白色念珠菌與抑菌效力檢查方法

1、. 白色念珠菌檢查方法1、增菌培養(yǎng)、增菌培養(yǎng) 取供試液取供試液10ml（相當于（相當于供試品供試品1g、ml、10cm2）直接或處理）直接或處理后接種至適量（不少于后接種至適量（不少于100ml）的沙）的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4872小時。小時。2、分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物劃線接種取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)養(yǎng)2448小時（必要時延長至小時（必要時延長至72小小時）。時）。. 結(jié)果判斷 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色偶見淡黃色，基上生長的菌落呈乳白

2、色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。若平板上無菌落生長或生或有皺摺。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。判供試品未檢出白色念珠菌。 .2、如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特、如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選征相符或疑似，應(yīng)挑選23個菌落分別接個菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時（必要時延長至小時（必要時延長至72小時）。若平小時）。

3、若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。品未檢出白色念珠菌。3、若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，、若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于挑取相符或疑似的菌落接種于1%吐溫吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時。小時。取培養(yǎng)物進行染色，鏡檢及芽管試驗。取培養(yǎng)物進行染色，鏡檢及芽管試驗。.4、芽管試驗挑取、芽管試驗挑取1%吐溫吐溫80玉米瓊玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，置濕潤的

4、平皿內(nèi)，置3537、13h，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。短小芽管。5、若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯、若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。判供試品未檢出白色念珠菌。. 抑菌劑效力測定抑菌劑效力測定概述概述 1、抑菌劑效力檢查法系用于測定滅菌、非、抑菌劑效力檢查法系用于測定滅菌、非滅菌制劑中抑菌劑的活性，以評價最終產(chǎn)滅菌制劑中抑菌劑的活性，以評價最終產(chǎn)品的抑菌效力，同時也可用于指導生產(chǎn)企品的抑菌效力，同時也可用于指導生產(chǎn)企業(yè)在制劑研發(fā)階段抑菌劑的確定。業(yè)在制劑研發(fā)階段

5、抑菌劑的確定。 2、如果藥物本身不含有充分的抗菌活性，、如果藥物本身不含有充分的抗菌活性，那么應(yīng)根據(jù)制劑特性（如水溶液制劑）添那么應(yīng)根據(jù)制劑特性（如水溶液制劑）添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常儲存加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常儲存和使用過程中可能發(fā)生微生物污染和大量和使用過程中可能發(fā)生微生物污染和大量繁殖尤其多劑量包裝的制劑，避免因藥物繁殖尤其多劑量包裝的制劑，避免因藥物微生物污染及對患者造成傷害。微生物污染及對患者造成傷害。 . 3、所有抑菌劑都具有一定的毒性，、所有抑菌劑都具有一定的毒性，而且在貯存過程中其有效性有可能因而且在貯存過程中其有效性有可能因藥物的活性成分提高或降低，為保證藥

6、物的活性成分提高或降低，為保證藥品的質(zhì)量和用藥安全，添加防腐劑藥品的質(zhì)量和用藥安全，添加防腐劑的量應(yīng)根據(jù)制劑本身是否具抗菌活性，的量應(yīng)根據(jù)制劑本身是否具抗菌活性，保持最低有效量并在藥品包裝上注明保持最低有效量并在藥品包裝上注明添加抑菌劑的名稱和數(shù)量。添加抑菌劑的名稱和數(shù)量。. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 1、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基 2、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基 3、 沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基 . 培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基的適用性檢查 菌種 銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosa） 金黃色葡萄球菌（staphycococcus） 白色念球菌

7、（Candida albicans） 黑曲霉（Aspergillus niger） 大腸埃希菌（Escherichia Coli） 菌液的制備同控制菌培養(yǎng)基適用性檢查. 適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌各菌各50100cfu，分別注入無菌平皿中，立即，分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酷胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行傾注胰酷胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備制備2個平皿，混勻，凝固，置個平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分別注入無菌平皿中，立

8、即傾注沙氏，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平個平皿，混勻，凝固，置皿，混勻，凝固，置2025培養(yǎng)培養(yǎng)72小時，計小時，計數(shù)；同時，用對應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)數(shù)；同時，用對應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。基進行上述試驗。. 結(jié)果判定結(jié)果判定 被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基菌被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比大于落數(shù)相比大于70%，菌落形態(tài)大小應(yīng)，菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。. 抑菌劑效力測定抑菌劑效

