m6去甲基化酶alkbh5通過影響foxm1表達和自我維持膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性

1、The m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicityof Glioblastoma Stem-Like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Programm6A去甲基化酶ALKBH5通過影響FOXM1表達和自我更新維持膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性Cancer CellIF：27.407April 10, 2017：Wendy匯目 錄CONTENTSPART 03結(jié)果PART 04借鑒總結(jié)PART 01背景介紹PART 02思路PART 05衍生定題1.背景介紹背景介紹G

2、lioblastoma（膠質(zhì)瘤）實體腦部腫瘤存活率低，易復發(fā)膠質(zhì)瘤干細胞：自我更新抗化療放療調(diào)控機制未知膠質(zhì)瘤干細胞如何調(diào)節(jié)自我更新和致瘤性？背景介紹修飾m6A在膠質(zhì)瘤中如何？ALKBH5cALKBH5 ：哺乳動物RNA 去甲基化酶N6甲基腺苷：體內(nèi)常見mRNA修飾物c膠質(zhì)瘤中DNA 甲基化很常見且研究多RNA m6A的甲基化機制未知ALKBH5與腫瘤的研究較少ALHBH5是如何調(diào)控在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮去甲基化作用的？膠質(zhì)瘤中調(diào)控RNA甲基化？背景介紹Transcription factor FOXM1FOXM1：參與細胞，G1/S 和 G2/M 轉(zhuǎn)換,S期抑制FOXM1：膠質(zhì)瘤中過表達，預后差調(diào)節(jié)

3、膠質(zhì)瘤干細胞增殖調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤干細胞自我更新調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤干細胞致瘤性FOXM1在膠質(zhì)瘤癌干細胞中與m6A的功能未知FOXM1受誰調(diào)控？ 如何調(diào)控？2.思路思路膠質(zhì)瘤干細胞中ALKBH5表達情況ALKBH5R如何調(diào)節(jié)底物的功能ALKBH5R和底物的結(jié)合方式ALKBH5對膠質(zhì)瘤干細胞的增殖和自我更新以及致瘤性有何影響？ALKBH5R底物的功能是？（即在膠質(zhì)瘤中的作用）ALKBH5的調(diào)節(jié)底物是ALKBH5R和底物間的相互作用受什么影響思路檢測ALKBH5在GSC中的表達情況生信 RNA-seq analysis免疫熒光 WBEDU增殖體釋稀ALKBH5對膠質(zhì)瘤干細胞的影響自我更新小鼠預后分析和成瘤實驗致瘤

4、性PIA分析 RNA seqALKBH5的底物篩選ALKBH5對底物FOMX1的影響qPCR WB 免疫熒光報告RNA seqALKBH5如何調(diào)控FOMX1RIPPull down調(diào)節(jié)方式RIP WBF-AS調(diào)節(jié)功能F-AS調(diào)節(jié)方式ALKBH5如何影響FOMX1和HuR的關(guān)系FOMX1相互作用蛋白篩選RIPF-AS如何調(diào)節(jié)ALKBH5和FOXM1的相互作用FOMX1上游調(diào)節(jié)因子尋找生信EDU增殖稀體釋自我更新小鼠預后分析和成瘤實驗致瘤性結(jié)合位點3.結(jié)果 3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？

5、 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的增殖2.3 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達，在膠質(zhì)瘤中是一個負向預后因子1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達，在膠質(zhì)瘤是一個負向預后因子中結(jié)果RNA seqA.生信ALKBH5高表達的GSC，存活率低；B.不同細胞ALKBH5表達量分析C.免疫組化檢測ALKBH5和SOX2表達分析；D，相關(guān)性分析E.RNA seq 分析不同GCM和GSC中ALKBH5表達量分析 3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞

6、中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的增殖2.3 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達，在膠質(zhì)瘤中是一個負向預后因子 結(jié)果2.1 ALKBH5促進GSC 自我更新三種GSC細胞系F.體外有限稀釋實驗證明干擾ALKBH5，抑制GSC自我更新結(jié)果2.2 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的增殖膠質(zhì)瘤細胞膠質(zhì)瘤干細胞A.

