轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)

1、Shanghai Jiao Tong University交流的主要內(nèi)容交流的主要內(nèi)容全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植情況國(guó)際、國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因生物安全管理轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)核酸DNA提取SGS GMO檢測(cè)報(bào)告解讀Shanghai Jiao Tong University全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植情況全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植情況Shanghai Jiao Tong University1996-20111996-2011年全球轉(zhuǎn)基因作物增長(zhǎng)趨勢(shì)年全球轉(zhuǎn)基因作物增長(zhǎng)趨勢(shì)1.48億公頃，占全球農(nóng)作物種植面積的10%Shanghai Jiao Tong University主要轉(zhuǎn)基因作物種植情況主要轉(zhuǎn)基因作物種植情況大豆大豆玉

2、米玉米棉花棉花油菜油菜Shanghai Jiao Tong University主要轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植比例主要轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植比例常規(guī)作物常規(guī)作物轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)基因作物Shanghai Jiao Tong University轉(zhuǎn)基因農(nóng)作的主要性狀轉(zhuǎn)基因農(nóng)作的主要性狀Shanghai Jiao Tong University轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植分布轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植分布2010年全球轉(zhuǎn)基因植物面積達(dá)到1.48億公頃,涉及24種作物184個(gè)品系，種植國(guó)家有29個(gè)，發(fā)達(dá)國(guó)家占10個(gè)。共有59個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因作物的種植和進(jìn)口，包括美國(guó)、日本、加拿大、墨西哥、澳大利亞、南非、歐盟、中國(guó)等。玉米最多有60個(gè)品系批準(zhǔn)

3、應(yīng)用，其次是棉花（35）、油菜（15）、大豆（14）。Shanghai Jiao Tong University國(guó)際、國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因國(guó)際、國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因生物生物安全管理安全管理Shanghai Jiao Tong University國(guó)際組織對(duì)轉(zhuǎn)基因生物安全管理國(guó)際組織對(duì)轉(zhuǎn)基因生物安全管理國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC） 聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）于1963年聯(lián)合創(chuàng)立的，其職責(zé)在于保護(hù)消費(fèi)者健康，保證開(kāi)展公正的食品貿(mào)易和協(xié)調(diào)所有食品標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。最早提出應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)分析原則進(jìn)行食品安全管理。165個(gè)成員國(guó)。 1999年食品法典委員會(huì)建立了政府間特設(shè)生物技術(shù)食品工作組,在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域制定風(fēng)

4、險(xiǎn)分析原則和指南在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域制定風(fēng)險(xiǎn)分析原則和指南 2000年發(fā)布了關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物性食物的健康安全性問(wèn)題的文件，運(yùn)用“實(shí)質(zhì)等同性實(shí)質(zhì)等同性”概念建立有效的安全性評(píng)估框架。Shanghai Jiao Tong University 并于2003年7月1日，在羅馬召開(kāi)的聯(lián)合國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)署會(huì)議上，國(guó)際食品法典委員會(huì)通過(guò)了三項(xiàng)有關(guān)生物技術(shù)食品的原則和準(zhǔn)則，即 “現(xiàn)代生物技術(shù)食品風(fēng)險(xiǎn)分析原則”（CAC/GL44-2003） “重組DNA植物食品安全評(píng)估準(zhǔn)則”（CAC/GL45-2003） “重組DNA微生物食品安全評(píng)估準(zhǔn)則”（CAC/GL46-2003） 食品法典委員會(huì)設(shè)立了食品標(biāo)簽法規(guī)委員會(huì)(The C

5、odex Committee on Food Labelling ，CCFL) 2006年CCFL第34屆會(huì)議上通過(guò)建議一個(gè)實(shí)體工作組（physical Working Group）討論轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)的主要問(wèn)題國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）Shanghai Jiao Tong University經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD） 經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織，簡(jiǎn)稱(chēng)經(jīng)合組織（OECD），是由34個(gè)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)國(guó)家組成的政府間國(guó)際經(jīng)濟(jì)組織，旨在共同應(yīng)對(duì)全球化帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和政府治理等方面的挑戰(zhàn)，并把握全球化帶來(lái)的機(jī)遇。 1986年，藍(lán)皮書(shū)重組DNA安全性考慮 轉(zhuǎn)基因生物總體指南1992年，生物技術(shù)安全性考慮199

6、2 明確生物安全的概念和原則 1992年，生物技術(shù)作物田間試驗(yàn)安全考慮 確定分階段原則和個(gè)案原則1993年，現(xiàn)代生物技術(shù)加工食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估概念和原理實(shí)質(zhì)等同原則 ，現(xiàn)在有67個(gè)國(guó)家把這一原則作為轉(zhuǎn)基因食品安全評(píng)估的基本原則。1995年以來(lái)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估信息共享，已出版65個(gè)生物安全共識(shí)文件 Shanghai Jiao Tong University國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization, ISO)是一個(gè)全球性的非政府組織，1946年成立于瑞士日內(nèi)瓦,負(fù)責(zé)制定在世界范圍內(nèi)通用的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn), ISO現(xiàn)有117個(gè)成員，包括117個(gè)國(guó)家和地

7、區(qū)。ISO轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)委員會(huì)（ISO TC34/SC16），主管轉(zhuǎn)基因食品國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的制修訂工作。技術(shù)委員會(huì)負(fù)責(zé)起草國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)一致的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)消除現(xiàn)存的貿(mào)易壁壘，推進(jìn)國(guó)際商品和服務(wù)的交流。目前為止，ISO制訂6個(gè)轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。Shanghai Jiao Tong University轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測(cè)ISO標(biāo)準(zhǔn)一般性原則和要求蛋白檢測(cè)采樣核酸檢測(cè)核酸提取定性PCR檢測(cè)定量PCR檢測(cè)核酸檢測(cè)方法增補(bǔ)原則ISO 24276:2006，General requirements and definitions ISO 21571:2005Nucleic acid extraction

