淺論羅格列酮延緩糖尿病大鼠血管鈣化的發(fā)展

1、淺論羅格列酮延緩糖尿病大鼠血管鈣化的發(fā)展 【摘要】 目的： 觀察羅格列酮對糖尿病大鼠鈣化血管的治療作用及對骨轉(zhuǎn)錄因子Msx2表達(dá)的影響。方法： 在高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射處理的基礎(chǔ)上，加用維生素D3和尼古丁處理，制備糖尿病合并血管鈣化大鼠模型(糖尿病合并血管鈣化組)，給予部分糖尿病合并血管鈣化組大鼠羅格列酮灌胃 (2 mgkg-1，每天1次，共8周)處理，同時(shí)設(shè)立空白對照組。實(shí)驗(yàn)第21周末，處死各實(shí)驗(yàn)組大鼠，檢測各組大鼠的代謝指標(biāo)，進(jìn)行血管 von Kossa染色，檢測血管鈣含量和堿性磷酸酶活性，應(yīng)用realtime PCR方法檢測 Msx2 mRNA 及蛋白免疫印跡方法檢測 Msx

2、2 蛋白在血管中的表達(dá)變化。結(jié)果： 與對照組相比，糖尿病合并血管鈣化組大鼠血管內(nèi)存在彌漫性的鈣鹽沉積，血管內(nèi)鈣含量增高,堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，Msx2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高 (均P0.05);而給予羅格列酮處理后，鈣鹽在血管內(nèi)的沉積明顯減少，鈣含量和堿性磷酸酶活性分別下降8.37%、10.59%，Msx2 mRNA和蛋白表達(dá)也分別下降 36.73 %、 42.55 %(與糖尿病合并血管鈣化組相比,均P0.05)。結(jié)論： 羅格列酮可以延緩糖尿病大鼠血管鈣化的發(fā)展，并可以減少鈣化血管中Msx2的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 2型糖尿病; 血管鈣化; 轉(zhuǎn)錄因子 Msx2; 羅格列酮; 大鼠與非糖尿病患者相

3、比，2型糖尿病患者易于發(fā)生大血管鈣化。血管鈣化是指鈣磷病理性地沉積在血管壁上。根據(jù)其在血管壁上沉積的部位不同，分為內(nèi)膜鈣化和中膜鈣化。目前中膜鈣化已經(jīng)成為心血管疾病死亡率的獨(dú)立預(yù)測因素1。中膜鈣化主要表現(xiàn)為沿中膜彈力層的鈣鹽沉積，導(dǎo)致血管僵硬度增高和順應(yīng)性下降。血管僵硬度的增高則進(jìn)一步導(dǎo)致心臟做功、脈搏壓和脈搏波速度增加，最終引起血管膨脹受損，左室肥厚和冠脈灌注減少。Msx2(msh homeo box homolog 2)是骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2, BMP2)下游的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)控膜內(nèi)成骨的發(fā)生。Cheng等34研究結(jié)果顯示，Msx2可以調(diào)

4、節(jié)血管外膜的成肌纖維細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞表型分化，誘導(dǎo)血管鈣化的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)即通過建立糖尿病合并血管鈣化的大鼠動(dòng)物模型，觀察羅格列酮對于糖尿病大鼠鈣化血管的治療作用及對Msx2表達(dá)的影響。1 材料和方法1.1 材料6周齡雄性 Wistar 大鼠(體質(zhì)量160180 g，30只)購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;鏈脲佐菌素 (streptozotocin, STZ)、維生素D3、尼古丁、鈣檢測試劑盒和堿性磷酸酶活性檢測試劑盒購自美國 Sigma 公司;羅格列酮藥物原粉由中國藥科大學(xué)袁耀佐博士惠贈(zèng);血脂比色法檢測試劑盒購自英國 Randox 公司;血清胰島素放免法檢測試劑盒購自美國 Linco Research

5、公司;BCA 試劑盒購自美國Pierce 公司;Trizol 購自美國 Invitrogen 公司;Prime Script RT reagent 試劑盒和SYBR Premix Ex Taq PCR 試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;realtime PCR 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所;Msx2 山羊抗大鼠多克隆抗體購自美國 Santa Cruz 公司，actin兔抗鼠多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG 和兔抗山羊 IgG 購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司;ECLPlus 檢測試劑盒購自英國 G

