海藻酸鈣固定化葡萄糖淀粉酶的研究

1、 畢業(yè)設(shè)計（論文）摘 要本次研究采用的是海藻酸鈉為載體，利用包埋法固定葡萄糖淀粉酶。研究得出了制備時的給酶量、氯化鈣濃度、形成時間對固定化酶的影響，在此基礎(chǔ)上，也進一步研究了固定化酶的米氏常數(shù)和重復(fù)使用穩(wěn)定性。在單因素實驗基礎(chǔ)上，通過三因素三水平正交試驗得出，氯化鈣濃度為2%，形成時間為3.5h，給酶量為22mg是最佳組合，單位質(zhì)量的酶活力為12151U/g。游離酶的Km為2.50mg/ml，固定化酶的Km為3.63mg/ml。通過固定化之后，酶對底物的親和力降低了。隨著使用次數(shù)的增加，酶活性逐漸降低，但是每次反應(yīng)10min，在使用10次之后，酶活性還有原來的50%。關(guān)鍵詞：海藻酸鈉；葡萄糖淀

2、粉酶；固定化酶AbstractThis study uses the sodium alginate as the carrier, the glucamylase was immobilized using the method of embedding . In this experiment, we know the influence of the amount of enzyme, concentration of calcium chloride and curing time on immobilized enzyme. On this basis, we make furthe

3、r study on Michaelis constant and the stability of repeated use of the immobilized enzyme. On the basis of single factor experiment, we do the three factors and three levels orthogonal test. When the concentration of calcium chloride is 2%, the curing time is 3.5h and the amount of enzyme is 22mg, w

4、e can get the best combination, unit mass of enzyme activity is 12151 u/g. The Km of free enzyme is 2.50 mg/ml, the Km of immobilized enzyme is 3.63 mg/ml. After the immobilization, enzyme reduces the affinity to the substrate. With the increase of use, enzyme activity decreases gradually. Immobiliz

5、ed enzyme retained 50% activity after 10 reuses with 10 min of each reaction time.Keywords: calcium alginate; glucamylase; immobilized enzymeI目 錄摘 要IAbstractII1 緒論11.1葡萄糖淀粉酶的簡介11.1.1葡萄糖淀粉酶的性質(zhì)11.1.2葡萄糖淀粉酶與淀粉的反應(yīng)11.1.3葡萄糖淀粉酶與-淀粉酶11.2酶固定化的方法11.2.1吸附法11.2.2包埋法21.2.3交聯(lián)法21.2.4結(jié)合法21.3 載體材料的介紹21.3.1海藻酸鈉的性質(zhì)21

6、.3.2海藻酸鈉與氯化鈣的反應(yīng)21.4 總體操作流程31.5 研究目的和意義32 海藻酸鈣固定化葡萄糖淀粉酶的方法研究52.1材料52.1.1實驗材料和試劑52.1.2儀器與設(shè)備52.2測定方法62.2.1斐林試劑的標(biāo)定62.2.2游離酶活力的測定62.2.3固定化酶活力的測定72.3試驗方法72.3.1固定化酶的制備72.3.2海藻酸鈣包埋法固定化葡萄糖淀粉酶的研究72.3.3正交試驗82.4結(jié)果與討論82.4.1固定化酶82.4.2給酶量的確定92.4.3 CaCl2濃度的確定102.4.4形成時間的確定112.4.5正交試驗122.5小結(jié)143 海藻酸鈣固定化葡萄糖淀粉酶特性的研究153

7、.1材料和方法153.1.1實驗材料和試劑153.1.2儀器與設(shè)備153.2測定方法153.2.1酶活力的測定153.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備153.3試驗方法163.3.1葡萄糖淀粉酶米氏常數(shù)的測定163.3.2重復(fù)使用穩(wěn)定性的測定183.4小結(jié)204結(jié)論與展望214.1結(jié)論214.2展望21致 謝22參考文獻23I1 緒論1.1葡萄糖淀粉酶的簡介1.1.1葡萄糖淀粉酶的性質(zhì)葡萄糖淀粉酶是由微生物分泌的一種具有外切酶活性的胞外酶，在工業(yè)中廣泛應(yīng)用，作用重要，在葡萄糖制造、釀醋、釀酒、有機酸、氨基酸等工業(yè)中應(yīng)用廣泛。葡萄糖淀粉酶的底物專一性比較低，可以將淀粉百分之百水解，生成的產(chǎn)物為葡萄糖1

8、。葡萄糖糖淀粉酶隨作用的溫度升高其酶活力逐漸增大，當(dāng)超過65時又隨著溫度的升高酶活力急劇下降，其最適最適作用pH在4.0-4.5左右2。1.1.2葡萄糖淀粉酶與淀粉的反應(yīng)葡萄糖淀粉酶，又稱糖化酶(EC.3.2.1.3.)，它能從淀粉的非還原性未端將-1，4葡萄糖苷鍵水解產(chǎn)生葡萄糖，也可以緩慢水解-1，6葡萄糖苷鍵，生成葡萄糖。同時也能水解糊精、糖原的非還原性末端釋放出-D-葡萄糖。1.1.3葡萄糖淀粉酶與-淀粉酶葡萄糖淀粉酶是外切酶，依次從淀粉分子非還原端切割-1，4葡萄糖苷鍵和-1，6葡萄糖苷鍵，逐個切下葡萄糖殘基，有一定的次序性，水解后產(chǎn)生的游離半縮醛羥基發(fā)生轉(zhuǎn)位作用，釋放出-葡萄糖。無論