8、 ISO 21570:2005 Quantitative nucleic acid based methods ISO 21572:2004Protein based method ISO/TS 21098:2005 Information to be supplied and procedure for the addition of methods toISO 21569,ISO 21570 orISO 21571 prEN ISO 21568:2005Sampling21569:2005Qualitative nucleic acid based methods Shanghai Jia

9、o Tong University發(fā)達(dá)國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物安全管理規(guī)定各國(guó)均以風(fēng)險(xiǎn)分析為基礎(chǔ)，理念、內(nèi)容、方法無(wú)明顯差異，不各國(guó)均以風(fēng)險(xiǎn)分析為基礎(chǔ)，理念、內(nèi)容、方法無(wú)明顯差異，不同的戰(zhàn)略選擇和政策導(dǎo)向形成不同的管理模式同的戰(zhàn)略選擇和政策導(dǎo)向形成不同的管理模式 美國(guó)模式美國(guó)模式，以產(chǎn)品為基礎(chǔ)，風(fēng)險(xiǎn)分析中應(yīng)用，以產(chǎn)品為基礎(chǔ)，風(fēng)險(xiǎn)分析中應(yīng)用“可靠科學(xué)原可靠科學(xué)原則則” 只要在科學(xué)上無(wú)法證明它有危險(xiǎn)性，就不應(yīng)該限制只要在科學(xué)上無(wú)法證明它有危險(xiǎn)性，就不應(yīng)該限制 歐盟模式歐盟模式，以過(guò)程為基礎(chǔ)，風(fēng)險(xiǎn)分析中應(yīng)用預(yù)防原則，以過(guò)程為基礎(chǔ)，風(fēng)險(xiǎn)分析中應(yīng)用預(yù)防原則 只要不能否定其危險(xiǎn)性，就應(yīng)該限制只要不能否定其危險(xiǎn)性，就

10、應(yīng)該限制 日本模式日本模式，以過(guò)程為基礎(chǔ)，風(fēng)險(xiǎn)分析中應(yīng)用，以過(guò)程為基礎(chǔ)，風(fēng)險(xiǎn)分析中應(yīng)用“可靠科學(xué)可靠科學(xué)”美、歐、日等，重視轉(zhuǎn)基因生物的安全管理，通過(guò)立法美、歐、日等，重視轉(zhuǎn)基因生物的安全管理，通過(guò)立法和技術(shù)指南規(guī)范研發(fā)和應(yīng)用行為和技術(shù)指南規(guī)范研發(fā)和應(yīng)用行為Shanghai Jiao Tong University歐盟轉(zhuǎn)基因生物安全管理歐盟轉(zhuǎn)基因生物安全管理法律體系分為指令Directive和法規(guī)Regulation兩個(gè)層次，頒布的法令在各國(guó)采納后對(duì)采納的國(guó)家有效，頒布的法規(guī)則直接有效。按照預(yù)防原則對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行單獨(dú)立法管理按照預(yù)防原則對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行單獨(dú)立法管理歐洲食品安全局負(fù)責(zé)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，

11、歐洲食品安全局負(fù)責(zé)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，負(fù)責(zé)GMOs的審批和市場(chǎng)投放,實(shí)施從農(nóng)田到餐桌的實(shí)施從農(nóng)田到餐桌的的各環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)監(jiān)控，控，保證轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的可追溯性Shanghai Jiao Tong Universityl指令指令2001/18/EC轉(zhuǎn)基因生物有意環(huán)境釋放轉(zhuǎn)基因生物有意環(huán)境釋放規(guī)范任何可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因生物與環(huán)境接觸行為規(guī)范任何可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因生物與環(huán)境接觸行為l法規(guī)法規(guī)1829/2003/EC轉(zhuǎn)基因食品和飼料管理?xiàng)l例轉(zhuǎn)基因食品和飼料管理?xiàng)l例轉(zhuǎn)基因食品審批和執(zhí)行制度轉(zhuǎn)基因食品審批和執(zhí)行制度l法規(guī)法規(guī)1830/2003/EC轉(zhuǎn)基因生物追溯性及標(biāo)識(shí)辦法轉(zhuǎn)基因生物追溯性及標(biāo)識(shí)辦法以及含轉(zhuǎn)基因生物成分的食品及飼

12、料產(chǎn)品的追溯性以及含轉(zhuǎn)基因生物成分的食品及飼料產(chǎn)品的追溯性管理?xiàng)l例管理?xiàng)l例轉(zhuǎn)基因食品追蹤和標(biāo)識(shí)制度轉(zhuǎn)基因食品追蹤和標(biāo)識(shí)制度歐盟法規(guī)歐盟法規(guī)Shanghai Jiao Tong University美國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全管理美國(guó)轉(zhuǎn)基因生物安全管理1976年，國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）重組DNA分子研究指南全球首個(gè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全管理法規(guī) 全球首個(gè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全管理法規(guī)，對(duì)重組DNA研究項(xiàng)目的進(jìn)行審查、評(píng)價(jià)和監(jiān)控1986年頒布了生物技術(shù)法規(guī)協(xié)調(diào)框架 將基因工程工作納入現(xiàn)有法規(guī)進(jìn)行管理，由農(nóng)業(yè)部、環(huán)保署和食品藥品管理局在現(xiàn)有的法規(guī)框架下協(xié)調(diào)管理轉(zhuǎn)基因生物。Shanghai Jiao Tong Univers

