細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)節(jié)問題

1、細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)節(jié)問題基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -無菌操作基本技術(shù)無菌操作基本技術(shù) 1. 1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) (laminar flow) 以紫外燈照射以紫外燈照射30-60 30-60 分鐘滅菌，以分鐘滅菌，以70 %ethanol 70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后

2、，將實(shí)驗(yàn)相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺，以物品帶出工作臺，以70 % ethanol 70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10 10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個細(xì)胞株之操作。分鐘以上后，再進(jìn)行下一個細(xì)胞株之操作。 2. 2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利

3、于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。 3. 3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約握住瓶身，傾斜約4545 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上

4、放置桌面。角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。 4. 4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并實(shí)驗(yàn)。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺( (至少至少Class II)Class II)。操作過程中，應(yīng)避。操作過程中，應(yīng)避免引起免引起aerosol aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO DMSO 及及TPA TPA 等，等，并避免尖銳針頭之傷害等。并避免尖銳針頭之傷害

5、等。 5. 5. 定期檢測下列項(xiàng)目：定期檢測下列項(xiàng)目： 5.1. CO2 5.1. CO2 鋼瓶之鋼瓶之CO2 CO2 壓力壓力 5.2. CO2 5.2. CO2 培養(yǎng)箱之培養(yǎng)箱之CO2 CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染濃度、溫度、及水盤是否有污染( (水盤的水盤的水用無菌水，每周更換水用無菌水，每周更換) )。 5.3. 5.3. 無菌操作臺內(nèi)之無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300(300小時小時/ /預(yù)濾網(wǎng)，預(yù)濾網(wǎng)，3000 3000 小時小時/HEPA)/HEPA)

6、。 6. 6. 水槽可添加消毒劑水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。，定期更換水槽的水?；A(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)用品 1. 種類種類 1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無菌，除了玻璃容器細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無菌，除了玻璃容器與與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。外，其它均為塑料無菌制品。 1.2. TC 級培養(yǎng)盤表面均有級培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask，plates, dishes, roller bottle 等，依實(shí)驗(yàn)需要

7、使用。等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料離心管塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有，均有2 種不種不同材質(zhì)，其中同材質(zhì)，其中polypropylene (PP) 為不透明材質(zhì)，為不透明材質(zhì)，polystyrene (PS) 為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。選擇適合材質(zhì)之離心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。棄培養(yǎng)液等。 1.6. 玻璃血清瓶玻璃血清瓶(Pyr

8、ex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml 2. 清洗清洗 2.1. 新購玻璃血清瓶先以新購玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡數(shù)浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。小時，洗凈后才開始使用。 2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。 3. 滅菌滅菌 3.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌滅菌121, 15 lb, 20 分鐘

9、，置于分鐘，置于oven 中烘干。中烘干。 3.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌以干熱滅菌170, 4 小時。小時。 3.3. 液體或是固體廢棄物可用液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液溶液(次氯酸，即漂白水次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌或是蒸汽高壓滅菌121 , 15 lb, 20 分鐘處理。分鐘處理。 基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -培養(yǎng)基培養(yǎng)基 1. 液體培養(yǎng)基貯存于液體培養(yǎng)基貯存于4 冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在前放在37 水槽中溫?zé)?。水槽中溫?zé)帷?2. 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基(加血清加血清) 存放期為六個月，期

10、間存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細(xì)胞生長不佳，可以再添加可能會分解，若細(xì)胞生長不佳，可以再添加適量適量glutamine。 3. 粉末培養(yǎng)基配制粉末培養(yǎng)基配制(以以1 升為例升為例)： 3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為。為。NaHCO3 為另外為另外添加，若將添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然

11、后用粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體氣體調(diào)整調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x，因?yàn)槁入x子對細(xì)胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的子對細(xì)胞生長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)易發(fā)生改變。生改變。 3.2. 材料：材料： 純水純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要) ，粉末，粉末培養(yǎng)基培養(yǎng)基 ，NaHCO3 ，電磁攪拌器，電磁攪拌器 無菌血清瓶無菌血清瓶 ，0.1 或或0.2 mm無菌過濾膜無菌過濾膜 ，pH 計，真空泵，計，真空泵，CO2 氣體氣體 3.3. 步驟：步驟： 3.3.1