9、是作用于直鏈淀粉還是支鏈淀粉，葡萄糖淀粉酶水解的最終產(chǎn)物均為葡萄糖。-淀粉酶3既作用于直鏈淀粉，也作用于支鏈淀粉，它的特點是能夠無差別地隨機切斷糖鏈內(nèi)部的-1，4葡萄糖苷鍵。水解直鏈淀粉時最終產(chǎn)物以葡萄糖為主，此外還有少量麥芽三糖及麥芽糖；水解支鏈淀粉時，除麥芽糖，葡萄糖，麥芽三糖外，還有一定量的-極限糊精的生成4。1.2酶固定化的方法酶固定化方法很多，主要有吸附法、包埋法、交聯(lián)法、結(jié)合法等5。1.2.1吸附法吸附法是利用離子鍵、物理吸附等方法，所選的載體材料一般為天然或合成的無機、有機高分子材料，例如纖維素、瓊脂糖等一些多糖類或多孔玻璃、離子交換樹脂等，把酶固定在一種或者多種載體材料上。因為

10、吸附對酶的損害不是很大，盡管酶失活了，也可以重新活化，載體可以再生。吸附法的吸附過程具有雙重功效，既可以達到純化，同時也可以達到固定化的目的。1.2.2包埋法包埋法是將單體與制備好的酶溶液進行混合，再借助引發(fā)劑的作用發(fā)生聚合反應(yīng)，將酶包埋在載體材料的網(wǎng)格中，達到固定化的目的。該法的優(yōu)點是：酶分子或細(xì)胞本身沒有參加格子的形成，工業(yè)生產(chǎn)中的大多數(shù)酶都可用這種方法來固定化，并且方法比較簡便；酶分子沒有受到化學(xué)作用，僅僅是被包埋起來了。所以活力較高。此法的缺點是不適用于大分子底物，大分子底物無法進入網(wǎng)格與酶接觸。1.2.3交聯(lián)法交聯(lián)法是借助多功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，通過制成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來將酶固

11、定化的方法。酶分子和有特殊功能的試劑之間形成一種穩(wěn)定的共價鍵，酶分子之間能發(fā)生交聯(lián)作用，并且還存在著一定的分子內(nèi)的交聯(lián)作用。交聯(lián)法制備的固定化酶結(jié)合較為牢固，適合長時間的使用，但是由于在交聯(lián)過程中酶分子的多個基團被交聯(lián)，使得酶活力損失很大。1.2.4結(jié)合法結(jié)合法是通過酶蛋白分子上的功能團以化學(xué)共價鍵的形式連接到固相支持物表面上的反應(yīng)基團上，達到固定化目的的一種方法。結(jié)合法的優(yōu)點是酶分子與載體之間通過化學(xué)鍵連接牢固，發(fā)生酶的脫落的可能性較小，生成的酶穩(wěn)定性良好，并且具有較好的重復(fù)使用性，缺點是酶與載體的反應(yīng)條件比較劇烈，酶容易失活，且制備起來比較復(fù)雜。1.3 載體材料的介紹1.3.1海藻酸鈉的性

12、質(zhì)海藻酸鈉是一種高粘性的高分子化合物。它與淀粉、纖維素等的不同之處，是它具有羧基，是-D-甘露糖醛酸的醛基以苷鍵形成的高聚糖醛酸。海藻酸鈉親水性強，在冷水中和溫水中都能溶解，形成非常粘稠的均勻的溶液。加入葡萄糖淀粉酶溶液之后，形成具有一定的柔軟性和均一性的溶液。1.3.2海藻酸鈉與氯化鈣的反應(yīng)海藻酸鈉的分子鏈上含有大量的羥基和羧基，將含有葡萄糖淀粉酶的海藻酸鈉溶液用注射器逐滴滴加到氯化鈣溶液中時，氯化鈣溶液充當(dāng)交聯(lián)劑的角色。海藻酸鈉溶液電解產(chǎn)生海藻酸陰離子，氯化鈣產(chǎn)生二價鈣離子，鈣離子與海藻酸陰離子發(fā)生靜電作用而吸引，從而團聚沉淀，生成海藻酸鈣聚合物6。生成的海藻酸鈣小球是一種多孔網(wǎng)狀的凝膠，

13、由顧旭炯7等人的研究可知，葡萄糖淀粉酶分子比海藻酸鈣小球上的孔徑大，淀粉經(jīng)糊化后的糊精的分子量比海藻酸鈣小球上的孔徑小，這樣葡萄糖淀粉酶才能很好地固定在海藻酸鈣小球內(nèi)，達到固定化的目的，糊精也能由小孔進入到海藻酸鈣小球內(nèi)與葡萄糖淀粉酶形成酶-底物復(fù)合物，并發(fā)生反應(yīng)，生成葡萄糖。這種方法生成的固定化酶制備比較簡便，條件也較溫和，酶本身的活性損失少。但是，在有多價陰離子的溶液中、高濃度電解質(zhì)溶液中，海藻酸鈣凝膠中的鈣離子容易脫落，變得很不穩(wěn)定，使得形成的凝珠變軟，長時間甚至?xí)l(fā)生溶解8。1.4 總體操作流程糖化酶 2%的淀粉溶液 緩沖液溶解 糊精 海藻酸鈉溶解 混合造粒固定糖化酶顆?；旌洗呋磻?yīng)葡