13、ity農(nóng)業(yè)部（USDA），管理目的是確保轉(zhuǎn)基因生物（GMOs）的安全種植。有兩個(gè)機(jī)構(gòu)涉及該項(xiàng)工作，即：動(dòng)植物檢疫局（APHIS）和食品安全及檢查局（FSIS）。環(huán)保署（EPA），負(fù)責(zé)管理轉(zhuǎn)基因生物的環(huán)境釋放。依照聯(lián)邦殺蟲(chóng)劑、殺菌劑、殺鼠劑法、聯(lián)邦食品、藥物和化妝品法對(duì)殺蟲(chóng)劑（包括植物殺蟲(chóng)劑，即轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)、抗病基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)）進(jìn)行管理。具體負(fù)責(zé)殺蟲(chóng)劑對(duì)農(nóng)業(yè)的影響和確定或免除殺蟲(chóng)劑在食品中最高殘留量的管理。食品與藥物管理局（FDA），依照聯(lián)邦食品、藥物和化妝品法，負(fù)責(zé)食品和食品添加劑的安全管理，確保所轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的蛋白質(zhì)對(duì)人類(lèi)健康的安全。-負(fù)責(zé)食品標(biāo)識(shí)管理負(fù)責(zé)食品標(biāo)識(shí)管理。美國(guó)管理部門(mén)美國(guó)管理部門(mén)Sh

14、anghai Jiao Tong University日本轉(zhuǎn)基因生物管理、法規(guī)日本轉(zhuǎn)基因生物管理、法規(guī)日本在1979年制定了重組DNA實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例，開(kāi)始生物技術(shù)的安全管理。所涉及的部門(mén)主要是科學(xué)技術(shù)廳、通產(chǎn)省、農(nóng)林水產(chǎn)省和厚生勞動(dòng)省?？茖W(xué)技術(shù)廳：依照重組DNA實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則，規(guī)范實(shí)驗(yàn)室和封閉溫室的研究，負(fù)責(zé)審批試驗(yàn)階段的重組DNA研究。厚生勞動(dòng)省（MHLW)：依照重組DNA準(zhǔn)則，負(fù)責(zé)對(duì)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)藥品和食品的管理-食用安全。通產(chǎn)省（MITI)。：依照遺傳工程體工業(yè)化準(zhǔn)則，對(duì)將重組DNA技術(shù)的成果應(yīng)用于工業(yè)化活動(dòng)進(jìn)行管理-飼料安全。農(nóng)林水產(chǎn)省（MAFF）：依照農(nóng)、林、漁及食品工業(yè)應(yīng)用重組DNA準(zhǔn)

15、則負(fù)責(zé)管理GMO在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、漁業(yè)和食品工業(yè)中應(yīng)用-環(huán)境、飼料安全。MAFF和MHLW分別頒布了食品標(biāo)識(shí)體系，規(guī)范轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識(shí)標(biāo)準(zhǔn)。Shanghai Jiao Tong University中國(guó)法律法規(guī)和制度要求中國(guó)法律法規(guī)和制度要求特點(diǎn)：特點(diǎn)：與國(guó)際組織及多數(shù)國(guó)家的理念、與國(guó)際組織及多數(shù)國(guó)家的理念、要求、做法一致要求、做法一致中國(guó)生物安全網(wǎng)， Shanghai Jiao Tong University 2001年，國(guó)務(wù)院年，國(guó)務(wù)院農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例 2002年，農(nóng)業(yè)部年，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)辦法農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)辦法 2002年，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物

16、進(jìn)口管理辦法年，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口管理辦法 2002年，年， 農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法 2006年，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物加工審批辦法年，農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物加工審批辦法 2004年，年， 質(zhì)檢總局質(zhì)檢總局進(jìn)出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫管理辦法進(jìn)出境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫管理辦法 一個(gè)條例，5個(gè)辦法規(guī)范了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)、進(jìn)口安全管理、標(biāo)識(shí)管理、加工審批、產(chǎn)品進(jìn)出境檢驗(yàn)檢疫工作，形成了一整套適合我國(guó)國(guó)情并與國(guó)際接軌的法律法規(guī)、技術(shù)規(guī)程和管理體系。我國(guó)的法律法規(guī)制度我國(guó)的法律法規(guī)制度Shanghai Jiao Tong UniversityShanghai Jiao Tong Univ

17、ersity 國(guó)務(wù)院部際聯(lián)席會(huì)議，國(guó)務(wù)院部際聯(lián)席會(huì)議，由農(nóng)業(yè)、科技、環(huán)由農(nóng)業(yè)、科技、環(huán)境保護(hù)、衛(wèi)生、外經(jīng)貿(mào)、檢驗(yàn)檢疫等有關(guān)境保護(hù)、衛(wèi)生、外經(jīng)貿(mào)、檢驗(yàn)檢疫等有關(guān)部門(mén)負(fù)責(zé)人組成。部門(mén)負(fù)責(zé)人組成。 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全領(lǐng)導(dǎo)小組農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全領(lǐng)導(dǎo)小組 農(nóng)業(yè)部科技教育司（農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生農(nóng)業(yè)部科技教育司（農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室）物安全領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室） 國(guó)家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會(huì)及其秘書(shū)國(guó)家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會(huì)及其秘書(shū)處處管理機(jī)構(gòu)管理機(jī)構(gòu)Shanghai Jiao Tong University農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心（農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管中心、農(nóng)