12、. 取粉末培養(yǎng)基溶于取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。水中，攪拌使其溶解。 3.3.2. 稱取適量之稱取適量之NaHCO3 粉末溶于粉末溶于200ml milli-Q 水中，攪水中，攪拌使其溶解，然后通入拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約氣體至飽和，約3-5 分鐘。分鐘。 3.3.3. 將溶解且含飽和將溶解且含飽和CO2 之之NaHCO3 溶液加入溶解之液體溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌笕芤褐囵B(yǎng)基中混合。混后溶液之pH 應(yīng)為，除非應(yīng)為，除非pH 值偏差太大，否值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可

13、再通入CO2 氣體調(diào)整氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高。會升高。 3.3.4. 以以0.1 或或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4。(血清血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾) 3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗(yàn)與污染測試。配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗(yàn)與污染測試。 附附- -配制培養(yǎng)基之生長測試配制培養(yǎng)基之生長測試 材料：材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或或C

14、CRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 步驟：步驟： 1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種，接種MDCK 細(xì)胞于細(xì)胞于6-well plate (或或35mm TC dish) 中，每個中，每個well 接種接種1 102 活細(xì)胞，同活細(xì)胞，同時作對照組實(shí)驗(yàn)。時作對照組實(shí)驗(yàn)。 2. 接種接種57 天后，在天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長，倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)

15、胞群落之生長，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。 3. 去除培養(yǎng)基，加入去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoys 固定液固定液(甲醇：冰醋酸甲醇：冰醋酸 3:1)，室溫下靜置室溫下靜置10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。去除固定液，水洗二次。 5. 加入加入1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色，室溫下靜置染色2-3 min。 6. 去除染液，水洗二次。去除染液，水洗二次。 7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細(xì)以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)

16、基對細(xì)胞生長不佳，則丟棄之。胞生長不佳，則丟棄之。 基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -抗生素抗生素 1. 細(xì)胞庫之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素細(xì)胞庫之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素 1.1. 培養(yǎng)自培養(yǎng)自ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。素。 1.2. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。 2. 寄送活細(xì)胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個寄送活細(xì)胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個flask 時，則時

17、，則須添加抗生素須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要檢測若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因，因gentamicin 會抑制會抑制mycoplasma 生長。生長。 4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強(qiáng)。，注意

18、混合使用后藥物毒性會增強(qiáng)。 5. 抗生素使用種類與濃度：抗生素使用種類與濃度： 工作濃度工作濃度. 儲存溫度儲存溫度. 殺滅殺滅細(xì)菌細(xì)菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -2

19、0 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds 基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -血清血清 1. 血清必須貯存于血清必須貯存于20 -70，若存放于，若存放于4，請，請勿超過一個月。如果一次無法用完一勿超過一個月。如果一次無法用完一 瓶，可將瓶，可將4045 ml 分裝于無菌分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時體積離心管中，由于血清結(jié)凍時體積會增加約會增加約10 %， 必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。發(fā)

20、生污染或容器凍裂之情形。 2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。過濾，勿直接過濾血清。 3. 瓶裝瓶裝(500ml) 血清解凍步驟血清解凍步驟(逐步解凍法逐步解凍法): -20或或70至至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以一般以50 ml 無菌離心管可分裝無菌離心管可分裝4045 ml。在溶解過。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡小心勿造成氣泡)，使溫

21、度與成分，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由20直接至直接至37解解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。 4. heat-inactivation 是指是指56, 30 分鐘加熱已完全分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement) 去活化。除去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀斐缮虻砦镏潜仨殻话悴唤ㄗh作此熱處理，因?yàn)闀斐缮虻砦镏@著增多，且會

22、影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有：顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿將血清置于勿將血清置于37太久，若在太久，若在37放置太久，血清放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會