14、萄糖圖1-1 總體操作流程依次研究氯化鈣的濃度、給酶量、形成時間對固定化酶的影響，得出固定化酶的性質(zhì)，包括動力學(xué)參數(shù)和重復(fù)使用穩(wěn)定性。采用斐林試劑快速滴定、DNS法測還原糖含量兩種方法測定酶活力。斐林試劑快速滴定利用的是在堿性條件下，含有自由醛基的還原糖，能將二價銅離子還原成氧化亞銅的性質(zhì)來進行滴定的。DNS法測還原糖的原理是還原糖和堿性二硝基水楊酸試劑一起共熱，會產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物，在一定的濃度范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。1.5 研究目的和意義酶在工業(yè)中使用廣泛，但是游離酶對反應(yīng)的環(huán)境非常敏感，易受到溫度、pH、攪拌等作用的影響，酶蛋白容易變性，從而會降低甚至

15、喪失活性。同時，游離酶反應(yīng)后難于與底物和產(chǎn)物分離，這樣不僅會影響生成的產(chǎn)物的純度，而且酶也很難重復(fù)使用，這在很大程度上使酶的應(yīng)用受到限制9。固定化技術(shù)的應(yīng)用，使酶應(yīng)用過程中存在的很多問題得到解決，為酶的工業(yè)應(yīng)用開辟了新的前景。本次研究的目的是為工業(yè)上淀粉一步水解為葡萄糖的生產(chǎn)提供一個可靠的技術(shù)支持。選取的是工業(yè)上比較常用、價格相對低廉的海藻酸鈉作為載體。海藻酸鈣固定化葡萄糖淀粉酶是通過將葡萄糖淀粉酶酶包埋于凝膠內(nèi)使酶分子局限在一個有限的空間內(nèi)的過程。正如上面介紹的包埋法，葡萄糖淀粉酶的活性中心的氨基酸殘基并沒有與載體發(fā)生作用10。固定化酶可以反復(fù)使用，酶與底物、產(chǎn)物分離比較容易。與游離酶相比，

16、固定化酶不僅保持了高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性，也克服了游離酶的不足之處，具有儲存穩(wěn)定性高、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、分離回收容易、工藝簡便等優(yōu)點。因為酶經(jīng)過固定化后，催化活性會有一定程度的喪失，而且，通過包埋法得到的固定化酶容易泄露，包埋在載體內(nèi)不牢固，并且在反應(yīng)過程中存在空間位阻的限制，使催化活性不高11。所以本次研究是為了確定其最佳固定化條件，檢驗固定化后的理化性質(zhì)及穩(wěn)定性，盡可能降低酶的活性的喪失。使固定化酶能在工業(yè)中大規(guī)模的使用，為工業(yè)生產(chǎn)降低大量成本。 2 海藻酸鈣固定化葡萄糖淀粉酶的方法研究固定化酶的方法多種多樣，如侯紅萍等人用殼聚糖一海藻酸鈉共混凝膠包埋固定糖化酶12和

17、采用介孔分子篩SBA-15固定糖化酶13，董昭等人采用海藻酸鋁固定化糖化酶14，郭海學(xué)用纖維素載體固定化糖化酶15。本文采用的是海藻酸鈉包埋法固定化葡萄糖淀粉酶，在郭橋等人的-淀粉酶和糖化酶的共固定16中就是采用的海藻酸鈉包埋法，而本次只是單獨固定葡萄糖淀粉酶，對其中制備時的三個影響因素，包括給酶量、氯化鈣的濃度、形成時間，進行了優(yōu)化。2.1材料2.1.1實驗材料和試劑表2-1 實驗材料與試劑藥品名純度生產(chǎn)廠家海藻酸鈉化學(xué)純西隴化工股份有限公司無水氯化鈣分析純成都市科農(nóng)化工試劑廠糖化酶活性10萬/克檸檬酸分析純天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司檸檬酸鈉分析純天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心可溶性淀粉分

18、析純天津市廣成化學(xué)試劑有限公司硫酸銅(CuSO45H2O)分析純成都市聯(lián)合化工試劑研究所酒石酸鉀鈉分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司氫氧化鈉(片狀)分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司次甲基藍分析純天津市廣成化學(xué)試劑有限公司葡萄糖分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司2.1.2儀器與設(shè)備表2-2 實驗儀器與設(shè)備儀器名稱型號產(chǎn)地電熱恒溫水浴鍋HHS 21-28上海醫(yī)療器械五廠恒溫水浴鍋B-220上海亞榮生化儀器廠電熱恒溫干燥箱PH 030A型上海一恒科學(xué)儀器有限公司循環(huán)水式真空泵SHZ-D()鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司電冰箱BCD-174博西華家用電器有限公司萬分之一電子天平AR2140梅特勒-托利多

