細(xì)菌生物膜技術(shù)

1、“生物膜技術(shù)”：關(guān)于微生物膜研究的一項(xiàng)多學(xué)科的綜述Esther Karunakaran·Joy MukherjeeBharathi Ramalingam·Catherine A.Biggs摘要 人們對(duì)生物膜形成的研究不是一個(gè)新的現(xiàn)象。生物膜的普遍存在及其意義和各種形成過程鼓勵(lì)人在這個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)長(zhǎng)達(dá)四十年的廣泛研究。在這篇評(píng)論當(dāng)中，我們強(qiáng)調(diào)來自不同學(xué)科的技術(shù)。我們用這些技術(shù)已經(jīng)成功地描述了細(xì)胞外、細(xì)胞膜以及細(xì)胞內(nèi)部的成分。這些成分對(duì)了解生物膜的形成起著很重要的作用。為了減少對(duì)研究生物膜的復(fù)雜性，以前的研究者通常采用帶有學(xué)科性質(zhì)的具體方法單獨(dú)地去研究生物膜的不同組成成分。最近有些

2、研究主張綜合不同的技術(shù)對(duì)生物膜得到更加全面的認(rèn)識(shí)，但是這種方法一直處于初期階段。為了獲得對(duì)生物膜形成過程全面的認(rèn)識(shí)以及確切地闡述有效的生物膜控制方法，在接下來的十年里研究人員應(yīng)該意識(shí)到對(duì)生物膜的研究（換就話說，生物膜技術(shù)逐漸形成一門獨(dú)立學(xué)科），以及多學(xué)科綜合研究在這一領(lǐng)域的重要性。關(guān)鍵詞 生物膜 生物膜技術(shù) 細(xì)胞外的 細(xì)胞內(nèi)的 多學(xué)科的 細(xì)胞膜引言 在自然界，細(xì)菌以本身彼此粘連形成的組織或者以細(xì)胞膜粘連而形成固著的組織而存在。這種組織對(duì)所處環(huán)境的變化能夠做出反應(yīng)以及能夠適應(yīng)環(huán)境的變化，或者像多細(xì)胞組織一樣執(zhí)行特殊任務(wù)(Costerton et al. 1999, OTooleet al. 20

3、00; Hall-Stoodley and Stoodley 2002)。細(xì)菌的生物膜是指細(xì)胞和細(xì)胞外界聚合物接界以及細(xì)胞彼此之間粘結(jié)成的膜結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜是細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中細(xì)胞與細(xì)胞表面、細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系的介質(zhì)(Davey and OToole2000, OToole et al. 2000)。細(xì)菌聚集是一種彼此之間相互聯(lián)系的微生物形成一種穩(wěn)定的多細(xì)胞簇現(xiàn)象(Marshall1976)。因此這中聚合物也能成為生物膜，其表面物質(zhì)很少被定義(Daveyand OToole 2000)。細(xì)菌能形成多細(xì)胞組織的能力使它們彼此之間相互依附在一起，或者使它們形成一層膜。而細(xì)菌的這種行為在多種學(xué)科以及生物

4、技術(shù)、環(huán)境和醫(yī)藥工程等方面的應(yīng)用起著重大的作用，這對(duì)現(xiàn)代社會(huì)既有積極的作用也有消極的作用。在污水處理過程中不同聚合物的生成是微生物組織的重要應(yīng)用，如活動(dòng)的沉淀絮狀物(Biggs and Lant 2000)、好氧型或厭氧型小顆粒(Adavet al. 2008; Skiadas et al. 2003)。微生物組織能提高分開治理水污染的效果。在釀造工藝中，酵母菌組織對(duì)整個(gè)釀造過程也有著積極的影響(Bauer et al. 2010)。生物膜在生物治理技術(shù)(Cohen 2002)和微生物燃料電池技術(shù)(Erable et al. 2010)上得到積極的應(yīng)用。在這些例子中，聚合物在懸浮液中成功地的生

5、成，或者細(xì)菌附著成膜結(jié)構(gòu)使生物膜技術(shù)更加具有實(shí)用意義。然而，相反的地，細(xì)菌的聚集和生物膜對(duì)工業(yè)過程和人類的健康都起著決定性的作用。例如，每年全球與處理生物污染有關(guān)的過程工程的花費(fèi)多達(dá)幾億英鎊(Riedewald and Sexton2006)以及大約65%的醫(yī)源性感染與表面附著的微生物有關(guān)(Resch et al. 2005)。人們對(duì)生物形成的研究不是一種新的現(xiàn)象。人們對(duì)生物膜最早的報(bào)告應(yīng)追溯到80年以前(Henrici 1933, Zobell 1943)。人們?cè)?0年以前就發(fā)現(xiàn)生物膜在環(huán)境中普遍存在(Costerton 2007)。因此，自從20世紀(jì)70年代開始，人們對(duì)生物膜和基于生物膜的

