SN檢測工作技術(shù)應(yīng)用

1、SN檢測工作技術(shù)應(yīng)用內(nèi)容簡介1 SNP 概概 念念2 SNP 特特 點(diǎn)點(diǎn)3 SNP 檢檢 測測 技技 術(shù)術(shù)4 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn)SNP 的概念 單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于單個(gè)核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個(gè)體的同一條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個(gè)堿基不同的現(xiàn)象，即SNP。 它包括單堿基的轉(zhuǎn)換, 顛換、 插入及缺失等形式SNP在基因組內(nèi)的形式:一是遍布于基因組的大量單堿基變異; 二是分布在基因編碼區(qū)(coding region) , 稱其為cSNP，屬功能性突變。 SNP

2、在單個(gè)基因或整個(gè)基因組的分布是不均勻的： （1）非轉(zhuǎn)錄序列要多于轉(zhuǎn)錄序列（2）在轉(zhuǎn)錄區(qū)非同義突變的頻率, 比其他方式突變的頻率低得多。 SNP 的特點(diǎn) 在遺傳學(xué)分析中, SNP 作為一類遺傳標(biāo)記得以廣泛應(yīng)用, 主要源于這幾個(gè)特點(diǎn): （1）密度高SNP在人類基因組的平均密度估計(jì)為 11000 bp , 在整個(gè)基因組的分布達(dá) 3106個(gè), 遺傳距離為 23cM , 密度比微衛(wèi)星標(biāo)記更高, 可以在任何一個(gè)待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標(biāo)記。（2）富有代表性某些位于基因內(nèi)部的SNP 有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平, 因此, 它們可能代表疾病遺傳機(jī)理中的某些作用因素。 SNP 的特點(diǎn)（3）遺傳穩(wěn)定

3、性 與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo)記相比, SNP 具有更高的遺傳穩(wěn)定性。（4）易實(shí)現(xiàn)分析的自動化SNP標(biāo)記在人群中只有兩種等位型(allele) 。這樣在檢測時(shí)只需一個(gè)“ + - ”或“全無”的方式，而無須象檢測限制性片段長度多態(tài)性，微衛(wèi)星那樣對片段的長度作出測量，這使得基于SNP的檢測分析方法易實(shí)現(xiàn)自動化。一、 SNPs經(jīng)典檢測方法一大類是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法,如: 1 . 限制性片段長度多態(tài)性法 PCR- RFLP ; 2 .單鏈構(gòu)象多態(tài)性法 PCR- SSCP ; 3 . 變性梯度凝膠電泳 ( dena t ur i ng gradient gel eletrophores

4、i s DGGE ); 4 .等位基因特異性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等PCR-RFLP方法 原理：原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點(diǎn)，酶切片斷的長度和數(shù)量則會出現(xiàn)差異，根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位點(diǎn)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：該技術(shù)應(yīng)用的前提是SNP的位點(diǎn)必須含有該限制內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，它是SNP篩查中最經(jīng)典的方法之一.PCR-RFLP原理圖單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP) 原理：原理：單鏈DNA 在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)，不同的二級結(jié)構(gòu)在電泳中會出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級結(jié)構(gòu)

5、依賴于堿基的組成，單個(gè)堿基的改變也會影響其構(gòu)象，最終會導(dǎo)致在凝膠上遷移速度的改變。 在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈 DNA 和RNA 分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構(gòu)象，這樣在凝膠上的遷移速率不同，出現(xiàn)不同的條帶，檢測SNP。特點(diǎn)：特點(diǎn)：由于該方法簡單快速，因而被廣泛運(yùn)用于未知基因突變的檢測。這種方法的弊端在于不能確定突變類型和具體位置。變性梯度凝膠電泳（DGGE） 原理：原理：是利用長度相同的雙鏈 DNA片段解鏈溫度不同的原理,通過梯度變性膠將 DNA片段分開的電泳技術(shù)。 電泳開始時(shí),DNA 在膠中的遷移速率僅與分子大小有關(guān), 而一旦DNA 泳動到某一點(diǎn)時(shí), 即到達(dá)該DNA 變性濃