19、儀器（上海）有限公司2.2測定方法2.2.1斐林試劑的標(biāo)定稱取120烘干至恒重的葡萄糖配置3mg/ml的葡萄糖溶液。取斐林溶液A、B各5.0mL，置于250ml的錐形瓶中，加10mL水進行稀釋，加熱使其于5min內(nèi)沸騰，在沸騰狀態(tài)下用酸式滴定管滴入3mg/ml的葡萄糖溶液至藍色即將消失時，加12滴次甲基藍指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失，記錄所用葡萄糖溶液的體積。表2-3 斐林試劑的標(biāo)定編號1234平均值（V1）葡萄糖用量（ml）18.6017.9218.2017.8518.142.2.2游離酶活力的測定按參考文獻17中糖化酶活力測定的方法，也就是用斐林試劑快速滴定法來測定生成的葡萄糖的含量。將糖化

20、酶反應(yīng)的最適溫度和pH下，每小時生成1mg葡萄糖所需的酶量定為一個活力單位，即1IU=1mg/h。游離酶活力的測定：向250mL錐形瓶中加入50mL濃度為2%淀粉溶液，65保溫10min，然后加入10mL用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH4.6）配置的一定濃度的酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)1h，再放入沸水中煮沸10min將酶滅活，同上述斐林試劑滴定法一樣，用反應(yīng)液滴定斐林試劑，滴定至藍色消失時，記錄所用溶液的體積V。酶活力計算的公式：其中：X為酶活力（U）；V1為標(biāo)定斐林試劑時所用的葡萄糖的體積，為18.14mL； C為標(biāo)定斐林試劑時所用的葡萄糖的濃度，為3mg/ml； V總為酶作用的淀粉和緩沖液的總體積，為6

21、0mL； V為反應(yīng)1h后的反應(yīng)液滴定斐林試劑所用的體積； n為反應(yīng)液稀釋的倍數(shù)，當(dāng)?shù)味吭?5mL以下時應(yīng)該適當(dāng)稀釋。2.2.3固定化酶活力的測定按參考文獻17,同游離酶活力的測定方法，向250mL的錐形瓶中加入50mL濃度為2%淀粉溶液和10mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH4.6），65保溫10min，然后加入一定量的固定化酶，準(zhǔn)確反應(yīng)1h，再放入沸水中煮沸10min將酶滅活，同上述斐林試劑滴定法一樣，用反應(yīng)液滴定斐林試劑，滴定至藍色消失時，記錄所用溶液的體積V。所計算的公式同上。2.3試驗方法2.3.1固定化酶的制備（1）酶液的制備糖化酶的最適pH在4.0-4.5之間18，故采用pH為4.

22、6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配置不同濃度的酶溶液。（2）固定化酶的制備分別制取1%，2%，3%，4%的海藻酸鈉溶液，制作時發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增大，粘稠度越大,4%時過稠，用注射器滴小球時，形成的小球不是特別規(guī)則。由張浩等人的微膠囊法固定化糖化酶的研究19可知,當(dāng)海藻酸鈉濃度為2%時，制得固定化酶活力最高。這是因為海藻酸鈉濃度過低時，所形成的海藻酸鈣凝珠不夠致密，糖化酶不能很好地包埋在里面，其包埋率較低，隨著海藻酸鈉濃度的增加，海藻酸鈣凝珠的機械強度增加，表面更加致密，其中的糖化酶很少泄漏，反應(yīng)時底物擴散到小球內(nèi)部也比較困難。借鑒顧旭炯20等人制備固定化酶的方法，稱取1g海藻酸鈉加入到50mL的水中，

23、放入到65的水浴中攪拌溶解，加入5mL一定濃度pH為4.6的酶溶液,待充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，?5mL的注射器21吸取10mL距離氯化鈣溶液液面約10cm處滴入至一定濃度的CaCl2溶液中，形成直徑為3-4mm的海藻酸鈣凝膠珠22，制備過程中還要嚴(yán)格控制滴加的速度23，掌握滴加的力度，使溶液均勻滴出，每一份的制備必須在5min內(nèi)完成。制備完成之后，于4冰箱中靜置一段時間，取出后濾干并用蒸餾水沖洗數(shù)次。在使用之前，將制得的固定化酶放在40的干燥箱中干燥10min至表面的水分蒸干，測定其酶活力。2.3.2海藻酸鈣包埋法固定化葡萄糖淀粉酶的研究按下表2-4進行固定化酶條件的優(yōu)化表2-4 海藻酸鈣包埋法固定

24、化葡萄糖淀粉酶的實驗方案12345678給酶量（mg）51015202530-CaCl2濃度（% m/v）0.51.01.52.02.53.03.54.0形成時間（h）0.512345-（1）給酶量的確定用pH為4.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配置濃度分別為5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml的酶液。取6份2%的海藻酸鈉溶液，分別加入5mL上述濃度的酶液，65下混合均勻后，滴入到2%的CaCl2溶液中，于4下靜置2h。清洗干燥10min后測定酶活力。（2）CaCl2濃度的確定配置八份50mL濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、