7、ALKBH5對膠質(zhì)瘤細胞的存活率無影響；B. 干擾ALKBH5引起GSC G0期阻滯A.細胞存活率檢測；B.BrdU檢測細胞增殖；結(jié)果2.3 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性C.干擾ALKBH5抑制GSC自我更新；拯救實驗恢復自我更新能力；突變酶活位點不能拯救自我更新能力。D.干擾ALKBH5促進GSC小鼠的存活率； E.干擾ALKBH5抑制小鼠GSC體積小結(jié)表達高表達不表達增殖自我更新致瘤性ALKBH5膠質(zhì)瘤干細胞膠質(zhì)瘤正常 3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和

8、FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的增殖2.3 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達，在膠質(zhì)瘤中是一個負向預后因子結(jié)果3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物 RNA seq深度 分析，找到m6A序列m6A 相關(guān)膠質(zhì)瘤干細胞相關(guān)ALKBH5相關(guān) 找到單一峰選擇不同GSC干細胞系兩種shRNA進行干擾結(jié)果3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物分析干擾ALKBH5BCm6A分析IPA分析A.干擾GSC中ALKBH5的表達后，分析差異性（兩個細

9、胞系，2個shRNA取交集）；B.干擾ALKBH5后，GSC中腺苷酸甲基化N6位甲基化水平（即m6A）上升C.RNA seq深度發(fā)現(xiàn)干擾ALKBH5后，GGACU這個序列中A的甲基化上升D.干擾ALKBH5后，唯一的峰有5053個結(jié)果3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物篩選得到12個，與ALKBH5以及m6A相關(guān)，以及單一峰值的只有12個結(jié)果3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物85個FFOXM1的靶包含在內(nèi)且符合趨勢進一步分析85個，發(fā)現(xiàn)F中表明FOXM1的均為FOXM1的靶可能性很大結(jié)果3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物小結(jié) ALKBH5 膠質(zhì)瘤干細胞m6A底物16

10、個下游FOMX1 3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的增殖2.3 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達，在膠質(zhì)瘤中是一個負向預后因子結(jié)果4.1 ALKBH5 促進 FOXM1的表達A,B.干擾ALKBH5抑制FOMX1mRNA和蛋白表達；D,E，F(xiàn).免疫熒光分析ALKBH5和FOXM1的

11、共及相關(guān)性分析結(jié)果4.2 FOXM1 前體轉(zhuǎn)錄本是 ALKBH5的底物RNA的轉(zhuǎn)錄沒影響RNA的轉(zhuǎn)運沒影響RNA的穩(wěn)定性沒影響 3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的增殖2.3 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達，在膠質(zhì)瘤中是一個負向預后因子結(jié)果5.1 FOMX1 轉(zhuǎn)錄本分析Foxm1轉(zhuǎn)

12、錄本分析FOXM1轉(zhuǎn)錄本分析以及引物設計結(jié)果5.1 FOXM1 前體轉(zhuǎn)錄本是 ALKBH5的底物RNA聚合酶抑制劑HuR:核內(nèi)RNA結(jié)合蛋白F.干擾ALKBH5抑制FOXM1前體轉(zhuǎn)錄本的表達；分析；G.ALKBH5G.免疫組化進行ALKBH5分析結(jié)果5.2.ALKBH5結(jié)合FOXM1的 3UTR端B.Foxm1的3UTR在干擾ALKBH5 N6腺苷酸會被去甲基化A.甲基化峰檢測，F(xiàn)oxm1 3UTR上有單一峰結(jié)果5.3. 證實ALKBH5調(diào)節(jié)FOXM1的 3UTR端mRNA水平蛋D.包括3UTR序列的FOXM1才會在干擾ALKBH5后被降解包含有3UTR的序列有作用E.報告實驗進一步驗干擾AL

13、KBH5后會抑制含有3UTR片段的FOXM1的表達結(jié)果5.4. ALKBH5促進HuR 和FOXM1 轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄本相互作用mRNAD. 干擾ALKBH后減少了HUR和FOMX1之間的結(jié)合E，F(xiàn). FOXM1和HuR間的關(guān)系：干擾HuR 抑制FOXM1的轉(zhuǎn)錄蛋白小結(jié)轉(zhuǎn)錄和蛋 ALKBH5 FOXM1底物調(diào)控3UTRHuRPre-FOMX1 mRNA相互作用 3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1