6、E Healthcare 公司;所用其它試劑均系市售分析純產(chǎn)品。1.2 動(dòng)物模型制備將30只雄性 Wistar 大鼠隨機(jī)分成3組(對照組、糖尿病合并血管鈣化組和羅格列酮組)，每組各10只。給予糖尿病合并血管鈣化組和羅格列酮組大鼠高脂飼料(50%碳水化合物，20%豬油，10%豆油，11%蛋白質(zhì)，2.5%膽固醇，6.5%纖維和其他物質(zhì))喂養(yǎng)，對照組大鼠予普通飼料喂養(yǎng)。8周后，予糖尿病合并血管鈣化組和羅格列酮組大鼠腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素 (25 mgkg-1)，建立2型糖尿病模型。對照組大鼠予等量檸檬酸鈉溶液腹腔注射。 1周后參照Niederhoffer等報(bào)道的方法，對糖尿病合并血管鈣化組和羅格列

7、酮組大鼠制備鈣化模型：上午8:00給予維生素D3 (300 000 Ukg-1)肌肉注射，尼古丁溶于花生油(質(zhì)量濃度為25 mgkg-1)按5 mlkg-1灌胃，晚上20:00給予尼古丁重復(fù)灌胃1次。予對照組大鼠等量生理鹽水肌肉注射和單純花生油灌胃處理。4周以后，給予羅格列酮組大鼠羅格列酮2 mg(kgd)-1灌胃8周，予糖尿病合并血管鈣化組和對照組大鼠生理鹽水灌胃。于實(shí)驗(yàn)第21周末，注射過量戊巴比妥鈉處死動(dòng)物，經(jīng)心臟采血留取血標(biāo)本，摘取胸、腹主動(dòng)脈用生理鹽水沖洗后稱質(zhì)量，于-80 貯存?zhèn)溆谩?.3 代謝指標(biāo)檢測各組大鼠的血糖 (glucose, Glu) 通過葡萄糖氧化酶法檢測，利用 Ran

8、dox 公司的比色法試劑盒檢測血總膽固醇 (cholesterol, Cho) 和甘油三酯 (triglyceride, TG) 含量，血胰島素 (insulin, Ins) 水平利用Linco公司的放免試劑盒檢測。所有操作重復(fù)3次。1.4 von Kossa染色取大鼠胸主動(dòng)脈段約0.5 cm，在10%福爾馬林溶液中固定后石蠟包埋，制作6 m厚切片，常規(guī)脫蠟、脫水。浸入5%硝酸銀溶液，在日光下照射30 min后用蒸餾水清洗數(shù)遍，將切片置于5%硫代硫酸鈉溶液中1 min后蒸餾水清洗數(shù)遍，用1%伊紅染色復(fù)染數(shù)秒鐘。脫水、透明后封片，光鏡觀察，拍照。1.5 鈣含量和堿性磷酸酶活性檢測取主動(dòng)脈組織(約

9、 10 mg)于 55 徹底烘干，加入 10%甲酸(按 30 lmg-1 組織干重)，4 過夜。按照鈣檢測試劑盒說明書操作，利用比色法檢測血管組織中的鈣含量。取-80 貯存的主動(dòng)脈組織，加入PBS后制備勻漿，12 000g離心10 min，上清液利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測。血管組織中堿性磷酸酶活性按照試劑盒說明書檢測，堿性磷酸酶活性用 硝基苯酚為標(biāo)準(zhǔn)值計(jì)算，1單位表示30 min內(nèi)產(chǎn)生1 nmol硝基苯酚的活性。結(jié)果用蛋白含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。1.6 realtime PCR使用Trizol提取大鼠血管組織中總 RNA，按照Prime Script RT reagent試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成