25、3.0、3.5、4.0%（m/v）的氯化鈣溶液。稱取一份150mL濃度為2%的海藻酸鈉溶液，加入15mL10mg/ml酶溶液，65下混合均勻后，分別滴入10mL于不同濃度的氯化鈣溶液中，于4下靜置2h。清洗干燥10min后，分別測定酶活力。（3）形成時間的確定稱取一份100mL濃度為2%的海藻酸鈉溶液，加入10mL10mg/ml酶溶液，65下混合均勻后，滴入到2%的CaCl2溶液中，于4下分別靜置0.5、1、2、3、4、5h后取出，清洗干燥10min后，分別測定酶活力。2.3.3正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上選取各因素的最適條件，對海藻酸鈣包埋法固定化葡萄糖淀粉酶做正交試驗24，確定此法固定酶的

26、最佳工藝，并對最佳組合進行試驗來驗證。2.4結(jié)果與討論2.4.1固定化酶 圖2-1 制備的固定化酶如上圖所示，制備出來的固定化酶凝珠直徑約為3-4mm，表面比較光滑，只是有少部分酶帶有小小的尾部，球形不是很規(guī)則，剛剛滴進氯化鈣溶液的凝珠呈透明狀，形成一定時間抽濾出來后，呈白色半透明狀，當(dāng)所含的酶越多時，可以看出凝珠帶有酶的淺棕色，形成的凝珠有一定的彈性，也有一定的硬度。2.4.2給酶量的確定表2-5 不將上述六份含有不同酶量的海藻酸鈣凝珠置于六份50mL濃度為2%的淀粉溶液中，并加入10mLpH為4.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，65下反應(yīng)1h后，立即取出后放入沸水中煮沸10min，搖勻后用

27、移液管取出所有液體，裝入50mL的酸式滴定管中，另取取斐林溶液A、B各5.0mL，置于250mL錐形瓶中，加10mL水稀釋，加熱使其于5min內(nèi)沸騰，在沸騰狀態(tài)下用滴定管滴入上述溶液至藍色即將消失時，加入12滴次甲基藍指示液，繼續(xù)滴定至瓶內(nèi)藍色消失，記錄所用反應(yīng)溶液的體積，并計算酶活力。當(dāng)?shù)味w積在15mL以下時，將反應(yīng)液稀釋2倍，滴定體積記為V2。同給酶量對固定化糖化酶酶活力的影響123456給酶量（mg）51015202530滴定體積（ml）36.2316.30-V2(ml)-26.1521.0321.8121.58酶活力（U）90.12200.32249.73310.53299.4230

28、2.61如圖2-2所示，隨著給酶量的增大，酶活力逐漸增大，當(dāng)給酶量由5mg增加到10mg時，酶活力增加了約2.2倍；當(dāng)給酶量由10mg增加到20mg時，酶活力的增加幅度明顯減小，僅增加了1.55倍；但是當(dāng)給酶量達到20mg時，酶活力變化幅度幾乎不變。這是由于每個海藻酸鈣凝珠的體積是一定的，其中所含的酶結(jié)合位點也是一定的，當(dāng)給酶量達到近20mg時，載體的結(jié)合位點幾乎已經(jīng)被糖化酶飽和，盡管繼續(xù)增加給酶量，所能被包埋的酶量已經(jīng)達到飽和狀態(tài)，所以固定化酶活力不會持續(xù)增大。2.4.3CaCl2濃度的確定酶活力的測定方法同上，數(shù)據(jù)如表2-6所示。表2-6 不同CaCl2濃度對固定化糖化酶酶活力的影響123

29、45678CaCl2濃度（% m/v）0.51.01.52.02.53.03.54.0滴定體積（ml）16.5215.9112.3011.5011.9212.3414.0014.95V2(ml)33.2432.0225.0423.4124.0525.6027.6326.82酶活力（U）196.46203.95260.80278.96271.53255.09236.35243.49通過觀察制備出來的八組海藻酸鈣凝珠發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氯化鈣濃度為0.5%時，滴出的小球不能立即成形，在4下形成2h后，可以看出第一組的凝珠的體積明顯比后面幾組的大，硬度也不及后面的凝珠，經(jīng)過1h的反應(yīng)過后，凝珠的體積又脹大一點，

30、而且有些凝珠已經(jīng)破碎。故反應(yīng)中酶從破碎的凝珠中泄露出來，使結(jié)果中比1%固定的酶的活力大一些。但是工業(yè)生產(chǎn)中存在機械攪拌，酶也不利于回收利用。 由圖2-3可以看出，隨著氯化鈣濃度的增加，固定化酶活力逐漸增加；當(dāng)氯化鈣濃度為2%時，制得的固定化酶活力最高；當(dāng)氯化鈣濃度繼續(xù)增加時，固定化酶活力反而下降。由文獻19可知，當(dāng)使用的氯化鈣濃度過高時，氯化鈣溶液中的鈣離子通過三個水分子達到與糖化酶絡(luò)合的目的，使固定化酶與底物作用的活性部位被封閉，從而是固定化酶的活力降低了；另一方面，太高的氯化鈣濃度，會使得形成的凝珠較硬，海藻酸鈣網(wǎng)孔過小25，阻礙了底物與酶的反應(yīng)。而氯化鈣濃度過低時，形成的網(wǎng)孔比較大，每次