6、技術(shù)的興趣穩(wěn)定的增加。實(shí)際上，在對(duì)特別以生物膜為標(biāo)題的文章進(jìn)行搜索中，我們發(fā)現(xiàn)從2000年到2010年期間人們已經(jīng)發(fā)表了5100篇文章，并且逐年穩(wěn)定地上升（見圖1）(Web of Science（wok.mimas.ac.uk) Science Citation Index Expanded,accessed 15/03/11)。 有幾種方法已經(jīng)被應(yīng)用于研究細(xì)菌細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞膜之間的聯(lián)系。在這篇評(píng)論中，我們強(qiáng)調(diào)關(guān)鍵技術(shù)（如顯微鏡學(xué)、光譜學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)）的應(yīng)用和從不同的學(xué)科（如表面和高分子科學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)）中找到能夠描述生物膜的細(xì)胞外、細(xì)胞表面以及細(xì)胞內(nèi)的組成成份。這

7、樣在提高生物膜的研究方面，多學(xué)科扮演著重要的角色，提倡把“生物膜技術(shù)”本身發(fā)展成為一門學(xué)科。盡管在對(duì)生物膜的研究中存在著潛在的限制，但是這篇評(píng)論還是強(qiáng)調(diào)這領(lǐng)域?qū)碛兄赜诙鄬W(xué)科共同研究的潛力。細(xì)胞外的環(huán)境是關(guān)鍵：細(xì)胞外面在發(fā)生什么事？形成生物膜的細(xì)胞的當(dāng)前環(huán)境中存在稠密的蛋白質(zhì)，大部分研究都是把了解這些生物膜中的蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系作為研究的對(duì)象。細(xì)胞外聚合物形成占生物膜容量的90%以上的基質(zhì)并且是是微生物的主要來源(Flemming and Wingender 2010)。雖然EPS的各種成份，如蛋白質(zhì)、糖類，DNA和膜囊已經(jīng)被證實(shí)(Flemming et al.2007)，由于一組未知的大分子

8、存在于細(xì)菌細(xì)胞外，EPS被稱為細(xì)胞的保護(hù)傘1992)。細(xì)胞外蛋白質(zhì)的形成需要消耗大量新陳代謝的產(chǎn)物；因此，EPS的存在對(duì)生物膜的形成和維持是至關(guān)重要的。通過細(xì)菌附著而產(chǎn)生的EPS確實(shí)已經(jīng)被譽(yù)為生物性的標(biāo)記(Stoodley et al.2002)；在穩(wěn)定的基質(zhì)中生成的EPS成分之間的相互作用機(jī)制至今仍是一個(gè)豐富的研究領(lǐng)域。在過去的幾十年里，人們承擔(dān)的研究集中對(duì)這些生物聚合物的粘附和粘性特征的了解。在研究EPS的成分方面，人們使用的分析技術(shù)大體上分為兩種：無損技術(shù)和從以損壞的生物膜中提取EPS成分技術(shù)。激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）技術(shù)是目前應(yīng)用最普遍、無損傷技術(shù)，它是被用來顯示生物膜中各種E

9、PS成分的時(shí)間分辨堆積。在應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)中，通過增加熒光探針EPS中的不同成分都能被肉眼識(shí)別。例如使用貼有異硫氰酸鹽標(biāo)簽的熒光素對(duì)蛋白質(zhì)的定位，使用熒光增白劑或刀豆凝集素對(duì)糖類的定位。使用藍(lán)色核酸熒光染料標(biāo)記的核酸通過激光共聚焦掃描顯微鏡能被顯現(xiàn)（for more details ofthe specific probes for eachcom- ponent, please refer to Adavet al. 2010)。激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)人們了解微觀領(lǐng)域中生物膜的空間組織和形成過程扮演著重要的角色(Lawrence et al. 2007)。傅里葉變化紅外光譜學(xué)是另外一種顯示生物膜

