吲哚美辛誘導(dǎo)慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡的研究

1、吲哚美辛誘導(dǎo)慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡的研究摘要目的觀察和確定吲哚美辛(IN)對慢性髓細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并部分揭示其分子機(jī)制，以期篩選一種新的抗白血病藥物。方法以CML細(xì)胞株K562及來自6例初治PhCML患者骨髓原代培養(yǎng)細(xì)胞為研究材料，在不同時(shí)間點(diǎn)，用不同濃度的IN進(jìn)行干預(yù)，利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞儀、DNA電泳、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等技術(shù)，確定IN對CML細(xì)胞凋亡和增殖的影響。結(jié)果IN能誘導(dǎo)K562細(xì)胞和原代培養(yǎng)的CML細(xì)胞凋亡，并有抑制白血病細(xì)胞增殖的作用；IN對足葉乙甙誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用；IN能下調(diào)K562細(xì)胞中bcl-2mRNA水平表

2、達(dá)，對baxmRNA水平無明顯影響。結(jié)論IN能誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡和抑制白血病細(xì)胞增殖，IN對足葉乙甙的抗白血病效應(yīng)具有增敏作用。bcl-2基因表達(dá)下調(diào)可能為IN誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。關(guān)鍵詞吲哚美辛白血病，髓樣，慢性細(xì)胞凋亡細(xì)胞增殖基因，bcl-2 Study of apoptosis induced by indomethacin in chronic myeloid leukemiaTU ChuanqingZHANG GuangsenLU HanboLaboratory of Molecular Hematology, Division of Hematology, The Se

3、cond Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011Abstract Objective To explore the effect of indomethacin(IN) on the apoptosis of chronic myeloid leukemia(CML) cells, and its molecular mechanisms, for the purpose of screening a new antileukemic agent. Methods CML cell line K562 and

4、 fresh bone marrow cells from 6 untreated Ph CML patients were used for in vitro culture study. The effects of IN on cells were determined by cell morphology, flow cytometry, DNA electrophoresis, and RT-PCR. Results IN induced apoptosis of K562 and fresh CML cells and inhibited the proliferation of

5、K562 cells. A synergic effect of inducing K562 cell apoptosis was observed when IN combined with Vp16. IN down-regulated the level of bcl-2 mRNA without changing the level of bax mRNA in K562 cells. Conclusion IN can induce apoptosis and inhibit proliferation in CML cells, and increase the sensitivi

6、ty of CML cells to Vp16. Down-regulation of bcl-2 mRNA may be one of the mechanisms of CML cell apoptosis induced by IN.Key words Indomethacin Leukemia,myeloid,chronic Apoptosis Cell proliferation Gene,bcl-2 吲哚美辛(indomethacin,IN)是臨床上廣泛使用的非甾體類抗炎藥物之一，近來發(fā)現(xiàn)其有一定的抗白血病作用。1989年Brown等1的研究結(jié)果表明，IN在體外可抑制T淋巴細(xì)胞白血

7、病細(xì)胞株的生長及活力。Dussault等2用IN和IL-2治療紅白血病小鼠，結(jié)果負(fù)瘤小鼠生存期明顯延長。IN抗白血病的具體作用機(jī)制目前尚未完全明了，一些學(xué)者已發(fā)現(xiàn)IN可增強(qiáng)小劑量維甲酸或維生素D3對HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效果，甚至較大劑量的IN(0.6mmol/L)單獨(dú)亦可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化3；也有人證實(shí)IN可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥相關(guān)蛋白過度表達(dá)介導(dǎo)的白血病細(xì)胞多藥耐藥4。有關(guān)IN對白血病細(xì)胞凋亡有無影響，目前尚未見報(bào)道。我們將慢性髓細(xì)胞白血?。–ML）細(xì)胞株K562和6例未經(jīng)藥物治療的PhCML患者的骨髓細(xì)胞作為研究對象，以確定IN是否具有誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡的作用及其作用機(jī)制，并對IN在足葉乙

8、甙（Vp16）誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡中是否具有協(xié)同效應(yīng)進(jìn)行了觀察，為篩選治療CML的新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法1細(xì)胞培養(yǎng)K562細(xì)胞引自本校分子生物學(xué)研究室。新鮮的CML細(xì)胞取自6例未經(jīng)治療的PhCML患者骨髓(其中加速期1例，慢性期5例)，骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)Ficoll?Hypaque分離，無菌PBS洗2次，細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37、體積分?jǐn)?shù)為5CO2孵箱中培養(yǎng)。2試劑IN由湘雅醫(yī)院張桂英教授惠贈(zèng)(Sigma公司產(chǎn)品)，用二甲基亞砜（DMSO,Sigma公司產(chǎn)品)配成200mmol/L儲(chǔ)液，置20冰箱保存；Vp16注射液為北京制藥工業(yè)研究所產(chǎn)品。3