18、（農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管中心、農(nóng)業(yè)部植物新品種測(cè)試中心），承辦國(guó)家生物安全專(zhuān)家委員會(huì)秘書(shū)業(yè)部植物新品種測(cè)試中心），承辦國(guó)家生物安全專(zhuān)家委員會(huì)秘書(shū)處的日常聯(lián)絡(luò)工作，是全國(guó)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)秘書(shū)處掛靠處的日常聯(lián)絡(luò)工作，是全國(guó)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)秘書(shū)處掛靠單位單位 ，全國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系和機(jī)構(gòu)能力建設(shè)、檢測(cè)監(jiān)測(cè)，全國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系和機(jī)構(gòu)能力建設(shè)、檢測(cè)監(jiān)測(cè)-農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心等。等。基因安全管理處基因安全管理處，負(fù)責(zé)生物安全評(píng)價(jià)，負(fù)責(zé)生物安全評(píng)價(jià)等具體技術(shù)工作，承辦兩個(gè)秘書(shū)處及等具體技術(shù)工作，承辦兩個(gè)秘書(shū)處及生物安全網(wǎng)的具體事務(wù)。生物安全

19、網(wǎng)的具體事務(wù)。農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全檢定處農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全檢定處，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系及機(jī)構(gòu)能力建設(shè)、檢測(cè)基因檢測(cè)體系及機(jī)構(gòu)能力建設(shè)、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、全國(guó)性監(jiān)測(cè)的具體技術(shù)工作。標(biāo)準(zhǔn)、全國(guó)性監(jiān)測(cè)的具體技術(shù)工作。技術(shù)支撐機(jī)構(gòu)技術(shù)支撐機(jī)構(gòu)Shanghai Jiao Tong University技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)Shanghai Jiao Tong University轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù)Shanghai Jiao Tong University全球主要國(guó)家轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)管理情況全球主要國(guó)家轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)管理情況國(guó)家國(guó)家/地區(qū)地區(qū)標(biāo)識(shí)類(lèi)別標(biāo)識(shí)類(lèi)別標(biāo)識(shí)閾值標(biāo)識(shí)閾值國(guó)家國(guó)家/地區(qū)地區(qū) 標(biāo)識(shí)類(lèi)

20、別標(biāo)識(shí)類(lèi)別標(biāo)識(shí)閾值標(biāo)識(shí)閾值中國(guó)強(qiáng)制0%印度尼西亞強(qiáng)制性5%歐盟強(qiáng)制性0.9%臺(tái)灣強(qiáng)制性5%俄羅斯強(qiáng)制性0.9%泰國(guó)強(qiáng)制性5新西蘭強(qiáng)制性1%菲律賓自愿性5%巴西強(qiáng)制性1%泰國(guó)強(qiáng)制性5沙特強(qiáng)制性1%加拿大自愿性5韓國(guó)強(qiáng)制性3%中國(guó)香港自愿性5%日本強(qiáng)制性5%南非自愿無(wú)具體說(shuō)明以色列強(qiáng)制性1%阿根廷自愿性無(wú)具體說(shuō)明智利強(qiáng)制性2%美國(guó)自愿性無(wú)具體說(shuō)明Shanghai Jiao Tong University如何進(jìn)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)？如何進(jìn)行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)？ 染色體水平 轉(zhuǎn)錄組水平 蛋白組水平 代謝組水平GMNon-GM？Shanghai Jiao Tong University轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)一般流程

21、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)一般流程Shanghai Jiao Tong University提取核酸或蛋白質(zhì)核酸檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)或定性定性PCR定量定量PCR芯片檢測(cè)芯片檢測(cè)核酸測(cè)序核酸測(cè)序側(cè)向流動(dòng)側(cè)向流動(dòng)試紙條試紙條酶聯(lián)免疫酶聯(lián)免疫吸附吸附轉(zhuǎn)基因生物檢測(cè)Shanghai Jiao Tong University基于蛋白的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法基于蛋白的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法1.酶聯(lián)免疫吸附法（酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為結(jié)合物（conjugate

22、）；（3）酶反應(yīng)的底物。最常見(jiàn)的檢測(cè)方法是夾心法 Shanghai Jiao Tong University將樣品提取液加入包被有目標(biāo)蛋白抗體的微孔將樣品提取液加入包被有目標(biāo)蛋白抗體的微孔板中，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的外源蛋白的抗體與被板中，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的外源蛋白的抗體與被檢測(cè)樣品中的外源蛋白結(jié)合。檢測(cè)樣品中的外源蛋白結(jié)合。加入用酶（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的目加入用酶（辣根過(guò)氧化物酶）標(biāo)記的目標(biāo)蛋白抗體，抗原抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合。標(biāo)蛋白抗體，抗原抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合。洗滌以后，加入底物顯色。辣根過(guò)氧化洗滌以后，加入底物顯色。辣根過(guò)氧化物酶催化底物成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反物酶催化底物成有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的

23、程度進(jìn)行該抗原的定性或定量分析。應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量分析。ELISA檢測(cè)基本原理標(biāo)記有蛋白抗體的酶標(biāo)板標(biāo)記有蛋白抗體的酶標(biāo)板Shanghai Jiao Tong University根據(jù)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)外源蛋白標(biāo)準(zhǔn)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線Shanghai Jiao Tong University根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理工作。2 2、側(cè)向流動(dòng)型免疫試紙條方法、側(cè)向流動(dòng)型免疫試紙條方法Shanghai Jiao Tong University快速檢測(cè)試紙條法應(yīng)用了雙抗體夾心法，首先將CP4 EPSPS蛋白特異的抗體，偶連于顯色試劑，并參入試紙條。當(dāng)試紙條被插入含有CP4 EPS