10、中EPS成分的時(shí)間分辨堆積的無損技術(shù)。在這項(xiàng)技術(shù)中，各種與EPS相關(guān)的官能團(tuán)的堆積以及EPS聚合物構(gòu)象的轉(zhuǎn)變由在總反射系數(shù)衰減的晶體上直接生長(zhǎng)的生物膜顯現(xiàn)出來(Delille et al. 2007; Quilèset al. 2010)。，也可以由喜歡在像不銹鋼或塑料方面表面生長(zhǎng)的生物膜顯現(xiàn)出來(Pink et al. 2005; Bosch et al.2006; Cheung et al. 2007; Ojeda et al. 2008)。傅里葉變化紅外光譜學(xué)顯微鏡有助于對(duì)生物膜的微觀分析，包括EPS模型。盡管通過CLMS比通過傅里葉變化紅外光譜學(xué)反射顯微鏡更能詳細(xì)的觀測(cè)EPS

11、的空間分布，但是FTIR一直能夠提供有關(guān)EPS中官能團(tuán)的有用信息，這些官能團(tuán)在維持生物膜生長(zhǎng)起到依附和黏著的作用(Geoghegan et al. 2008)。從斷裂的生物膜中提取的EPS的傅里葉變化紅外光學(xué)圖譜已經(jīng)繪制完成(Eboigbodin and Biggs 2008; Tapia et al. 2009; Liang et al.2010; Karunakaran and Biggs 2011)。將在一節(jié)進(jìn)一步討論的拉曼光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜的使用已經(jīng)應(yīng)用于對(duì)EPS模型的分析(Ivleva et al. 2009)。盡管無損技術(shù)在原位顯現(xiàn)技術(shù)中被使用，更多共同采用的策略是去分析從不可

12、避免蛻變的生物膜中獲得的EPS。從對(duì)蛋白質(zhì)和糖類總量的比色測(cè)定以及蛋白質(zhì)與多糖的數(shù)量比計(jì)算的結(jié)果得出，通常起著支配作用的蛋白質(zhì)成分導(dǎo)致絮狀物和生物膜的穩(wěn)定而不是糖類(Sheng et al. 2010)。詳細(xì)的生物化學(xué)分析顯示多糖成分既能包括同聚多糖，例如沙門氏鼠傷寒菌內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)膜(Zogaj et al. 2001)，也能包括充滿的雜聚多糖，例如銅綠假單胞菌內(nèi)的聚陰離子狀的藻酸(Evans and Linker1973; Wozniak et al. 2003)，大腸桿菌內(nèi)的結(jié)腸酸(Danese et al. 2000)，黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)附著的多糖(Götz 2002)。目前的了

13、解證實(shí)含有像二價(jià)陽離子(例如Ca2+ 、 Mg2+)的無機(jī)物的細(xì)胞外多聚物與金屬元素之間的作用集中在一個(gè)面上，這個(gè)面影響絮狀物和生物膜的物理性質(zhì)以及加強(qiáng)了它們的化學(xué)穩(wěn)定性(Biggs et al. 2001;Geoghegan et al. 2008; Körstgens et al. 2001)。生物膜外的蛋白質(zhì)扮演大量新陳代謝的角色。人們就生物膜內(nèi)的蛋白質(zhì)成分的重要性產(chǎn)生了一個(gè)觀點(diǎn)，這個(gè)觀點(diǎn)是EPS基質(zhì)可能起著有效的外消化系統(tǒng)的作用(Flemming and Wingender 2010)。多糖基質(zhì)內(nèi)的胞外酶非流動(dòng)性的生物化學(xué)意義在銅綠假單胞生物膜內(nèi)的殘余硅酸鹽中的脂肪酶的保留的

14、案例被證實(shí)(Mayer et al. 1999)。生物膜中像肽酶、多糖酶和磷酸酯酶等酶的活性已經(jīng)被證實(shí)。這些酶提高了周圍環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用率(Romani et al. 2008; Neu and Lawrence 2009)。蛋白質(zhì)成分與EPS中的多聚糖之間的相互作用也能具有結(jié)構(gòu)意義，例如，枯草芽孢桿菌生物膜中塔莎的分泌蛋白和胞外多聚糖(Branda et al. 2006)。通常，人們認(rèn)為糖結(jié)合肽、外援凝集素的產(chǎn)生對(duì)生物膜結(jié)構(gòu)的完整性起著重要的作用(Neuand Lawrence 2009)。近來致力于對(duì)EPS的蛋白成分的詳細(xì)的生物化學(xué)分析的工作也能對(duì)研究維持枯草芽孢桿菌生物膜穩(wěn)定