9、力測定 供試品分類供試品分類 為了達到試驗?zāi)康?，根?jù)供試品的給藥為了達到試驗?zāi)康?，根?jù)供試品的給藥途徑和用途將供試品分為四類，以便標途徑和用途將供試品分為四類，以便標準的制定和執(zhí)行，但對于一些抗酸性制準的制定和執(zhí)行，但對于一些抗酸性制劑和含活生物制劑應(yīng)考慮會降低有益菌劑和含活生物制劑應(yīng)考慮會降低有益菌的生物活性。見表的生物活性。見表. 表表 產(chǎn)品分類產(chǎn)品分類 類別類別 藥藥 品品 1 類類 注射劑、其他非腸道制劑，包括乳劑、注射劑、其他非腸道制劑，包括乳劑、 耳用耳用 制劑、無菌鼻用制劑及眼用制劑制劑、無菌鼻用制劑及眼用制劑 2 類類 局部給藥制劑、非滅菌鼻用制劑及用于局部給藥制劑、非滅菌鼻用

10、制劑及用于 黏膜的乳劑黏膜的乳劑 3 類類 口服非固體制劑（非抗酸制劑）口服非固體制劑（非抗酸制劑） 4 類類 非固體抗酸制劑非固體抗酸制劑. 菌種和菌液的制備同培養(yǎng)基適用性檢查菌種和菌液的制備同培養(yǎng)基適用性檢查 供試品接種供試品接種 1、抑菌劑效力可能受試驗用容器特征的影響，如、抑菌劑效力可能受試驗用容器特征的影響，如容器的材質(zhì)、形狀、體積及封口的方式等。因此，容器的材質(zhì)、形狀、體積及封口的方式等。因此，只要供試品每個包裝容器的裝量足夠試驗用，同只要供試品每個包裝容器的裝量足夠試驗用，同時容器便于按無菌操作的接入試驗菌液、混合及時容器便于按無菌操作的接入試驗菌液、混合及取樣等，一般應(yīng)將試驗菌

11、直接接種于供試品原包取樣等，一般應(yīng)將試驗菌直接接種于供試品原包裝容器中進行貯存。裝容器中進行貯存。 . 2、若因供試品的性狀或每個容器裝量、若因供試品的性狀或每個容器裝量等因素需將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器時，等因素需將供試品轉(zhuǎn)移至無菌容器時，該容器的材質(zhì)不得影響供試品的特性該容器的材質(zhì)不得影響供試品的特性（如吸附作用），特別應(yīng)注意不得影（如吸附作用），特別應(yīng)注意不得影響供試品的響供試品的PH，PH對抑菌劑的活性影對抑菌劑的活性影響很大，同時容器的口徑大小應(yīng)便于響很大，同時容器的口徑大小應(yīng)便于供試品的進出及混勻。供試品的進出及混勻。.3、 取包裝完整的供試品至少取包裝完整的供試品至少5份，直接接份，

12、直接接種試驗菌，或取適量供試品分別轉(zhuǎn)移至種試驗菌，或取適量供試品分別轉(zhuǎn)移至5個適宜的無菌容器中（若試驗菌侏數(shù)超過個適宜的無菌容器中（若試驗菌侏數(shù)超過5株，應(yīng)增加相應(yīng)的供試品份數(shù)），每一株，應(yīng)增加相應(yīng)的供試品份數(shù)），每一容器接種一個試驗菌。容器接種一個試驗菌。.4、1、2、3類供試品類供試品1g或或1ml接種菌量為接種菌量為105106cfu，4類供試品中類供試品中1g或或1ml接接種菌量為種菌量為106108cfu，接種菌液的體積，接種菌液的體積不得超過供試品體積的不得超過供試品體積的05%1% ，充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布。充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布。5、將接種的供試品在

13、試驗期間置、將接種的供試品在試驗期間置2025，避光貯存，貯存溫度的變化應(yīng)盡，避光貯存，貯存溫度的變化應(yīng)盡可能控制在最小范圍，并防止被污染。可能控制在最小范圍，并防止被污染。. 存活菌數(shù)測定存活菌數(shù)測定 由于供試品中含有抑菌活性，所以菌數(shù)由于供試品中含有抑菌活性，所以菌數(shù)測定方法應(yīng)進行驗證。根據(jù)菌數(shù)測定結(jié)測定方法應(yīng)進行驗證。根據(jù)菌數(shù)測定結(jié)果，計算果，計算1ml(g)供試品各試驗菌所加的供試品各試驗菌所加的菌數(shù)及各間隔時間的菌數(shù)，并換算成菌數(shù)及各間隔時間的菌數(shù)，并換算成lg值。值。. 測定細菌用胰酷胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，測定真菌測定細菌用胰酷胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用沙氏葡萄

