平的細胞毒性,因此其應(yīng)用受到了限制；DEAE葡聚糖多用于DNA分子的轉(zhuǎn)染，僅限于瞬時轉(zhuǎn)染，且一般只用于BSC1,CV1,COS細胞系；顯微注射法是用微吸管吸取siRNA溶液,在顯微鏡下準(zhǔn)確的插入細胞核中,將siRNA注

9、射進去，轉(zhuǎn)染率高,對細胞無藥物毒害,但是技術(shù)要求高，操作繁瑣耗時,工作效率低,裝置昂貴；陽離子脂質(zhì)體在克服細胞屏障方面與病毒相似，容易透過細胞膜，而且操作簡便，容易實施，在各種體外培養(yǎng)細胞的RNA干擾實驗中得到了廣泛的應(yīng)用，但對于原代細胞、懸浮細胞仍存在轉(zhuǎn)染效率低的情況7；逆轉(zhuǎn)錄病毒法適用于各種細胞，轉(zhuǎn)染效率高，但構(gòu)建病毒載體耗時長且價格昂貴，尤其不適合于有效片段的篩選實驗8，并且需考慮安全因素。以上方法均有其優(yōu)缺點，通過對各種轉(zhuǎn)染方法的綜合考慮，本實驗選用脂質(zhì)體為媒介轉(zhuǎn)染小鼠脾淋巴細胞，基于其在采用傳統(tǒng)正向轉(zhuǎn)染法時對原代懸浮細胞存在轉(zhuǎn)染效率較低的現(xiàn)象，我們應(yīng)用反向轉(zhuǎn)染法克服這一困難，把提高轉(zhuǎn)

10、染效率作為實現(xiàn)高效沉默靶基因的基礎(chǔ)。 轉(zhuǎn)染效率除了由轉(zhuǎn)染方法所決定外，轉(zhuǎn)染細胞狀態(tài)和siRNA劑量、轉(zhuǎn)染試劑的選擇、轉(zhuǎn)染復(fù)合物的孵育時間、培養(yǎng)液中血清和抗生素含量等也是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素。本實驗在以上條件參數(shù)恒定和規(guī)范操作的基礎(chǔ)上，提取小鼠脾淋巴細胞，選用脂質(zhì)體Lipofectamine RNAiMAX介導(dǎo)轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細胞，RNAiMAX比Lipofectamine2000細胞毒性小，轉(zhuǎn)染懸浮細胞效果更好；并用熒光素Cy3標(biāo)記siRNA，使轉(zhuǎn)染情況在鏡下直接可見,從而提高實驗的準(zhǔn)確性。反向轉(zhuǎn)染法與傳統(tǒng)正向轉(zhuǎn)染法的區(qū)別9 是傳統(tǒng)方法需在轉(zhuǎn)染前一天接種細胞鋪板，培養(yǎng)24 h后再加轉(zhuǎn)染復(fù)合物轉(zhuǎn)染

11、；而反向轉(zhuǎn)染則是先加入轉(zhuǎn)染試劑和siRNA混合物在培養(yǎng)板上共同溫育數(shù)十分鐘，然后加入細胞鋪板培養(yǎng)，其優(yōu)點在于：節(jié)約培養(yǎng)時間，淋巴細胞體外存活時間有限，可為轉(zhuǎn)染后檢測提供充足的時間和保持細胞良好的生存狀態(tài)；操作程序簡便，避免傳統(tǒng)正向轉(zhuǎn)染方法培養(yǎng)條件的頻繁變化對細胞表達可能產(chǎn)生的影響；轉(zhuǎn)染效率高，對于原代懸浮細胞可實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染，從而使干擾效果比傳統(tǒng)方法更好。1小時即可完成轉(zhuǎn)染，快速、省時并且操作方便。實驗在轉(zhuǎn)染后24 h臺盼藍染色檢測各組細胞活性、顯微鏡下觀察各組細胞生存狀態(tài)；從熒光顯微鏡及流式細胞儀兩方面檢測轉(zhuǎn)染效率。 在其他實驗條件相同的情況下，實驗組與對照組的轉(zhuǎn)染效率分別為66.5%和34.

12、5%，說明反向轉(zhuǎn)染得到的RNA轉(zhuǎn)染效果比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法更好，對于原代細胞、懸浮細胞這一類難以轉(zhuǎn)染的細胞也能得到較為理想的轉(zhuǎn)染效果，值得一試。同時，轉(zhuǎn)染24 h后實驗組、對照組及空白組臺盼藍染色細胞活性分別為89.5%，84.5%和94.9%，顯微鏡下細胞生存狀態(tài)亦無明顯差異，提示該方法細胞毒性較低，操作過程對細胞損傷較小，對于原代懸浮細胞有著很好的應(yīng)用前景，為siRNA轉(zhuǎn)染原代懸浮細胞及應(yīng)用RANi技術(shù)進行體外研究提供了實驗依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】 1Bi F，Liu N，F(xiàn)an D. Small interfering RNA：a new tool for gene therapyJ. Curr G

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