15、結(jié)構(gòu)的糖結(jié)合肽作出一點(diǎn)小貢獻(xiàn)(Karunakaran and Biggs 2011)。基質(zhì)中聚合物之間通過靜電引力作用、范德華力相互作用、極性相互作用以及影響生物膜穩(wěn)定的氫鍵作的物理作用的概念也已經(jīng)被旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)表明(Mayer et al. 1999)。通過稱作為聚合物架橋絮凝過程，人們也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EPS分子在克服細(xì)菌與其表面之間的靜電排斥中扮演著重要的角色。因此，保證了細(xì)菌與其表面堅(jiān)定的、不可逆的附著(Neu and Marshall 1990;Karunakaran and Biggs 2011)。這樣研究的結(jié)果已經(jīng)激勵(lì)人們?nèi)パ芯啃碌哪軠p少生物黏著的新表面涂層(Yuan et al. 200

16、9; Khoo et al. 2009)。除了物理化學(xué)特性之外，人們已經(jīng)詳細(xì)地研究了幾種微生物的EPS在基因水平上的生長(zhǎng)過程的微控。例如，枯草芽孢桿菌中構(gòu)成胞外多聚糖的基質(zhì)是通過在一個(gè)單獨(dú)的操縱子上編碼的基因（eps 操縱子）以及一個(gè)胞外蛋白塔莎產(chǎn)生的(Kearns et al. 2005)。參與生產(chǎn)和加工塔莎的胞外聚合物操縱子和基因已經(jīng)被證實(shí)是在幾種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑控制下發(fā)揮作用的(Kearns et al.2005)。在適當(dāng)?shù)貏h除突變體過程中，生物膜形成和成熟的減少可以通過肉眼觀察被證實(shí)(Kearns et al. 2005)。最近，EPS產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄控制也已經(jīng)被證實(shí)發(fā)生在枯草芽孢桿菌中(Irno

17、v and Winkler 2010)。同樣，人們一直在研究通過細(xì)胞內(nèi)循環(huán)診斷一磷酸鹽水平對(duì)EPS產(chǎn)生進(jìn)行控制(Jenal and Malone2006)。一項(xiàng)對(duì)枯草芽孢桿菌組成的生物體的胞外蛋白的廣泛研究表明多效性調(diào)節(jié)劑PlcR在調(diào)節(jié)胞外蛋白的生長(zhǎng)過程起著重要作用(Gohar et al. 2002; Gohar et al. 2008;Oosthuizen et al. 2002)。最終，人們對(duì)生物膜期望的作用，例如對(duì)環(huán)境消毒(Flemming and Wingender2010)、不期望的作用，例如表面生物依附和對(duì)熱交換器壁的隔離，直接與基質(zhì)成分吸附性有關(guān)。生物膜胞外酶的穩(wěn)定和集中有助生

18、物膜作為對(duì)生物異源物和組織蛋白降解的強(qiáng)大集團(tuán)的功能(Flemmingand Wingender 2010)。另一方面，由生物膜金屬蛋白結(jié)合而成的不斷增加的金屬離子對(duì)表面的微生物腐蝕起著很大的作用(Neu and Lawrence 2009)。EPS聚合物的依數(shù)性(Keiding et al.2001)能降解阻礙熱量傳遞的熱交換器壁并且能降低工業(yè)生產(chǎn)效率(Flemming and Wingender 2001)。盡管對(duì)生物膜的外部環(huán)境（例如EPS）的研究有來自像顯微鏡學(xué)、光譜學(xué)、生物化學(xué)、表面科學(xué)和遺傳學(xué)的納米技術(shù)（見圖2）并且成功地為研究團(tuán)體提供了豐富的信息，很少產(chǎn)生限制。沒有意識(shí)到提取技術(shù)的

19、限制和生物膜中EPS成分的完整恢復(fù)存在著挑戰(zhàn)?；|(zhì)聚合物容易受到細(xì)胞新陳代謝的影響，從而能夠改變穩(wěn)固生物膜的物理力。因此，當(dāng)用于補(bǔ)充對(duì)細(xì)菌細(xì)胞表面和胞外多聚物的物理作用的了解的時(shí)候，對(duì)與細(xì)胞新陳代謝的增殖相結(jié)合的胞外多聚物的研究能夠?qū)ι锬ぶ蠩PS的相互作用、調(diào)節(jié)和控制有更好集中的了解。是關(guān)于表面嗎？膠質(zhì)物和生物膜的聯(lián)合依附在培養(yǎng)基中的共同體是生物膜的最簡(jiǎn)單的形式。因此，對(duì)用于生物膜形成的培養(yǎng)基的要求吸引了不少從事多聚物和表面科學(xué)研究的人們?nèi)パ芯靠赡艽龠M(jìn)或者阻礙生物膜形成的培養(yǎng)基的特性。類似于膠體粒子的細(xì)菌細(xì)胞的大表面積與體積之比形成了Derjaguin, Landau, Verwey and