10、 cDNA。按照 SYBR Premix Ex Taq PCR 試劑盒說明書進(jìn)行realtime PCR反應(yīng)，所用Real Time PCR擴(kuò)增儀為LineGene (Bioer, 杭州博日)。Msx2上游引物為5CCTTCCCTATCAACTCCC3，下游引物為5TACAT GCCATATCCCACC3;GAPDH上游引物為5TAT GATGACATCAAGAAGGTGG3，下游引物為5 CAC CACCCTGTTGCTGTA3。95 5 s，60 20 s，36個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用2CT方法分析。1.7 蛋白免疫印跡(Western blotting)使用蛋白裂解液提取血管組織中總蛋白質(zhì)，

11、用 BCA 試劑盒測定蛋白濃度，將各組蛋白稀釋成等濃度后，進(jìn)行 SDSPAGE 凝膠電泳分離，用BioRad 系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用 5%脫脂奶粉封閉后加入山羊抗大鼠Msx2 抗體( 1200)孵育過夜，洗膜后在辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊 IgG中孵育1 h，最后用ECLPlus檢測試劑盒以 X 線片自顯影顯示結(jié)果。各組 Msx2 蛋白表達(dá)以actin作為對照。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以x-s表示，用單因素方差分析(ANOVA)作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用StudentNewmanKeuls(SNK)方法檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

12、2 結(jié) 果2.1 代謝指標(biāo)結(jié)果見表1。與對照組大鼠相比，高脂飲食加小劑量的鏈脲佐菌素腹腔注射使糖尿病合并血管鈣化組和羅格列酮組大鼠血糖明顯增高(P0.01)，大鼠體質(zhì)量和血胰島素水平則明顯下降(P0.05)。與糖尿病合并血管鈣化組大鼠相比，羅格列酮組大鼠的血糖水平明顯下降(P0.01)，而體質(zhì)量則有所增加(P0.01)，但血胰島素水平無明顯變化。各組大鼠的血總膽固醇和甘油三酯水平無明顯差異。表1 各組大鼠一般生化代謝指標(biāo)比較1)與對照組相比，P0.01; 2)與糖尿病合并血管鈣化組相比，P0.012.2 von Kossa染色von Kossa染色是用來檢測血管中鈣鹽的沉積。在對照組大鼠血管中

13、未見鈣鹽沉積(圖1a)。在糖尿病合并血管鈣化組大鼠血管中，可見全層有明顯的深褐色鈣鹽沉積(圖1b)。而使用8周羅格列酮灌胃處理后，羅格列酮組大鼠的血管中，鈣鹽沉積情況較糖尿病合并血管鈣化組大鼠明顯好轉(zhuǎn)(圖1c)。A.外膜; M.中膜; I.內(nèi)膜a.對照組大鼠血管; b.糖尿病合并血管鈣化組大鼠血管; c.羅格列酮組大鼠血管圖1 大鼠血管von Kossa染色 4002.3 鈣含量和堿性磷酸酶活性檢測2.4 血管中Msx2 mRNA和蛋白的表達(dá)變化 3 討 論糖尿病合并心血管鈣化的發(fā)生率是非糖尿病的4倍。血管鈣化的發(fā)生與否是糖尿病患者預(yù)后的一個(gè)重要預(yù)測因素。有研究1表明，在2型糖尿病患者中，發(fā)生

14、中膜鈣化的患者下肢截肢的風(fēng)險(xiǎn)要增高4倍，同時(shí)發(fā)生心血管病死亡的幾率也會(huì)增高2倍。羅格列酮是噻唑烷二酮(thiazolidinedione,TZD)類治療糖尿病藥物，通過結(jié)合和活化過氧化酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPAR)，調(diào)控脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及其他細(xì)胞中特異基因的表達(dá)，從而提高細(xì)胞對胰島素作用的敏感度，它除了可通過改善糖、脂代謝對防治糖尿病并發(fā)癥有益外，還能抑制糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE) 表達(dá)增加 ，抑制炎癥