24、PS蛋白的植物組織的小量萃取物時(shí)，偶連抗體與蛋白之間就發(fā)生了結(jié)合，與偶連于顯色試劑上的某些但不是全部抗體形成夾心物。膜片含有兩個(gè)捕獲區(qū)，一個(gè)捕獲區(qū)可捕獲結(jié)合的CP4 EPSPS蛋白，另一個(gè)捕獲區(qū)可捕獲顯色試劑。當(dāng)夾心物和未反應(yīng)的顯色試劑被膜片上的特定區(qū)捕獲時(shí)，這些捕獲區(qū)就顯現(xiàn)出紅色。若膜片上僅存在一條紅色對(duì)照線，便說(shuō)明受檢樣品為陰性樣品，若存在兩條線，便說(shuō)明受檢樣品為陽(yáng)性樣品。Shanghai Jiao Tong University蛋白檢測(cè)試劑盒蛋白檢測(cè)試劑盒Shanghai Jiao Tong University蛋白檢測(cè)特點(diǎn)蛋白檢測(cè)特點(diǎn)ELISA具備了酶反應(yīng)的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的特異

25、性，具有簡(jiǎn)便、快速、費(fèi)用低等特點(diǎn)，但易出現(xiàn)本底過(guò)高的問(wèn)題，且只能檢測(cè)目的蛋白抗原性沒(méi)有明顯變化的粗加工產(chǎn)品。側(cè)向流動(dòng)免疫測(cè)定試紙條是一種很快速簡(jiǎn)便的定性檢測(cè)方法，將試紙條放在待測(cè)樣品抽提物中，510分鐘就可得出結(jié)果，不需要特殊儀器和熟練技能。但一種試紙條只能檢測(cè)一種蛋白質(zhì)，且只能檢測(cè)有無(wú)存在外源蛋白而不能區(qū)分具體的轉(zhuǎn)基因品種。Shanghai Jiao Tong University基于核酸的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法基于核酸的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法35S promoterNOS terminatorCaMVAgrobacterium tumefaciens檢測(cè)主要依據(jù)是目的DNA鏈與特定的生物大分子結(jié)合或者與特

26、異序列的雜交目的DNA主要由具有特定功能的基因及其相應(yīng)的調(diào)控元件組成。 Shanghai Jiao Tong University核酸檢測(cè)方法策略核酸檢測(cè)方法策略啟動(dòng)子基因內(nèi)含子終止子篩選檢測(cè)基因特異性檢測(cè)構(gòu)建特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)低植物基因組高Arne HA et al., Euro Food Res Tech, 2007植物基因組Shanghai Jiao Tong UniversityTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCAT

27、AGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTADNA模板+ 引物 +三磷酸脫氧核苷酸+Taq DNA聚合酶+PCR反應(yīng)緩沖液（鹽離子）定性定性PCR檢測(cè)方法原理

28、檢測(cè)方法原理Shanghai Jiao Tong UniversityNovember 8th 200442TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAG

29、CTAAACTAGCTAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep 1 : 變性94C Shanghai Jiao Tong UniversityTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACA

30、TCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep 2 : 退火T 依賴(lài)于引物 CGTAGTAGCACGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGGCTGCTACGTAGShanghai Jiao Tong UniversityTGAACGTAGTAGCATAGCAATG

31、TACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGT

32、AGTACTGTAGCTAAACTAGCTAStep 3 : 延伸72CCGTAGTAGCACGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGGCTGCTACGTAGTaq PolymeraseTaq PolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTA

33、ACTGTCACTAGAShanghai Jiao Tong UniversityTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAA

34、CTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTADNA量加倍TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATTGAACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGATACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATC

35、TGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAACTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAGTACTGTAGCTAAACTAGCTAShanghai Jiao Tong University46Shanghai Jiao Tong University定性定性PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)產(chǎn)物電泳檢測(cè)DNA分子量大小對(duì)照檢測(cè)產(chǎn)物Shanghai Jiao Tong University定性定性PCRPCR檢測(cè)關(guān)鍵因子檢測(cè)關(guān)鍵因子引物設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)使用輔助軟件既可節(jié)省時(shí)

36、間，也能避免犯錯(cuò)誤。如Oligo 、Primer Express、Primer Primier 5.0、Vector NTI suite 9 和 Primer Select (DNASTAR INC) 等專(zhuān)業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件。引物的堿基組成、長(zhǎng)度及靶序列的特異性是決定PCR成敗的關(guān)鍵。引物是指DNA聚合酶啟動(dòng)DNA合成時(shí)必需的一段寡核苷酸，是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵因素，PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性是由一對(duì)上下游引物所決定的。Shanghai Jiao Tong University dNTPs是PCR反應(yīng)過(guò)程中DNA合成的原材料。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20200 mol/L。三磷酸脫氧核苷酸

37、（dNTPs） dNTP濃度過(guò)高，堿基的錯(cuò)誤摻入率增加，低濃度的dNTP可提高特異擴(kuò)增的精確性。 反應(yīng)體系中4種dNTPs的濃度應(yīng)該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。當(dāng)dNTP終濃度大于50 mmol/L時(shí)可抑制Taq DNA聚合酶的活性。Shanghai Jiao Tong University Taq DNA聚合酶最早是從一種嗜熱水生菌Thermus aquaticus YT-1菌株中分離純化獲得的，后來(lái)在嗜熱脂肪芽孢桿菌及其它幾種耐熱菌中也分離提純到此類(lèi)DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶 酶量過(guò)多會(huì)使非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物增加，過(guò)少則使產(chǎn)量降低。 Shanghai Jia