23、因此會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。 6. 血清之沈淀物血清之沈淀物 6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以去除，或離心后

24、上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因?yàn)闀枞^濾膜。凝絮沈淀物，因?yàn)闀枞^濾膜。 6.2. 顯微鏡下觀察之顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過熱處理之：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀物在顯血清，沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)小黑點(diǎn)”，常會誤認(rèn)為血清遭受污，常會誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在染，而將血清放在37中欲培養(yǎng)此中欲培養(yǎng)此“微生物微生物“，但在，但在37環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認(rèn)為微生環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認(rèn)

25、為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會影響細(xì)胞之生長，但若懷一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。 附附- -血清之生長測試血清之生長測試 材料：材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或或CCRC 60004) a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 6-well TC plate (or 3

26、5mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 步驟：步驟： 1. 以以a-MEM with 10 % FBS (已測試過已測試過) 培養(yǎng)培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞于細(xì)胞于T75 flask 至至80% confluency。 2. 以以trypsin-EDTA 處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM 制成細(xì)胞懸浮液，并測細(xì)胞濃度。以不加血清之制成細(xì)胞懸浮液，并測細(xì)胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM 稀釋細(xì)胞濃度為稀釋細(xì)胞濃度為1102活細(xì)胞數(shù)活

27、細(xì)胞數(shù)/ ml。 3. 將將1 ml 細(xì)胞懸浮液接種入細(xì)胞懸浮液接種入6-well plate 中，并另加入中，并另加入1 ml 含不同濃度的血清含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為，使血清最終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進(jìn)行對照組試驗(yàn)。用已測試過之血清同時進(jìn)行對照組試驗(yàn)。 4. 37 oC，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天，期間不需更換培養(yǎng)天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。

28、基，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。 5. 去除培養(yǎng)基，加入去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoys 固定液固定液(甲醇甲醇:冰醋酸冰醋酸 3:1)，室溫下靜置，室溫下靜置10 min。 6. 去除固定液，水洗二次。去除固定液，水洗二次。 7. 加入加入1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色，室溫下靜置染色2-3 min。 8. 去除染液，水洗二次。去除染液，水洗二次。 9. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)以肉眼計數(shù)群落數(shù) 10. 計算計算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / w

29、ell ) / 100 x 100 % 11. 計算計算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) x100 % 比較各濃度血清培養(yǎng)基之比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測血清對細(xì)胞生長，即可得知待測血清對細(xì)胞生長的影響。訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置于的影響。訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置于70 保存之保存之基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞傳代培養(yǎng) 1. 細(xì)胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀

30、釋比例為細(xì)胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至至1:6，依細(xì)胞種類而異。，依細(xì)胞種類而異。 2. 材料：材料： 2.1. 無菌磷酸生理緩沖液無菌磷酸生理緩沖液(Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以以10 ml 分裝于分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于無菌離心管中，保存于20，使用前放

31、在，使用前放在37 水槽水槽回溫。回溫。 2.3. 新鮮培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)基 2.4. 無菌吸管無菌吸管/離心管離心管/培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶 3. 步驟：步驟： 3.1. 附著型胞附著型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。吸掉舊培養(yǎng)液。 3.1.2. 用用D-PBS 洗滌細(xì)胞一至二次。洗滌細(xì)胞一至二次。 3.1.3. 加入加入trypsin-EDTA 溶液溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶液。溶液。(

32、若不移去若不移去trypsin-EDTA，則在則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清之新作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。作用，離心后再吸掉上清液。) 3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 3.2. 懸浮型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞(suspension cell) 3

33、.2.1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。分鐘。 3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 3.3. 融合瘤融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新因此繼代培

34、養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。 基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -細(xì)胞冷凍保存細(xì)胞冷凍保存 （一）（一） 1. 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase) 且存活率高之且存活率高之狀態(tài)，約為狀態(tài)，約為80 90 致密度。致密度。 1.2. 冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。應(yīng)在冷凍保存前一至二