31、用蒸餾水沖洗后，流失了一定的酶，導(dǎo)致酶活力較低。2.4.4形成時間的確定表2-7 不同形成時間對固定化糖化酶酶活力的影響123456形成時間（h）0.512345滴定體積（ml）12.2525.8422.5021.2124.6825.25V2(ml)25.03-酶活力（U）260.90126.36145.12153.95132.30129.31由圖2-4可知，當(dāng)形成時間為0.5h時，酶活力最大，為260.90U；當(dāng)形成時間從1h變到5h時，酶活力呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在形成時間為3h時達到最大酶活力，為153.95U。形成時間很短的時候，酶活力最大，可能由于海藻酸鈉和氯化鈣中的鈣離子反應(yīng)生成

32、致密的海藻酸鈣凝膠，將酶包埋在內(nèi)，是一個過程，需要一定的時間來完成，如果時間過短，酶沒有很好地包埋，所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔隙也比較大，在反應(yīng)的過程中，酶容易從載體中泄漏出來；但是如果時間過長，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)會更致密，使得底物進入海藻酸鈣凝珠內(nèi)與糖化酶反應(yīng)受到阻礙，所以體現(xiàn)出酶活力的下降。所以綜上，形成時間為3h時最適宜。2.4.5正交試驗選取三個因素：給酶量、氯化鈣濃度、形成時間進行優(yōu)化并探討其顯著性。設(shè)計的正交試驗參考劉思聰26的研究。根據(jù)單因素實驗結(jié)果做正交試驗，海藻酸鈣包埋法固定葡萄糖淀粉酶的因素水平表見表2-8。表2-8 海藻酸鈉包埋法固定葡萄糖淀粉酶的因素水平表水平因素給酶量（mg）C

33、aCl2濃度（% m/v）形成時間（h）1181.52.52202.033222.53.5表2-9 海藻酸鈣固定化葡萄糖淀粉酶的正交試驗結(jié)果實驗號A CaCl2濃度（%）B形成時間（h）C給酶量（mg）滴定體積（ml）酶活力（U）11（1.5%）1(2.5)1(18)21.48152.01212(3)3(22)14.72（29.41）217.53313(3.5)2(20)14.83（29.50）221.3742（2%）1313.00（26.45）246.86522213.91（27.73）235.50623114.70（29.34）222.5773(2.5%)1217.51186.488321

34、18.21179.31933314.59（29.25）223.26K1590.91585.35553.89K2704.93632.34643.35K3589.05667.20687.65k1196.97195.12184.63k2234.98210.78214.45k3196.35222.40229.22R38.6327.2844.59其中K代表各水平實驗結(jié)果總和，k代表各水平實驗結(jié)果平均值，R為極差，也就是這一列中最好與最壞結(jié)果的差值。由表2-9可知，A2B3C3為最優(yōu)組合，即氯化鈣濃度為2%，形成時間為3.5h，給酶量為22mg的固定化條件下，固定化酶活力達到最高。由極差可以看出，固定化酶

35、制備的以上三個因素中，給酶量對固定化酶的酶活力影響最為顯著，其次為氯化鈣的濃度，最不明顯的是形成時間。在正交表中沒有A2B3C3，因此在氯化鈣濃度為2%，形成時間為3.5h，給酶量為22mg的固定化條件下驗證試驗，得到A2B3C3組合固定化酶活力達到267.32U，單位質(zhì)量的酶活力為12151U/g。2.5小結(jié)（1） 控制給酶量為變量時，取氯化鈣濃度為2%，形成時間為2h，當(dāng)給酶量為20mg時，酶活力達到最大，為310.53U。（2） 控制氯化鈣濃度為變量時，取給酶量為10mg，形成時間為2h，當(dāng)氯化鈣濃度為2%時，酶活力達到最大，為278.96U。（3） 控制形成時間為變量時，取給酶量為10

36、mg，氯化鈣濃度為2%，當(dāng)形成時間為3h時，酶活力達到最大，為153.95U。（4）通過三因素三水平正交試驗得出，氯化鈣濃度為2%，形成時間為3.5h，給酶量為22mg是最佳組合，固定化酶活力達到267.32U，單位質(zhì)量的酶活力為12151U/g。 3 海藻酸鈣固定化葡萄糖淀粉酶特性的研究固定化酶相比于游離酶，它的結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，因為當(dāng)酶被包埋在一個穩(wěn)定的環(huán)境中后，固定化酶對于外界的環(huán)境的承受力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于游離酶，特別是針對這些3-4mm的凝珠，在反應(yīng)過后也利于回收，用于重復(fù)使用，相比于游離酶來說，是一個很大的優(yōu)勢。本章著重對動力學(xué)常數(shù)，重復(fù)使用穩(wěn)定性做了研究。3.1材料和方法3.1.1實驗材料和