38、o Tong University反應(yīng)緩沖液 反應(yīng)緩沖液一般含有1050 mmol/L TrisCl，50 mmol/L KCl和適當(dāng)濃度Mg2+ (一般為1.5 mmol/L MgCl2)。 Mg2+濃度既影響酶的活性和真實(shí)性，又影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體形成等，因此，合適的Mg2+濃度是PCR的關(guān)鍵。 必要時(shí)在反應(yīng)緩沖液中還可加入5 mmol/L的二硫蘇糖醇（DDT）或100 g/ml的牛血清蛋白（BSA），以穩(wěn)定Taq酶的活性。 50 mmol/L的KCl有利于引物退火，高于75 mmol/L時(shí)PCR反應(yīng)明顯受到抑制。Shanghai Jiao Tong Un

39、iversity轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性PCRPCR檢測(cè)方法關(guān)鍵檢測(cè)方法關(guān)鍵方法特異性9種轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)方法的特異性示意圖(A)：GA21玉米；(B)：NK603玉米；(C)：BT176玉米；(D)：CBH351玉米；(E)：MON863玉米；(F)：TC1507玉米；(G)：T25玉米；(H)：BT11玉米；(I)：MON810玉米；(J)：玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因。泳道114分別是：空白對(duì)照、GA21玉米、NK603玉米、BT176玉米、CBH351玉米、MON863玉米、TC1507玉米、T25玉米、BT11玉米、MON810玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2、

40、轉(zhuǎn)基因油菜RT73和轉(zhuǎn)基因MON531棉花；泳道M為DL2000 DNA分子量Marker.Shanghai Jiao Tong University方法檢測(cè)極限（LOD）相對(duì)LOD值，指的是能夠檢測(cè)到的最低轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的含量，一般是以“xx%”表示的；以一系列不同轉(zhuǎn)基因含量的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品為PCR擴(kuò)增模板，經(jīng)過(guò)至少三次重復(fù)后，確定可以獲得PCR擴(kuò)增到的DNA樣品的最低轉(zhuǎn)基因含量為相對(duì)LOD值。 絕對(duì)LOD值，指的是能夠檢測(cè)的最低轉(zhuǎn)基因植物DNA的質(zhì)量，一般是以“xx pg”或“xx拷貝”表示的。以純的基因組DNA為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以不同濃度梯度DNA樣品為PCR模板擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)至少三次重復(fù)后，確定

41、可以獲得PCR擴(kuò)增到的DNA樣品的最低DNA質(zhì)量為絕對(duì)LOD值。Shanghai Jiao Tong University已有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性已有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性PCRPCR檢測(cè)方法檢測(cè)方法 基因特異性：epsps、cry1Ab、Pat、bar、Gox、cry9C、NptII等 篩選特異性：CaMV35s啟動(dòng)子、NOS啟動(dòng)子和終止子、FMV35s等 構(gòu)建特異性：主要的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系 轉(zhuǎn)化體特異性：主要的轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、棉花等品系上述方法LOD都達(dá)到0.1，且很多已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化成為ISO和我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)！Shanghai Jiao Tong University熒光定量 PCR

42、（real-time PCR) 通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量。定量定量PCRPCR檢測(cè)方法檢測(cè)方法熒光定量 PCR儀 熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。Shanghai Jiao Tong University 閉管反應(yīng) (low contamination risk) 無(wú)需PCR后操作 (no gels, films etc)自動(dòng)化高通量 單一反應(yīng)管檢測(cè)可以同時(shí)分析多個(gè)反應(yīng)管定量定量PCRPCR檢測(cè)方法特點(diǎn)檢測(cè)方法

43、特點(diǎn) 蓋子蓋子 PCR 管管 加熱板加熱板 樣品樣品透鏡透鏡Shanghai Jiao Tong University熒光域值（熒光域值（threshold） 以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，一般熒光域值定義為3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍.熒光信號(hào)熒光信號(hào)PCR 循環(huán)循環(huán) (高濃度)高CT(低濃度)real-time PCR amplification plots (7 x 10-fold dilns. + NTC)終點(diǎn)終點(diǎn)（不能定量）（不能定量）閾值閾值低CTCt值值 循環(huán)閾值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒

44、光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)； Ct值取決于閾值； Ct值與模板DNA的起始拷貝成反比，與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系；兩個(gè)重要概念兩個(gè)重要概念Shanghai Jiao Tong University定量PCR檢測(cè)方法Shanghai Jiao Tong UniversityShanghai Jiao Tong University實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR方法方法 u絕對(duì)定量法，絕對(duì)定量法，測(cè)樣品中的轉(zhuǎn)指的是利用定量PCR反應(yīng)及其構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得檢基因植物基因組或外源目的基因的質(zhì)量或拷貝數(shù)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量PCR檢測(cè)，主要可以分為兩種方法：一種是絕對(duì)定量法，另

45、一種是相對(duì)定量法。u相對(duì)定量法，相對(duì)定量法，是指利用定量PCR反應(yīng)和構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析獲得檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因植物基因組或外源目的基因在樣品基因組DNA中的百分含量，結(jié)果可以用轉(zhuǎn)基因基因組DNA和樣品基因組DNA的質(zhì)量比或者轉(zhuǎn)基因植物和樣品的質(zhì)量比表示。Shanghai Jiao Tong University108106102104Tu絕對(duì)定量法Shanghai Jiao Tong University外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線 獲得的是樣品中的植物基因組DNA或外源目的基因的絕對(duì)質(zhì)量或拷貝數(shù)。 u絕對(duì)定量法 基因植物（外源基因）基因組質(zhì)量或拷貝數(shù)100樣品轉(zhuǎn)基因含量（%）植物（內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)