35、日測試是否有抗體之產(chǎn)生。 1.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色無色(以以0.22 micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如如Sigma D-2650)，以，以510 ml 小體積分裝，小體積分裝，4避光保存，避光保存，勿作多次解凍。勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。性。 1.4. 冷凍保存之細(xì)

36、胞濃度：冷凍保存之細(xì)胞濃度： 1.4.1. normal human fibroblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml，細(xì)胞濃度不要，細(xì)胞濃度不要太高，某些太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍會因冷凍濃度太高而在解凍24 小小時后死去。時后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106，依細(xì)胞種類，依細(xì)胞種類而異。而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4.

37、other suspensions: 510 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少須至少5 x 106cells/ml。 1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為冷凍保護(hù)劑濃度為5 或或10 DMSO，若是不確定細(xì)，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗。，以防止冷凍失敗。 1.6. 冷凍方法：冷凍方法： 1.6.1. 傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法: 4 10 分鐘分鐘- -20 30 分鐘分鐘- -80 16 - 18 小時小時(或隔夜或隔夜) - 液氮槽液氮槽vapor pha

38、se 長期儲存。長期儲存。 1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機(jī)以程序降溫：利用等速降溫機(jī)以1 -3/分鐘之分鐘之速度由室溫降至速度由室溫降至120，放在液氮槽，放在液氮槽vapor phase 長期儲長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。之保存。 基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -細(xì)胞冷凍保存細(xì)胞冷凍保存 （二）（二）2. 材料：材料： 2.1. 生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞 2.2. 新鮮培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無菌塑料冷凍保存管無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4

39、 w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計數(shù)盤與蓋玻片血球計數(shù)盤與蓋玻片 2.7. 等速降溫機(jī)等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II) 3. 步驟：步驟： 3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。情形。 3.2. 配制冷凍保存溶液配制冷凍保存溶液(使用前配制使用前配制)：將：將DMSO 加入新鮮加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10，混合均勻，置于室溫下待，混合均勻，置于室溫下待用。用。 3.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)依細(xì)胞繼

40、代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液胞懸浮液(約約0.1 ml) 計數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。計數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。 3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。污染檢測。 3.5. 冷凍保存方法冷凍保存方法1: 冷凍管置于冷凍管置于4 10 分鐘分鐘 -20 30 分鐘分鐘 -80 1618 小時小時(或隔夜或隔夜)

41、液氮槽液氮槽vapor phase 長期儲存。長期儲存。 3.6. 冷凍保存方法冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。程序?yàn)橹校俜湃胍旱壑?。程序?yàn)? program 7: HB CELL 基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -冷凍細(xì)胞活化冷凍細(xì)胞活化 1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。 2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常生長或特

42、性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì)其它蛋白質(zhì))。 3. 材料材料 37 恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無菌吸管恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無菌吸管/ 離心管離心管/ 培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，液氮或干冰容器瓶，液氮或干冰容器 4. 步驟：步驟： 4.1 操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。之傷害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。 4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于將新鮮培養(yǎng)基置于37 C 水槽中回

43、溫，回溫后噴以水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。 4.4 取出冷凍管，立即放入取出冷凍管，立即放入37 C 水槽中快速解凍，輕搖水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以分鐘內(nèi)全部融化，以70 % ethanol 擦拭保擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。 4.5 取出取出0.9 ml 解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例稀釋比例1:101:15)，混合均勻，放入，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取

44、0.1 ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。 4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如例如DMSO 或或glycerol)，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 4.7

45、 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。換培養(yǎng)基?；A(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -收到細(xì)胞的處理方式收到細(xì)胞的處理方式 ( (一一) )1. 收到細(xì)胞株包裹時，收到細(xì)胞株包裹時， 請檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解請檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，凍情形， 若有請立即通知。細(xì)胞株請盡速開始培養(yǎng)，若有請立即通知。細(xì)胞株請盡速開始培養(yǎng)， 或立即冷凍保存或立即冷凍保存(置于置于70 C， 隔夜后，隔夜后， 移到液氮移到液氮)。 2. 冷凍細(xì)胞解凍程序冷凍細(xì)胞解凍程序: 2.1. 依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、

46、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清之細(xì)胞均無法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類，種類， 若因?qū)嶒?yàn)需要，若因?qū)嶒?yàn)需要， 必須有所不同時，必須有所不同時， 務(wù)必以緩務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細(xì)胞適應(yīng)后，確定細(xì)胞適應(yīng)后， 方進(jìn)方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。行所需之實(shí)驗(yàn)。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清小牛血清)和和HS (horse serum, 馬血清馬血清)

47、，對細(xì)胞而言差異極大，請務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之對細(xì)胞而言差異極大，請務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。血清種類培養(yǎng)之。 2.3. 將培養(yǎng)基置于將培養(yǎng)基置于37 C 水槽中回溫，水槽中回溫， 回溫后噴以回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管，移入無菌操作臺內(nèi)。取出冷凍管， 立立即放入即放入37 C 水槽中快速解凍，水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿，過冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后，分鐘內(nèi)全部融化后， 以以70 % ethanol 擦拭冷

48、凍管外部，擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內(nèi)。移入無菌操作臺內(nèi)。 2.4. 依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無菌操作臺內(nèi)取10 ml 培培養(yǎng)基加至養(yǎng)基加至T25 或或T75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入緩緩加入T25 或或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基，內(nèi)之培養(yǎng)基， 混合均勻，放混合均勻，放入入37 C，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 2.5. 對絕大多數(shù)細(xì)胞而言，對絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1 % 以下之冷凍保護(hù)劑以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會對細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻，不會對細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不

49、需立刻由解凍細(xì)胞中去除，由解凍細(xì)胞中去除， 待第二天確定細(xì)胞生長或貼附良好后待第二天確定細(xì)胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數(shù)因?qū)υ偃コ纯?。惟對極少數(shù)因?qū)MSO 敏感或會造成細(xì)胞分敏感或會造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除化之細(xì)胞，需立即去除DMSO 者，者， 則可將解凍后之細(xì)胞則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中，離心培養(yǎng)基中，離心300 xg (約約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后，將細(xì)胞均勻混合后， 轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中， 再放入再放入37 C， 5 %

50、 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)。基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇- -收到細(xì)胞的處理方式收到細(xì)胞的處理方式 ( (二二) ) 收到收到T25 flask T25 flask 細(xì)胞時，細(xì)胞時， 處理方式為處理方式為 1. 1. 于寄送過程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，于寄送過程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25 flask T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請檢查均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask flask 外觀，并于外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題，何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。不要打開蓋子，請立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。

51、2. 2. 將原封之將原封之T25 flask T25 flask 靜置于靜置于37 37 C C， 5 % CO2 5 % CO2 培培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至37 37 C C， 并讓運(yùn)送過程中少數(shù)并讓運(yùn)送過程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)脫落的細(xì)胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內(nèi)取出取出flaskflask內(nèi)之培養(yǎng)基，內(nèi)之培養(yǎng)基，( (取出之培養(yǎng)基可以再使用取出之培養(yǎng)基可以再使用) )，僅留約僅留約5-10ml 5-10ml 培養(yǎng)基于培養(yǎng)基于flask flask 內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長滿盤，將細(xì)胞

52、置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長滿盤， 則將細(xì)胞做則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)。 附附- -細(xì)胞計數(shù)與存活測試（一）細(xì)胞計數(shù)與存活測試（一） 1. 1. 原理：原理： 1.1. 1.1. 計算細(xì)胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是計算細(xì)胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coulter counter Coulter counter 粒子計數(shù)粒子計數(shù)器自動計數(shù)。器自動計數(shù)。 1.2. 1.2. 血球計數(shù)盤一般有二個血球計數(shù)盤一般有二個chamberschambers，每個，每個chamber chamber 中細(xì)刻中細(xì)刻9 9 個個1 1 mm2 mm2 大正方形，其中大正方形，其中4 4 個角落之正方形再細(xì)刻個角落之正方形

53、再細(xì)刻16 16 個小格，深度均為個小格，深度均為0.1 mm0.1 mm。當(dāng)。當(dāng)chamber chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 mlmm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細(xì)胞。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104104，即為每，即為每ml ml 中之細(xì)胞數(shù)目。中之細(xì)胞數(shù)目。 1.3. 1.3. 存活測試之步驟為存活測試之步驟為dye exclusiondye exclusion，利

54、用染料會滲入死細(xì)胞中而，利用染料會滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍(lán)色之藍(lán)色之trypan blue trypan blue 染料，如果細(xì)胞不易吸收染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan bluetrypan blue，則用紅，則用紅色之色之Erythrosin bluishErythrosin bluish。 附附- -細(xì)胞計數(shù)與存活測試（二）細(xì)胞計數(shù)與存活測試（二） 2. 2. 材料：材料： 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 0.4 % w/

55、v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain Erythosin bluish stain 取取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及及0.05 gram 0.05 gram preservative methyl preservative methyl paraben (Sigma H-3647) paraben (Sigma H-3647) 溶于溶于100 ml Ca+/Mg+ free s

56、aline 100 ml Ca+/Mg+ free saline 血球計數(shù)盤及蓋玻片血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip) (Hemocytometer and coverslip) ，計數(shù)器，計數(shù)器(counter) (counter) ，低倍倒立顯微鏡低倍倒立顯微鏡 粒子計數(shù)器粒子計數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics) (Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 3. 步驟：步驟： 3.1. 3.1. 取取50ml 50ml 細(xì)胞懸浮液與細(xì)胞懸浮液與50ml trypa

57、n blue (or Erythrosin bluish) 50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等等體積混合均勻于體積混合均勻于1.5ml 1.5ml 小離心管中。小離心管中。3.2. 3.2. 取少許混合液取少許混合液( (約約15ml) 15ml) 自血球計數(shù)盤自血球計數(shù)盤chamber chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于玻片，于100 100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色( (或紅色或紅色- Erythrosinbluish)- Erythrosi

58、nbluish)。 3.3. 3.3. 計數(shù)四個大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除計數(shù)四個大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4 4，乘以稀釋倍數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)( (至少乘以至少乘以2 2，因與，因與trypan bluetrypan blue等體積混合等體積混合) )，最后乘以，最后乘以104104，即為每，即為每ml ml 中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計上線與右線之細(xì)胞若細(xì)胞位于線上，只計上線與右線之細(xì)胞( (或計下線與左線之細(xì)胞或計下線與左線之細(xì)胞) )。 4 4 大格大格* *細(xì)胞總數(shù)細(xì)胞總數(shù)x 2 x 104 / 4= x 2 x 104 / 4= 細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml /ml

59、 * *每一大格的體積每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml = 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 3.4. 若不用血球計數(shù)盤，可用若不用血球計數(shù)盤，可用Coulter counter Coulter counter 作自作自動計數(shù)，惟無法辨別死細(xì)胞或活細(xì)胞。動計數(shù)，惟無法辨別死細(xì)胞或活細(xì)胞。 3.5. 3.5. 范例：范例： T75 monolayer culture T75 monolayer culture 制成制成10ml 10ml 細(xì)胞懸浮液，取細(xì)胞懸浮液，取0.1 ml 0.1 ml 溶液與溶液與

60、0.1ml trypan blue 0.1ml trypan blue 混合均勻于試管混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目。之細(xì)胞數(shù)目。 活細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)/ /方格：方格：55 ,62, 49, 59 55 ,62, 49, 59 死細(xì)胞數(shù)死細(xì)胞數(shù)/ /方格：方格：5, 3, 4, 6 5, 3, 4, 6 細(xì)胞總數(shù)細(xì)胞總數(shù)= 243 = 243 平均細(xì)胞數(shù)平均細(xì)胞數(shù)/ /方格方格= 60.75 = 60.75 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)= 2 = 2 細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22