37、試劑表3-1 實驗試劑與材料藥品名純度生產(chǎn)廠家可溶性淀粉分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司碘（粒狀）分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司碘化鉀分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司鹽酸分析純成都市科龍化工試劑廠重蒸酚分析純成都市科龍化工試劑廠3,5-二硝基水楊酸分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司亞硫酸鈉分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司3.1.2儀器與設(shè)備紫外可見分光光度計（UV752，上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司）3.2測定方法3.2.1酶活力的測定將一定量固定化酶與淀粉溶液在最適條件下（pH為4.6,溫度為65）反應(yīng)一定的時間，然后取上述反應(yīng)液用DNS法測定還原糖含量，得出各管的吸光度，再由葡萄糖標(biāo)

38、準(zhǔn)曲線的方程式得出所生成的葡萄糖的含量，最后換算成酶活力。將葡萄糖淀粉酶反應(yīng)的最適溫度和pH下，每小時生成1mg葡萄糖所需的酶量定為一個活力單位，即1IU=1mg/h。3.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備按表3-2量取試劑，測定各管的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表3-2 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線濃度的量取管號葡萄糖液/ml蒸餾水/mlDNS試劑/ml蒸餾水/ml葡萄糖濃度/（mg/ml）A540101.0180020.10.9180.10.08930.20.8180.20.23840.30.7180.30.37550.40.6180.40.49160.50.5180.50.64370.60.4180.60.7178

39、0.70.3180.70.86490.80.2180.81.0073.3試驗方法3.3.1葡萄糖淀粉酶米氏常數(shù)的測定（1）游離酶米氏常數(shù)的測定取不同濃度的可溶性淀粉進行比色反應(yīng)，具體操作見表3-3表3-3 淀粉濃度梯度吸光度1234564%可溶性淀粉（ml）0.511.522.53H2O(ml)3.532.521.51緩沖液（ml）0.750.750.750.750.750.75蒸餾水（ml）0.250.250.250.250.250.25充分搖勻，60放置10min加入3.0ml的0.2mol/L HCl，搖勻取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液顯色，再取1ml稀釋10倍，以稀碘液為對照

40、A6600.2180.3460.4380.5120.6110.685配置1mg/ml的葡萄糖淀粉酶。按照表3-4測定游離酶的Km。表3-4 游離酶的Km測定1234564%可溶性淀粉（ml）0.511.522.53H2O(ml)3.532.521.51緩沖液（ml）0.750.750.750.750.750.7560放置，預(yù)熱5min酶液（ml）0.250.250.250.250.250.25充分搖勻，60放置10min加入3.0ml的0.2mol/L HCl，搖勻取出1.0ml溶液置于5.00ml稀碘液顯色，再取1ml稀釋10倍，以稀碘液為對照A6600.0230.1090.1790.266

41、0.3650.413可溶性淀粉濃度（%）0.51.01.52.02.53.01/S20010066.67504033.33V0.1950.2370.2590.2460.2460.2721/V5.134.223.864.073.763.68（2） 固定化酶米氏常數(shù)的測定試劑的加入如表3-3，只是在將取好的六組淀粉溶液放在60的熱水中預(yù)熱5min后，向各試管中加入1g的固定化酶，結(jié)果如表3-5所示。表3-5 固定化酶的Km測定123456A6600.0840.1780.2530.3120.4100.480可溶性淀粉濃度（%）0.51.01.52.02.53.01/S20010066.6750403

42、3.33V0.1340.1680.1850.2000.2010.2051/V7.465.955.405.014.984.88根據(jù)參加反應(yīng)的底物濃度和酶的反應(yīng)速度作出Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線27,如圖3-2可知。由作圖得出的回歸方程求出游離酶的Km為2.50mg/ml，固定化酶的Km為3.63mg/ml，顯然，固定化酶的Km比游離酶的大一些，也就是說明酶經(jīng)過固定化以后，它與底物的親和力降低了，造成這一結(jié)果的主要原因是酶被固定在載體內(nèi)，底物和酶接觸存在一定的空間阻礙，底物和酶的擴散都受到了一定的限制。相比于陳雄等人利用交聯(lián)法制備的固定化酶28，包埋法的親和力更大。3.3.2 重復(fù)使

43、用穩(wěn)定性的測定（1）固定化酶的制備吸取2ml的海藻酸鈉和酶液的混合液滴到氯化鈣溶液中，其他步驟同上。（2）DNS法測還原糖29取10支試管，各加入10ml的2%的淀粉溶液和2ml的pH為4.6的緩沖液，先將第一支試管放入65的水中預(yù)熱5min，然后加入制備好的固定化酶，準(zhǔn)確反應(yīng)10min后，搖勻，取出1ml的反應(yīng)液，然后過濾反應(yīng)液，回收固定化酶，并用蒸餾水清洗數(shù)次，再將第二支試管放入水浴鍋中重復(fù)上述步驟，直到第十支試管。將取出的1ml的反應(yīng)液中各加入1ml的DNS，沸水浴10min，取出后再各加入8ml的蒸餾水，最后在540nm下測吸光度。結(jié)果如表3-6所示。表3-6 重復(fù)使用后還原糖的測定1