9、引物合成-actin和bcl-2引物參照文獻(xiàn)5，-actin正義鏈：5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3,反義鏈：5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTC-3,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為548bp;bcl-2正義鏈：5-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3,反義鏈：5-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為318bp。根據(jù)bax基因cDNA序列6設(shè)計(jì)合成bax引物，正義鏈：5-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3,反義鏈：5-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為257bp。上述引物由上海生工生物工程公

10、司合成。4劑量反應(yīng)曲線收集對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，配成濃度為2.0105/ml的細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為100800mol/L的IN，對照組加入與最大藥物濃度組等體積的DMSO，于給藥后不同時(shí)相用臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，并依下式計(jì)算生長抑制率。5細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞經(jīng)離心涂片，Giemsa染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)，每張玻片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。6流式細(xì)胞儀分析及DNA片段凝膠電泳不同終濃度(0800mol/L)的IN與K562細(xì)胞共孵育72小時(shí)，按文獻(xiàn)7的方法收集細(xì)胞，用FACS?Vantage流式細(xì)胞儀(美國BD公司)測定細(xì)胞周期分布及凋亡率。抽提DNA進(jìn)行電泳7。7逆轉(zhuǎn)錄

11、-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）按文獻(xiàn)5的方法略加改進(jìn)。1106細(xì)胞經(jīng)異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提總RNA，于37DNase(Promega公司)處理30分鐘，苯酚、氯仿抽提，異丙醇沉淀，用體積分?jǐn)?shù)為75的乙醇洗1次，晾干后溶于20l無RNase水中。cDNA合成：1.5gRNA加入50pmol反義鏈引物本，70水浴10分鐘，冰上驟冷后加入5RT緩沖液4l，10mmol/LdNTP2l，RNasin40U,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200U，補(bǔ)無菌去離子水至20l，42反應(yīng)60分鐘，955分鐘，4保存。PCR：50l反應(yīng)體系中含cDNA模板5l，10PCR緩沖液5l，正義鏈和反義鏈引物各50pmol

12、，10mmol/LdNTP2l，Taq酶2U。bcl-2和-actin的熱循環(huán)條件：94預(yù)變性7分鐘，然后94變性1分鐘，72退火和延伸各30秒，30個(gè)循環(huán)后，72再延伸7分鐘。bax循環(huán)條件改退火為6045秒，延伸7245秒，循環(huán)數(shù)為35個(gè)。取10lPCR產(chǎn)物作20g/L瓊脂糖凝膠電泳，用VDS凝膠自動(dòng)成像，照片經(jīng)薄層掃描求得每個(gè)待測產(chǎn)物與-actin產(chǎn)物光密度之比，進(jìn)行半定量分析。8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析記數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。結(jié)果1IN對K562細(xì)胞的增殖抑制作用1顯示IN明顯抑制K562細(xì)胞增殖，200mol/L作用48小時(shí)開始起效，72小時(shí)作用更明顯，細(xì)胞增殖抑制率為44.3,400mol/LIN作

13、用72小時(shí)細(xì)胞增殖抑制率為83。1IN對K562細(xì)胞的增殖抑制作用2IN誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡分析2.1凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：光鏡下可見IN作用于K562細(xì)胞及6例PhCML細(xì)胞引起典型的細(xì)胞凋亡特征，主要包括細(xì)胞核固縮、核裂解、核碎片彌散于細(xì)胞漿中、胞膜皺縮外突、凋亡小體形成。表1顯示隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長，凋亡細(xì)胞逐步增多。2.2流式細(xì)胞儀分析：200mol/L、400mol/LIN作用于K562細(xì)胞72小時(shí)，流式細(xì)胞儀測得典型的亞二倍體凋亡峰，凋亡細(xì)胞百分率分別為9.57和46.65，而對照組和100mol/LIN組未出現(xiàn)明顯的凋亡峰，凋亡細(xì)胞百分率分別為0.29和0.44。細(xì)胞

14、周期分析發(fā)現(xiàn)400mol/LIN作用72小時(shí)使S期細(xì)胞明顯增加，由49.63增至68.17，大部分細(xì)胞阻滯于S期，G2/M期和G0/G1期細(xì)胞顯著減少。表1IN作用于K562細(xì)胞不同時(shí)間凋亡細(xì)胞記數(shù)（，s)組別IN濃度（mol/L)不同作用時(shí)間凋亡細(xì)胞百分率（）48h72h對照組01.000.501.920.80實(shí)驗(yàn)組1001.751.093.081.132005.832.0812.674.0140020.001.5049.832.36注：與同一時(shí)間對照組相比，P0.012.3DNA裂解片段分析：2顯示400mol/L及800mol/LIN作用于K562細(xì)胞72小時(shí)，DNA凝膠電泳呈典型的梯狀