46、基因）基因組質(zhì)量或拷貝數(shù)Shanghai Jiao Tong Universityu相對(duì)定量法Shanghai Jiao Tong University內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因外源基因CT(CT =參照基因的CT轉(zhuǎn)基因的CT值） VS 轉(zhuǎn)基因含量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Shanghai Jiao Tong UniversityShanghai Jiao Tong University定量定量PCRPCR方法的關(guān)鍵參數(shù)方法的關(guān)鍵參數(shù) 特異性特異性 SpecificitySpecificity 靈敏度靈敏度 SensitivitySensitivity 準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度 Accuracy Accuracy 重復(fù)性重復(fù)性 R

47、epeatabilityRepeatability 重演性重演性 ReproducibilityReproducibilityShanghai Jiao Tong University特異性與靈敏度特異性與靈敏度只能在含有靶序列的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào)只能在含有靶序列的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào)!需要測(cè)試不同植物品種需要測(cè)試不同植物品種需要測(cè)試不同的轉(zhuǎn)基因植物需要測(cè)試不同的轉(zhuǎn)基因植物足夠低的檢測(cè)靈敏度，滿(mǎn)足轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)的要求足夠低的檢測(cè)靈敏度，滿(mǎn)足轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)的要求 檢測(cè)極限（LOD）定量極限（LOQ）Shanghai Jiao Tong University 定量定量PCRPCR方法可接受和

48、應(yīng)用基本要求方法可接受和應(yīng)用基本要求ApplicabilityScope of the method, interferences with analytes etc.PracticabilityEquipment, timing, practical difficultiesSpecificityEvent-specificityDynamic RangeInclude the 1/10 and at least 5 times the target concentrationAccuracyWithin 25% of the reference valueR2 Coefficient 0.

49、98PCR efficiency- 3.1 slope 3.6RSDrBelow 25% over the whole dynamic rangeLOQLess than 1/10th of the value of the target concentration with an RSDr 25%LODLess than 1/20th of the target concentrationRobustnessDeviate not more than 30% RSDRBelow 35% at the target concentration; 50% below 0.2%TruenessWi

50、thin 25 of the accepted reference value over the whole rangeShanghai Jiao Tong University熒光染料： SYBR Green I、Eva Green 引物特異性探針： Amplifluor (Intergen) Scorpions探針 通用模板探針（AUDP, UT） LUX（Light Upon Extension）探針序列特異性探針： 熒光能量共振轉(zhuǎn)移探針 （FRET) 雙標(biāo)探針（TaqMan 、 TaqMan MGB 、LNA、Allglo ） 分子信標(biāo)（Molecular Beacons，MB)實(shí)時(shí)熒

51、光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR熒光探針類(lèi)型和基本原理熒光探針類(lèi)型和基本原理Shanghai Jiao Tong University5353SGExcitationSGSGSGSGEmission原理 熒光染料法Shanghai Jiao Tong University5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionShanghai Jiao Tong University優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1）高度的通用性，幾乎可以用于任何型號(hào)的定量高度的通用性，幾乎可以用于任何型號(hào)的定量PCR儀和任何目標(biāo)儀和任何目標(biāo)DNA序列的擴(kuò)增。序列的擴(kuò)增。（2）無(wú)需另外設(shè)計(jì)熒光探針，無(wú)需特別優(yōu)化條件，簡(jiǎn)便

52、易行，成本較低。）無(wú)需另外設(shè)計(jì)熒光探針，無(wú)需特別優(yōu)化條件，簡(jiǎn)便易行，成本較低。（3）PCR反應(yīng)后可以進(jìn)行融解曲線分析，分析反應(yīng)的特異性和目標(biāo)序列的突變等。反應(yīng)后可以進(jìn)行融解曲線分析，分析反應(yīng)的特異性和目標(biāo)序列的突變等。l 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：（1）不具備目標(biāo)序列特異性，不能用于Multiplex PCR反應(yīng)，容易受污染物， 非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體的干擾。（2）定量的準(zhǔn)確性不高，重復(fù)性不強(qiáng)。（3）高濃度的染料會(huì)抑制PCR反應(yīng)。Shanghai Jiao Tong UniversityOligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionT

53、ransfer熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針（FRET Probe）序列特異型探針 Shanghai Jiao Tong University優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1） 為雜交型探針，自身不被降解，其熒光信號(hào)是可逆的，為雜交型探針，自身不被降解，其熒光信號(hào)是可逆的，PCR反應(yīng)后可以進(jìn)反應(yīng)后可以進(jìn)行融解曲線分析，突變分析，行融解曲線分析，突變分析，SNP基因分型以及產(chǎn)物鑒別基因分型以及產(chǎn)物鑒別 。（2）包含兩條探針，具備很高的目標(biāo)序列特異性，不受引物二聚體和非特異擴(kuò)增）包含兩條探針，具備很高的目標(biāo)序列特異性，不受引物二聚體和非特異擴(kuò)增的影響。的影響。l缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 由于需要合成兩條探針，探針的末端要封閉以避免延伸