14、 ALKBH5促進GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的增殖2.3 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達，在膠質(zhì)瘤中是一個負向預后因子結(jié)果6.1.FOXM1-AS 是FOXM1起始轉(zhuǎn)錄本的核 lncRNAA.F-AS結(jié)構(gòu)分析于核C.F-ASB.在膠質(zhì)瘤及干細胞中的表達分析結(jié)果6.2. 證實FOXM1-AS 是FOXM1起始轉(zhuǎn)錄本的核 lncRNA相關(guān)性分析mRNA水平蛋A,B.干擾F-AS后，抑制FOXM1表達； C.F-AS和FOXM1表達呈正相關(guān)F-as和FOMX1前體作用AMT:不影響蛋白間相互作用的一個RNA-RNA固定物注：探針無f

15、omx1結(jié)合區(qū)域；用探針拉F-asF.F-AS和FOXM1前體轉(zhuǎn)錄本結(jié)合D.F-AS和ALKBH5相互作用： 用ALKBH5拉到了F-ASE.F-AS探針檢測到ALKBH5證明F-AS可以和ALKBH5直接結(jié)合正向反向拉結(jié)果6.3. FOXM1-AS 有利于ALKBH5 和 FOXM1起始轉(zhuǎn)錄本的相互作用結(jié)果6.4. FOXM1-AS 是一個核 lncRNA 有利于ALKBH5 和 FOXM1起始轉(zhuǎn)錄本的相互作用反向?qū)嶒灒?.3是干擾ALKBH5,此處是干擾F-AS 后反證，進一步表明三者的結(jié)合作用K.值得注意的是：干擾F-AS后， HUR富集量也減少了小結(jié)LNCRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)合能力F-AS促進

16、ALKBH5和FOMX1的結(jié)合發(fā)揮促進FOMX1 mRNA的轉(zhuǎn)錄的作用Pre-FOMX1 mRNAALKBH5F-ASPre-FOMX1 mRNA 3. 分析膠質(zhì)瘤干細胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的增殖2.3 ALKBH5促進膠質(zhì)瘤干細胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達，在膠質(zhì)瘤中是一個負向預后因子結(jié)果7. 1 FOXM1-

17、AS 促進GSC的增殖自我更新和成瘤性D, E.抑制F-AS抑制GSC的增殖；F.抑制F-AS抑制GSC的自我更新結(jié)果7. 2 FOXM1-AS 促進GSC的干性G.神經(jīng)分化的標志檢測；干擾A,B:多能性檢測；過表達結(jié)果7.3. FOXM1 拯救 由 ALKBH5 或FOXM1-AS敲除引起的GSCs增殖抑制A. FOXM1拯救ALKBH5干擾引起的FOXM1的下游抑制量化分析B.FOXM1拯救ALKBH5或F-AS干擾引起的GSC腫瘤生長抑制結(jié)果7.4. FOXM1 恢復 由 ALKBH5 或FOXM1-AS敲除引起的GSCs增殖抑制移植瘤增殖干性拯救干擾F-AS引起的增殖和干性抑制拯救干擾

18、ALKBH5引起的增殖和干性抑制小結(jié)FOXM1可以拯救干擾ALKBH5或F-AS引起的生物學效應：拯救移植瘤中干性表達拯救膠質(zhì)瘤形成拯救FOXM1靶表達機制圖4.總結(jié)借鑒9.總結(jié)可借鑒的方法及內(nèi)容正常細胞癌細胞癌干細胞借鑒點1做對比實驗案例改進9.總結(jié)可借鑒的方法及內(nèi)容借鑒點2篩選處證據(jù)十分充足，不僅尋找功能相關(guān)差異顯著的，還考慮到的下游9.1 總結(jié)可借鑒的方法及內(nèi)容1.顱內(nèi)腫瘤實驗：小鼠隨機分組。存活率實驗：小鼠顱內(nèi)注射10,000 GSCs 直到垂死 或注射后 80 天。 拯救實驗： GSCs 利用 ALKBH5 或 FOXM1-AS shRNA共轉(zhuǎn)染 FOXM1,ALKBH5 質(zhì)粒。 50,000 GSCs 顱內(nèi)注射進入小鼠 (n = 8). 注射后30天 （GSC11） ，20 天（GSC17小鼠安樂死并 收獲大腦。