6、度位置時(shí), 使得DNA 雙鏈開始分開,從而大大降低了遷移速率。當(dāng)遷移阻力與電場力平衡時(shí), DNA 片段在凝膠中基本停止遷移。由于不同的DNA 片段的堿基組成有差異, 使得其變性條件產(chǎn)生差異, 從而在凝膠上形成不同的條帶。等位基因特異 PCR ( AS-PCR)原理：原理：根據(jù) SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物,其中一條鏈(特異鏈)的3末端與 SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)(或相同) ,另一條鏈(普通鏈)按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì),因此,AS-PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記。因?yàn)樘禺愐镌谝环N基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物,在另一種基因型中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物,用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無,從而確定基因型的 SNP。S

7、NPs高通量的檢測方法 另一大類檢測方法是近些年來發(fā)展起來的, 高通量、 自動化程度較高的檢測 SNPs的方法,較為常用的有: 1 . DNA測序法; 2 . DNA芯片檢測; 3 . 飛行質(zhì)譜儀 (MALDI- TOFMS )檢測; 4 . 變性高效液相色譜 ( DH PLC )法等等DNA測序法直接測序是最容易實(shí)施的SNP檢測方法。原理原理: 通過對不同個(gè)體同一基因或基因片段進(jìn)行測序和序列比較, 以確定所研究的堿基是否變異, 其檢出率可達(dá)100%。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：可以得到SNP 的類型及其準(zhǔn)確位置等SNP分型所需要的重要參數(shù)?；蛐酒夹g(shù)( Genechips) 原理原理: :是將具有特定堿

8、基序列的探針固定在特殊的載體上，待測基因經(jīng)提取、熒光標(biāo)記后，與固定好的探針進(jìn)行雜交，最后根據(jù)熒光的強(qiáng)度和種類測出待測序列的堿基類別。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：基因芯片具有信息量大和自動化程度高的突出優(yōu)點(diǎn)。但它也存在若干問題: 芯片造價(jià)高昂, 所需設(shè)備貴重, 不利于普及應(yīng)用。MALDI-TOF 原理：原理：是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過與硅芯片上的化合物共價(jià)結(jié)合后, 在硅芯片上進(jìn)行引物的退火, 延伸反應(yīng), 突變部位配對的堿基與正常配對的堿基不相同。根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測SNP。變性高效液相色譜( DHPLC)原理：原理：目標(biāo)核酸片段PCR擴(kuò)增，部分加熱變性后，

9、含有突變堿基的DNA序列由于錯(cuò)配堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈。因包含錯(cuò)配堿基的雜合異源雙鏈區(qū)比完全配對的同源配對區(qū)和固定相的親和力弱，更易被從分離柱上洗脫下來, 從而達(dá)到分離的目的。SNPs的有無最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形或數(shù)目差異,依據(jù)此現(xiàn)象可很容易從色譜圖中判斷出突變的堿基。特點(diǎn)：特點(diǎn)：使用高效液相色譜檢測SNPs具有檢測效率高，便于自動化的優(yōu)點(diǎn)，對未知SNPs的準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上。但DHPLC檢測對所用試劑和環(huán)境要求較高,容易產(chǎn)生誤差, 不能檢測出純合突變。MassARRAY SNP分型的方法多種多樣，MassARRAY分子量陣列技術(shù)是Sequenom公司推出的世界上領(lǐng)先的基因分析

10、工具，通過引物延伸或切割反應(yīng)引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏、可靠的MALDITOF質(zhì)譜質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基因分型檢測。 基于MassARRAY 分子量陣列平臺的iPLEX GOLD技術(shù)可以設(shè)計(jì)最高多達(dá)40重PCR反應(yīng)和基因型檢測，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)非常靈活，分型結(jié)果準(zhǔn)確性高。特別適合于對全基因組研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，或者是有限數(shù)量的研究位點(diǎn)已經(jīng)確定的情況。MassARRAY技術(shù)原理技術(shù)原理: 先通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在 SNP 位點(diǎn)上，延伸 1個(gè)堿基。將制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜儀的真空管經(jīng)強(qiáng)激光激發(fā)，核酸分子解吸附為單電荷離子，電場中離子飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛行時(shí)間而獲得樣品分析物的精確分子量，從而檢測出SNP位點(diǎn)信息。MassARRAY技術(shù)原理技術(shù)原理:MassEXTEND單堿基延伸反應(yīng)，緊挨SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一段探針，在反應(yīng)體系中以ddNTP替代dNTP，使探針僅在SNP位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基即終止。根據(jù)SNP位點(diǎn)的不同，探針將結(jié)合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質(zhì)譜儀即可檢測出這種