54、反應(yīng)，所以合成的由于需要合成兩條探針，探針的末端要封閉以避免延伸反應(yīng)，所以合成的成本會(huì)比較高，也比較麻煩成本會(huì)比較高，也比較麻煩 。Shanghai Jiao Tong UniversityRQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqMan Probe）Shanghai Jiao Tong University優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：（1）具備目標(biāo)序列特異性，良好的穩(wěn)定性和靈敏度。）具備目標(biāo)序列特異性，良好的穩(wěn)定性和靈敏度。（2）有多種不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)對(duì)可供選擇，可以實(shí)現(xiàn)在同一管內(nèi)檢測(cè)）有多種不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)對(duì)可供選擇，可以實(shí)現(xiàn)在同一管內(nèi)檢測(cè)Multip

55、lex PCR ，降低成本也提高效率和準(zhǔn)確性。降低成本也提高效率和準(zhǔn)確性。（3）探針自身對(duì)）探針自身對(duì)PCR反應(yīng)的影響較小，定量的準(zhǔn)確性高。反應(yīng)的影響較小，定量的準(zhǔn)確性高。 TaqMan 是應(yīng)用最廣泛，最成熟的熒光定量技術(shù)，廣泛的應(yīng)用于人類(lèi)傳染病診斷、動(dòng)物疾病檢測(cè)以及轉(zhuǎn)基因作物定量檢測(cè)等 。l 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：（1）探針設(shè)計(jì)有一定難度，需要驗(yàn)證效果，探針的合成和雙熒光標(biāo)記成本高 。 (2) 探針較長(zhǎng)使得兩端基團(tuán)距離較遠(yuǎn)，導(dǎo)致熒光淬滅不徹底，而且淬滅基團(tuán)也 會(huì) 產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的熒光，本底信號(hào)偏高，信噪比不高。（3）其為水解型探針，反應(yīng)中探針會(huì)水解，熒光信號(hào)不可逆，不能用于融解曲線分析。Shanghai

56、 Jiao Tong UniversityTaqMan MGB 針對(duì)Taqman探針熒光淬滅不徹底的問(wèn)題，2000年美國(guó)ABI公司推出了一種新TaqMan探針 ,即TaqMan MGB，其工作原理與TaqMan 探針相同。Shanghai Jiao Tong UniversityTaqMan MGB優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)（1）3端采用了非熒光性的淬滅基因。（2）MGB探針的3端還連接了一個(gè)二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽( dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3)， 可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交, 升高探針Tm 值，提高探針的特異性。（3）探針可以設(shè)計(jì)得更短，熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅

57、基團(tuán)的距離更近, 淬滅效果更好，熒光背景更低，使得信噪比更高。 （4）MGB探針對(duì)于等位基因的區(qū)分比較理想，可以檢測(cè)單堿基突變?，F(xiàn)在它也是轉(zhuǎn)基因作物定量檢測(cè)中的一種常用的定量技術(shù)。Shanghai Jiao Tong UniversityRQExcitationRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)（Molecular Beacon Probe）序列特異型探針 Shanghai Jiao Tong Universityl缺點(diǎn)缺點(diǎn): :(1)雜交時(shí)探針不能完全與模板結(jié)合，因此穩(wěn)定性較差。 (2)探針合成時(shí)標(biāo)記較復(fù)雜。分子信標(biāo)是轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)的常用的技術(shù)，它還可以用于突變檢測(cè)，SNP

58、檢測(cè)，在其基礎(chǔ)上發(fā)展的技術(shù)有Amplifluor、Sunrise、Amplisensor、Scorpion 等。Shanghai Jiao Tong University目前常用的序列特異性探針比較目前常用的序列特異性探針比較Shanghai Jiao Tong University完成驗(yàn)證方法44個(gè)，正在進(jìn)行中31個(gè)！Shanghai Jiao Tong University535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR2.3.1 Amplifluor引物特異性探針Shanghai Jiao Tong University優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1 它是引物特異性探

59、針，不需要引物以外的探針，節(jié)約成本，反應(yīng)體系優(yōu)化更加方便。2 它是積累性熒光，信號(hào)不可逆，可用于融解曲線分析。3 其探針序列是通用的，可用于檢測(cè)任何目標(biāo)序列，更節(jié)約成本。l缺點(diǎn)：（1）對(duì)引物的擴(kuò)增效率影響比較大，影響定量的準(zhǔn)確性。（2）其穩(wěn)定性不太好，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)其標(biāo)記染料的淬滅能力有限，容易出現(xiàn)淬滅不徹底，導(dǎo)致本底信號(hào)強(qiáng)。該技術(shù)是在分子信標(biāo)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的技術(shù)，具了分析信標(biāo)的一般特點(diǎn)。Shanghai Jiao Tong University通過(guò)優(yōu)化各個(gè)引物對(duì)之間的濃度比，達(dá)到同時(shí)特異性擴(kuò)增的目的。同時(shí)擴(kuò)增8種轉(zhuǎn)基因玉米的多重PCRHari k. et al,2008轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)新技術(shù)和

60、趨勢(shì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)新技術(shù)和趨勢(shì)復(fù)合PCR檢測(cè)技術(shù)Shanghai Jiao Tong University檢測(cè)LOD可以達(dá)到0.25%，這種方法快速，靈敏，高特異性，價(jià)格低廉，方便操作，可用于日常轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)。Hari k. et al,2008Shanghai Jiao Tong University什么是基因芯片技術(shù)？什么是基因芯片技術(shù)？ 簡(jiǎn)單的概括就是將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?，根?jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理簡(jiǎn)單的概括就是將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?，根?jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布進(jìn)而獲取，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布進(jìn)