15、條帶。當(dāng)用20g/mlVp16作用于K562細(xì)胞72小時(shí)，也出現(xiàn)DNA梯狀條帶。400mol/LIN作用于6例PhCML原代培養(yǎng)細(xì)胞72小時(shí)，DNA電泳亦出現(xiàn)明顯梯狀DNA條帶。1：分子量標(biāo)準(zhǔn)1；2：對照；3：IN100mol/L; 4：IN200mol/L; 5：IN400mol/L; 6：IN800mol/L; 7：Vp1620mol/L; 8：分子量標(biāo)準(zhǔn)22IN誘導(dǎo)K562細(xì)胞的DNA電泳3IN對Vp16誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的協(xié)同效應(yīng)單用100mol/LIN或2.5g/mlVp16作用于K562細(xì)胞72小時(shí)，凋亡細(xì)胞百分率分別為3.0和5.0，100mol/LIN和2.5g/mlVp16

16、聯(lián)合作用于K562細(xì)胞72小時(shí)，凋亡細(xì)胞百分率增至42.5。DNA凝膠電泳分析顯示100mol/LIN和2.5g/mlVp16單獨(dú)作用于K562細(xì)胞未出現(xiàn)梯狀DNA條帶，兩者聯(lián)用則出現(xiàn)明顯梯狀DNA條帶。4IN對K562細(xì)胞bcl-2和bax基因表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示K562細(xì)胞bcl-2和bax基因表達(dá)陽性。200mol/L和400mol/LIN作用于K562細(xì)胞72小時(shí)可顯著下調(diào)bcl-2mRNA水平,但對baxmRNA水平影響不明顯(3)。1:分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：K562；3：對照；4：IN200mol/L;5:IN400mol/L3RT-PCR分析IN對K562細(xì)胞bcl-2和ba

17、x表達(dá)的影響討論本研究結(jié)果表明，IN可顯著抑制K562細(xì)胞增殖。IN的增殖抑制作用主要體現(xiàn)在阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期時(shí)相分析顯示：S期細(xì)胞百分比增加，G0/G1和G2/M期細(xì)胞明顯減少,提示IN可抑制S期細(xì)胞向G2/M期的轉(zhuǎn)換。此結(jié)果與Hanif等8對結(jié)腸癌細(xì)胞株的研究結(jié)果相似。新近研究認(rèn)為CML惡性克隆的持續(xù)擴(kuò)增與細(xì)胞增殖及凋亡速率不平衡有關(guān)。K562細(xì)胞與其它白血病細(xì)胞株相比，對化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有更強(qiáng)的抵抗性，新鮮的CML細(xì)胞同樣有很強(qiáng)的抗凋亡能力。因此，尋找新的凋亡誘導(dǎo)劑或增加白血病細(xì)胞對化療藥物的敏感性已成為一個(gè)迫切需要研究的問題。我們以K562細(xì)胞及新鮮的CML細(xì)胞

18、作為IN作用的靶細(xì)胞，從白血病細(xì)胞凋亡通路入手，用不同濃度的IN作用于K562細(xì)胞及新鮮的CML細(xì)胞，結(jié)果從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、DNA凝膠電泳、流式細(xì)胞儀分析多角度證實(shí)IN可誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡，并呈濃度依賴性效應(yīng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IN主要通過影響細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的速率產(chǎn)生抗白血病效應(yīng)。因此，IN作為白血病細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，有著一定的臨床應(yīng)用前景。我們還發(fā)現(xiàn)，IN顯著增強(qiáng)化療藥物Vp16對K562細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，其機(jī)制未明。有文獻(xiàn)報(bào)道IN能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥相關(guān)蛋白介導(dǎo)的化療耐藥，增強(qiáng)多種化療藥物對多藥耐藥相關(guān)蛋白過表達(dá)白血病細(xì)胞株的敏感性4。IN對Vp16抗K562細(xì)胞表現(xiàn)的協(xié)同效應(yīng)，是否涉及到多藥耐藥相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。IN誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前尚未完全明了，我們利用半定量RT-PCR技術(shù)檢測了IN對K562細(xì)胞bcl-2和bax基因的影響，對IN誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了初步探討。結(jié)果IN可顯著下調(diào)bcl-2mRNA水平，但對