14、糖瓊脂培養(yǎng)基 根據(jù)產(chǎn)品類型，在規(guī)定的接種時間，分別從上述根據(jù)產(chǎn)品類型，在規(guī)定的接種時間，分別從上述每個容器中取供試每個容器中取供試ml(g)，用，用pH7.0無菌氯化鈉無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成蛋白胨緩沖液稀釋成1：10、1：102、1：103等稀釋級。等稀釋級。 . 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 1、抑菌劑效力根據(jù)各間隔時間測定的菌數(shù)、抑菌劑效力根據(jù)各間隔時間測定的菌數(shù)1.0 lg值相對于初始值（值相對于初始值（0時菌數(shù)時菌數(shù)1.0 lg值）值）減少程度進行評價（見表），試驗結(jié)果按有減少程度進行評價（見表），試驗結(jié)果按有效數(shù)字的修約規(guī)則進舍，保留一位小數(shù)點。效數(shù)字的修約規(guī)則進舍，保留一位小數(shù)點。結(jié)果

15、符合表，要求可判斷該產(chǎn)品抑菌效力符結(jié)果符合表，要求可判斷該產(chǎn)品抑菌效力符合規(guī)定。合規(guī)定。 . 表 防腐劑抗菌效力標準 1 類類 供供 試試 品品 細細 菌菌 7天菌數(shù)下降不少于天菌數(shù)下降不少于1.0 lg，14天菌數(shù)下降天菌數(shù)下降 不少于不少于3.0 lg ，第，第14天到天到28天菌數(shù)不增加。天菌數(shù)不增加。 真真 菌菌 與初始值比，到與初始值比，到7、14、28天菌數(shù)均不增加。天菌數(shù)均不增加。 2 類供類供 試試 品品 細細 菌菌 14天菌數(shù)下降不少于天菌數(shù)下降不少于2.0 lg ， 14天到天到28天菌數(shù)天菌數(shù) 不增加。不增加。 真真 菌菌 與初始值比，到與初始值比，到14、28天菌數(shù)均不

16、增加。天菌數(shù)均不增加。 3 類類 供供 試試 品品 細細 菌菌 14天菌數(shù)下降不少于天菌數(shù)下降不少于1.0 lg ， 14天到天到28天菌數(shù)均不增加。天菌數(shù)均不增加。 真真 菌菌 與初始值比，與初始值比，14、28天菌數(shù)均不增加。天菌數(shù)均不增加。 4 類類 供供 試試 品品 細菌，真細菌，真 菌菌 與初始值比，與初始值比，14、28天菌數(shù)均不增長。天菌數(shù)均不增長。注注：1、表中、表中“不增加不增加”是指對前一個測定時間，試驗菌增加的數(shù)量不超過是指對前一個測定時間，試驗菌增加的數(shù)量不超過0.5 lg。 2、0時菌數(shù)時菌數(shù) 供試品加入試驗菌，搖勻，立即取樣檢查，培養(yǎng)，計數(shù)，為供試品加入試驗菌，搖勻，立即取樣檢查，培養(yǎng)，計數(shù)，為0時時 . 舉 例1、 氯化鈉注射液、氯化鈉注射液、 碳酸氫鈉注射液不含抑菌劑加入碳酸氫鈉注射液不含抑菌劑加入菌從初始到菌從初始到6h就開始無限增加，不具抑菌力，抗病就開始無限增加，不具抑菌力，抗病毒口服液從初始到毒口服液從初始到24 h對數(shù)值無變化，對數(shù)值無變化，72h后明顯后明顯降低，具一定的抑菌力。降低，具一定的抑菌力。2、呋麻滴鼻液、硫糖鋁混懸液、阿昔洛韋滴眼液、鯨、呋麻滴鼻液、硫糖鋁混懸液、阿昔洛韋滴眼液、鯨脂滴耳液、潔爾陰洗液從初始值到脂滴耳液、潔爾陰洗液從初始值到7天后計算值大于天后計算值