44、2345678910OD5401.4881.4331.2371.3241.3691.2521.2041.0830.8450.734G/mg14.2713.7411.8812.7113.1412.0211.5710.428.167.10隨著使用次數(shù)的增加，生成的葡萄糖的量逐漸減少，也就相當(dāng)于酶活力逐漸降低。在使用第三次時，酶活力下降幅度較大，可能是由于經(jīng)過了兩次清洗，是結(jié)合不夠牢固的酶脫落了；而第四次和第五次又有稍微上升的趨勢，可能是由于長時間泡在溶液中，將凝膠表面的孔隙變得比之前大一些30，使底物和產(chǎn)物更易進出，直到使用的次數(shù)的增加，酶經(jīng)過反應(yīng)、清洗等過程不斷的泄漏，活性也就不斷下降；使用10

45、次之后，酶活性還有原來的50%。觀察反應(yīng)后酶的變化可知，當(dāng)使用次數(shù)達到五次時，酶的體積稍微有點增大，到使用第六次的時候，部分固定化凝珠出現(xiàn)了從中間溶脹裂開的現(xiàn)象。但是相對于游離酶來說，固定化酶具有一定的體積，便于我們回收利用，酶本身價格昂貴，固定化酶的使用也可以為工業(yè)生產(chǎn)會減輕一定的成本。3.4小結(jié)（1）海藻酸鈣固定化糖化酶的米氏常數(shù)與游離酶的相差不是很大，游離酶的Km為2.50mg/ml，固定化酶的Km為3.63mg/ml，也就是通過固定化之后，酶對底物的親和力降低了。（2）隨著使用次數(shù)的增加，酶活性逐漸降低，但是每次反應(yīng)10min，在使用10次之后，酶活性還有原來的50%。4結(jié)論與展望4.

46、1結(jié)論本次研究采用的是海藻酸鈉為載體，利用包埋法固定葡萄糖淀粉酶。篩選出了固定化酶的制備時的最適給酶量、氯化鈣濃度、形成時間，在此基礎(chǔ)上，也進一步研究了固定化酶的米氏常數(shù)和重復(fù)使用穩(wěn)定性。（1）在單因素實驗基礎(chǔ)上，通過三因素三水平正交試驗得出，氯化鈣濃度為2%，形成時間為3.5h，給酶量為22mg是最佳組合，固定化酶活力達到267.32U，單位質(zhì)量的酶活力為12151U/g。（2）游離酶的Km為2.50mg/ml，固定化酶的Km為3.63mg/ml，通過固定化之后，酶對底物的親和力降低了。（3）隨著使用次數(shù)的增加，酶活性逐漸降低，但是每次反應(yīng)10min，在使用10次之后，酶活性還有原來的50%

47、。4.2展望 國內(nèi)外研究的葡萄糖淀粉酶的固定化技術(shù)很多，但是還是存在一些問題有待解決。（1） 固定化酶的酶活力相對于游離酶來說還不是很高，需要對載體、固定化方法、制備條件做出進一步的研究。（2） 實驗室中制備固定化酶時是采用的人工用注射器滴加，在工業(yè)生產(chǎn)中還需研制一種利于工業(yè)自動化制備固定化酶的機器。（3） 試驗中還發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)過的固定化酶若不進行及時處理，長時間浸泡在反應(yīng)液中，部分固定化酶會溶解；若將剛制備的固定化酶長時間暴露在空氣中，固定化酶也會慢慢失水變干，萎縮成粒狀。所以要加強對生產(chǎn)的固定化酶的保存的研究，使固定化酶更適合于工業(yè)生產(chǎn)中。致 謝衷心感謝我的指導(dǎo)老師劉颋老師。本論文從選題到完

48、成，都離不開劉老師的悉心指導(dǎo)。在此，謹(jǐn)向劉老師表示崇高的敬意和衷心的感謝！在開題之初，劉老師給我詳細(xì)地講解了本論文的研究內(nèi)容和方向，還為我們查找了大量的文獻，要求我大量閱讀，并且理出本次試驗的思路，書面寫出所用的材料和儀器、步驟，并大致估計預(yù)期試驗結(jié)果；實驗過程中，劉老師也給予了我很大的幫助，實驗開始進行并不是那么順利，總會出現(xiàn)一些我自己無法解決的問題，知識上本身也有一定的欠缺，思考問題也不是很周全，但是每一次出現(xiàn)的問題，劉老師都能耐心指導(dǎo)，熱心和我們探討，找出解決方法，在這個過程中，劉老師還培養(yǎng)了我自己的動手能力和及時做實驗結(jié)論的好習(xí)慣；在論文寫作方面，劉老師為我的論文寫作做出了詳盡的修改。感謝楊裕啟老師為我實驗過程中提供的藥品和楊老師的無私指導(dǎo)。同時，也非常感謝朱曉峰同學(xué)、張開同學(xué)在實驗過程中的無私幫助和支持。最后感謝所有關(guān)心和幫助我的老師、同學(xué)、親人。 參考文獻1 郭偉利,侯紅萍.磁性殼聚糖微球固定化糖化酶的研究J.釀酒科技.2010, (3):17-19.2 顧旭炯.雙酶體系的共固定化及其動力學(xué)研究D.浙江:浙江工業(yè)大學(xué),2006.3 李柱來,陳盛,康杰.-淀粉酶在殼聚糖上的固定化研究J.福建醫(yī)學(xué)院學(xué) 報,1994,28(3):273-276.4 吳頡.磁性高分子微球固定化-淀粉酶的研究D.黑龍江: