不同劑量脂多糖預(yù)處理對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響的研究(一)

1、不同劑量脂多糖預(yù)處理對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響的研究(一)    作者：李鴻佳, 王淑娟, 李艷麗, 董亮【摘要】 目的: 研究不同劑量脂多糖（LPS）通過(guò)誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞（AM）Toll樣受體4（TLR4）的高表達(dá), 探討其對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響。方法: BALB/c小鼠隨機(jī)分為哮喘模型組（OVA）A, 低劑量LPS處理組（0.1 mg/L LPS+OVA）B, 高劑量LPS處理組（100 mg/L LPS+OVA）C, 對(duì)照組（生理鹽水）D。用卵白蛋白（OVA）致敏與激發(fā)建立小鼠哮喘模型; 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各組小鼠支氣管肺泡灌洗液（

2、BALF）上清中IL4、 IL5、 IL13和IFN的含量, 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定AM的TLR4的表達(dá), 光鏡觀察肺組織病理變化。結(jié)果: 與A組相比較, B組BALF上清中IL4、 IL5和IL13的水平顯著增高（P0.05）, 而IFN差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）, C組BALF上清中IL4、 IL5和IL13的水平顯著降低, IFN顯著增高（P0.05）; 與A組相比, B組與C組AM的TLR4mRNA表達(dá)均明顯增高（P0.05）, 兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 光鏡下, A組支氣管黏膜下水腫, 黏液腺增生, 可見(jiàn)大量以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。B組與C組上述情況未見(jiàn)減輕,

3、 并出現(xiàn)肺泡腔及間質(zhì)充血, 中性粒細(xì)胞等大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), D組管腔內(nèi)無(wú)黏液栓, 氣道周圍無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 肺泡壁結(jié)構(gòu)完整。結(jié)論: 低劑量LPS(0.1 mg/L)誘導(dǎo)哮喘小鼠AM的TLR4高表達(dá), 使肺部炎癥加重, 而高劑量LPS(100 mg/L)可能會(huì)減輕變態(tài)反應(yīng)癥狀。 【關(guān)鍵詞】 肺泡巨噬細(xì)胞; 脂多糖; Toll樣受體4; 支氣管哮喘支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種以嗜酸性粒細(xì)胞為主的眾多炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與的慢性氣道炎癥性疾病1, 其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì), 室內(nèi)灰塵, 革蘭陰性桿菌的內(nèi)毒素等在哮喘氣道炎癥中的作用存在很大的爭(zhēng)議。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌的一類重要的病原體微生

4、物成分, 研究發(fā)現(xiàn), LPS濃度可影響Th1/Th2炎癥反應(yīng)。高水平LPS可使具有抗原特異性的Th1反應(yīng)增強(qiáng), 低劑量LPS可使Th2敏感性增高, 提示LPS可能在過(guò)敏性炎癥反應(yīng)中具有獨(dú)特的雙向作用2。TLR4是LPS的主要模式識(shí)別受體, TLR4結(jié)合LPS等病原體相關(guān)分子模式后通過(guò)釋放細(xì)胞因子可促進(jìn)Th1細(xì)胞分化, 從而可能在哮喘免疫和宿主保護(hù)中起重要作用, 但目前尚沒(méi)有足夠證據(jù)證明TLR4能直接識(shí)別Th2型免疫應(yīng)答。我們?cè)噲D運(yùn)用不同劑量LPS干預(yù)小鼠哮喘模型, 研究LPS誘導(dǎo)AM表面TLR4激活機(jī)制, 探討TLR4激活在哮喘發(fā)病機(jī)制中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 進(jìn)一步明確其在哮喘小鼠氣道炎癥加重的機(jī)

5、制中的作用。1 材料和方法1.1 材料 雞卵蛋白（OVA, Grade, 純度98%, Sigma）, 超純脂多糖(ultrapure LPS, Ecoli O111: B4, Sigma), BALB/c小鼠(68周齡, 雌性)由山東大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 小鼠IFN和IL4 ELISA試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物公司, 小鼠IL5和 IL13 ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物公司, 總RNA抽提與純化試劑盒購(gòu)自Roche公司, SYBR Green 購(gòu)自Roche公司, Spector型酶標(biāo)分析儀（美國(guó)）。1.2 方法2 結(jié)果小鼠哮喘模型造模成功, 出現(xiàn)明顯的煩躁不安, 呼吸急促, 腹肌抽搐,

6、大、 小便失禁, 毛發(fā)豎起, 部分小鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍, 動(dòng)作遲緩; 而生理鹽水對(duì)照組小鼠無(wú)明顯異常表現(xiàn)。2.1 小鼠肺組織病理學(xué)改變 高倍顯微鏡下觀察可見(jiàn), A組支氣管黏膜下水腫, 黏液腺增生, 黏膜皺褶增多, 黏膜及黏膜下層、 平滑肌外均可見(jiàn)大量以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), B組與C組上述情況未見(jiàn)減輕, 并出現(xiàn)肺泡腔及間質(zhì)充血, 中性粒細(xì)胞等大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), D組氣道上皮無(wú)增厚, 氣道周圍無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 肺泡壁結(jié)構(gòu)完整（圖1）。圖1 肺組織病理切片（HE染色, ×400）2.2 小鼠BALF細(xì)胞因子水平的檢測(cè) A組肺泡灌洗液上清中IL4、 IL5、 IL13和IFN的水平

7、顯著高于D組（P0.05）; 與A組相比, C組IL4、 IL5和IL13水平顯著降低, IFN水平顯著升高（P 0.05）, B組IL4、 IL5和IL13水平顯著增高（P0.05）, 而IFN差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。表1 BALF中IFN、 IL4、 IL5和IL13含量2.3 小鼠AM中TLR4mRNA的表達(dá)情況 與A組相比, B組與C組TLR4mRNA表達(dá)能力顯著增強(qiáng)（P0.05）, 而D組與A組TLR4mRNA表達(dá)能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。表2 AM中TLR4mRNA的熒光域值循環(huán)數(shù)3 討論哮喘的主要特征是慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性, 其發(fā)病及演變主要受控于Th2型細(xì)胞分泌的細(xì)

8、胞因子1。室內(nèi)灰塵, 革蘭陰性桿菌的內(nèi)毒素等在哮喘氣道炎癥中的作用存在很大的爭(zhēng)議, LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌的一類重要的病原體微生物成分, 近年來(lái)TLRs的發(fā)現(xiàn)為機(jī)體對(duì)LPS的免疫應(yīng)答提供了新的線索2。AM是一類重要的抗原提呈細(xì)胞, 其表面的TLR4作為L(zhǎng)PS的主要跨膜受體, 介導(dǎo)了肺部的炎癥反應(yīng), 首先形成的LPS/LBP/CD14復(fù)合物, 在MD2的輔助下, 通過(guò)接頭蛋白MyD88（myeloid differentiation protein, 髓樣分化蛋白）, 使IRAK(IL1 receptor associated kinase, IL1受體相關(guān)激酶)、 TRAF（TNF recep

9、tor associated factor, 腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子）6、 MAPKKK(MAPK kinase kinase)家族依次活化, 從而激活NIK（NFB誘導(dǎo)激酶）、 IKK（IB激酶）, 使NFB解除抑制入核轉(zhuǎn)錄3, 4; TRAF6還可通過(guò)激活MAPKKK、 MAPKK、 ERK、 P38和JNK/SAPK通路, 最后導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子AP1家族的成員jun和fos活化5, 進(jìn)而誘導(dǎo)各種炎癥因子如TNF、 IL1、 IL6等大量釋放, 加重了肺部炎癥。我們通過(guò)建立不同濃度LPS預(yù)處理的哮喘小鼠模型, 發(fā)現(xiàn)兩組LPS預(yù)處理的小鼠, AM的TLR4mRNA表達(dá)與哮喘模型組相比均明顯增強(qiáng)

10、, 而不同劑量LPS處理的哮喘小鼠之間, AM的TLR4mRNA表達(dá)差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 提示我們AM的TLR4是LPS引起免疫應(yīng)答的主要受體, LPS可誘導(dǎo)哮喘小鼠AM的TLR4mRNA的表達(dá)上調(diào), 而OVA并不能刺激TLR4mRNA表達(dá)增強(qiáng), 這與Eswarappa等7的研究相一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LPS暴露水平可以決定機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的類型6, 暴露于含高濃度LPS（100 mg/L）的OVA的小鼠, 其氣道的變態(tài)反應(yīng)癥狀減輕, 主要以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主, 粘液分泌不明顯, Th1型細(xì)胞因子IFN明顯增加, 主要與肺損傷有關(guān); 而暴露于含低濃度LPS（0.1 mg/L）的OVA的小鼠, 其哮喘癥

11、狀加重, 肺部以嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主, 粘液分泌增加, 抗原特異性Th2型細(xì)胞因子IL4、 IL5和IL13明顯增加8, 這使得衛(wèi)生學(xué)假說(shuō)對(duì)于內(nèi)毒素的暴露使Th平衡向著減弱Th2型的方向發(fā)展的理論, 在哮喘的發(fā)病機(jī)制中還需進(jìn)一步深入研究, 我們推測(cè)這可能與重癥哮喘以及哮喘的急性發(fā)作密切相關(guān), 這有待于我們?cè)囼?yàn)的進(jìn)一步探討與證實(shí)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Goetzl EJ. Changing paradigms in the immunological science of allergy: 2008J. Curr Allergy Asthma Rep, 2008, 8(1): 28-31.

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