15、因子TNF、IL6、IL1表達(dá)，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白激酶活性。 這種抗炎癥特性有助于阻止和治療動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展以及其它的炎癥。本實(shí)驗(yàn)通過在高脂飲食加用小劑量STZ腹腔注射處理的基礎(chǔ)上，加用維生素D3和尼古丁的方法，制備了2型糖尿病合并血管鈣化的大鼠動(dòng)物模型，觀察羅格列酮對糖尿病大鼠血管鈣化的治療作用。我們發(fā)現(xiàn)，無論是糖尿病合并血管鈣化組大鼠，還是羅格列酮組大鼠，其血糖水平都較對照組明顯升高，而血胰島素水平則明顯下降，這一結(jié)果提示，該兩組大鼠都具有了2型糖尿病的基本病理學(xué)特征。進(jìn)一步的血管von Kossa染色結(jié)果顯示，在糖尿病合并血管鈣化組大鼠的血管全層可見彌漫性鈣鹽沉積，同時(shí)該組大鼠血管鈣含量和

16、堿性磷酸酶的活性也較對照組成倍增高。這一結(jié)果提示，糖尿病患者體內(nèi)慢性持續(xù)性的血糖增高可能是血管鈣化發(fā)生發(fā)展的高危因素。在對糖尿病合并血管鈣化的大鼠加用羅格列酮干預(yù)后，我們發(fā)現(xiàn)，在大鼠血糖明顯下降的同時(shí)，血管von Kossa、鈣含量和堿性磷酸酶活性這3項(xiàng)反映血管鈣化的指標(biāo)也較糖尿病合并血管鈣化組大鼠有明顯改善。這一結(jié)果提示，羅格列酮可以通過控制血糖來延緩血管鈣化病變的進(jìn)展。為了進(jìn)一步研究糖尿病血管鈣化發(fā)生的機(jī)制，我們還檢測了鈣化大鼠血管中Msx2 mRNA和蛋白的表達(dá)變化。Msx2基因是同源基因Msh家族成員，在骨形成和成骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用。既往的離體實(shí)驗(yàn)研究顯示，鈣化的大鼠血管平滑

17、肌細(xì)胞中Msx2基因表達(dá)成倍增高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，作為在骨形成過程中一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，Msx2在鈣化的血管內(nèi)大量表達(dá)，這一現(xiàn)象提示血管鈣化是一個(gè)類似于骨形成的、主動(dòng)的過程。Msx2的大量表達(dá)可以引起下游的另一個(gè)骨轉(zhuǎn)錄因子 Osterix表達(dá)增加，并進(jìn)一步引起堿性磷酸酶的表達(dá)增加，最終導(dǎo)致異位的鈣鹽沉積。我們在加用了羅格列酮干預(yù)后，血管內(nèi)Msx2 mRNA和蛋白表達(dá)則明顯下降，這可能與羅格列酮的抗炎癥作用有關(guān)。有研究顯示，炎癥介質(zhì) TNF可以加劇Msx2在血管內(nèi)的表達(dá)。羅格列酮用于降糖治療的同時(shí)，通過其抗炎作用的發(fā)揮，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減少了Msx2的表達(dá) ，對于延緩鈣化的發(fā)展起到了一定的作

18、用。血管鈣化的確切機(jī)制目前還不是十分清楚，并且也無有效的治療方法。我們的研究結(jié)果顯示,糖尿病可以明顯加速血管鈣化的發(fā)生發(fā)展，而降糖藥物羅格列酮可以減緩糖尿病患者血管鈣化的進(jìn)展，這為今后的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)提供了一定的研究基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1LEHTO S,NISKANEN L,SUHONEN M,et al.Medial artery calcification.A neglected harbinger of cardiovascular complications in noninsulindependent diabetes mellitus J.Arteriosclerosis,Th

19、rombosis,and Vascular Biology,1996,16:978983.GUERIN A P,LONDON G M,MARCHAIS S J,et al.Arterial stiffening and vascular calcifications in endstage renal disease J.Nephrol Dial Transplant,2000,15:10141021.CHENG S L,SHAO J S,CHARLTONKACHIGIAN N,et al.Msx2 promotes osteogenesis and suppresses adipogenic

20、 differentiation of multipotent mesenchymal progenitors J.J Biol Chem,2003,278:4596945977.SHAO J S,CHENG S L,PINGSTERHAUS J M,et al.Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals J.J Clin Invest,2005,115:12101220.NIEDERHOFFER N,BOBRYSHEV Y V,LARTAUDIDJOUADIENE I,et al.Aortic calcification produced by vitamin D