20、 Overbeek (DLVO) 理論，這個(gè)理論支配著膠體粒子粘附成表面并且適用于新型細(xì)菌粘附在底層(Bos etal. 1999)。DLVO理論把膠體對(duì)表面的依著力解釋為長(zhǎng)程力作用的的結(jié)果，例如靜電力的作用和粒子和表面之間的里夫施茨范德華力(Poortinga et al. 2002)。細(xì)菌和膠體的類似突出了描述細(xì)菌細(xì)胞表面以及在培養(yǎng)基的特征的重要性。因此，大量使用來自膠體或表面科學(xué)的豐富的技術(shù)，一些研究組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了與膠體的穩(wěn)定和依著力有關(guān)的細(xì)菌細(xì)胞的特性。根據(jù)DLVO理論，膠體粒子的穩(wěn)定性受兩個(gè)因素的影響：（1）疏水性，（2）表面電荷。用膠體科學(xué)的方法去研究細(xì)菌依著和生物膜的形成，因此，在

21、這個(gè)領(lǐng)域，研究集中在描述細(xì)菌細(xì)胞表面的這兩個(gè)特性是不罕見的。Busscher 和Weerkamp（1987）認(rèn)為在細(xì)菌依著方面疏水性能從接觸區(qū)脫水，能夠使脫水的部分直接通過短程作用相互影響(Busscher and Weerkamp 1987)。對(duì)干細(xì)菌接觸角的測(cè)量(Van Loosdrecht etal. 1987a)是一種決定細(xì)菌表面疏水性的常用的方法。這種方法比用微生物粘附的碳?xì)浠衔锏暮繙y(cè)量法(Rosenberg et al.1980)、疏水作用色譜法(Roettger and Ladisch 198 9)、兩相分配試驗(yàn)和使用硫酸銨的鹽聚集試驗(yàn)(Rozgonyi et al. 198

22、5)之類的方法更為常用。Van Loosdrecht et al. (1987a)報(bào)道細(xì)胞表面疏水性和細(xì)胞對(duì)疏水基粘附性之間線性正相關(guān)。Van der Meiet al. (1998)也曾用過接觸角測(cè)量法去研究許多不同種類的細(xì)菌的細(xì)胞表面脫水性，并且斷定表面疏水性對(duì)每個(gè)菌株是唯一的和依賴于菌株的生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)率。這個(gè)結(jié)論表明控制細(xì)菌細(xì)胞之間的粘附的潛在相互作用力不是常量并且能夠改變對(duì)生物活性的依賴。Allison et al. (1990a, b)也曾發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面疏水性和生物膜之間的聯(lián)系，即疏水性的下降導(dǎo)致銅綠假單胞生物膜菌和大腸桿菌生物膜的釋放。Van Loosdrecht et al. (1

23、987b)認(rèn)識(shí)到當(dāng)細(xì)菌的表面電荷也能被包括在粘附模型中，對(duì)細(xì)菌粘附力的精確預(yù)測(cè)詩可以做到的。細(xì)菌細(xì)胞表面的電荷通常由測(cè)量電脈遷移率和推斷電位所決定(Wilson et al. 2001; Hong andBrown 2008)，它們是水溶液和接到細(xì)菌細(xì)胞上流體靜電層之間界面的電勢(shì)(Klodzinska et al. 2010)。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)像細(xì)胞表面疏水性一樣，細(xì)胞表面的電荷因不同生長(zhǎng)階段(Eboigbodin et al.2005; Walker et al. 2005)、細(xì)胞代謝(Hong andBrown 2010)以及基因的差異(Eboigbodin et al.2006)的生物活性不

24、同而不同。細(xì)胞表面的電荷的變化決定了細(xì)胞聚集的能力(Marshall 1976;Rijnaarts et al. 1995; Eboigbodin et al. 2007)。采用譬如接觸角和電泳遷移遷移的技術(shù)能測(cè)定細(xì)菌群體的平均膠體性質(zhì)。然而細(xì)菌細(xì)胞表面的獨(dú)特生物成分導(dǎo)致這些膠體性質(zhì)的原因，這些獨(dú)特生物成分的反過來能控制導(dǎo)致粘附性的相互作用類型(Marshall 1976; Rijnaarts etal. 1995; Torimura et al. 1999; Eboigbodin et al. 2006; Hongand Brown 2008; Ojeda et al. 2008)。因此，人

25、們?cè)谏锬ぱ芯款I(lǐng)域已經(jīng)取得了使用分析化學(xué)技術(shù)方面的進(jìn)展。例如，使用紅外和拉曼光譜學(xué)技術(shù)(Mukherjee et al. 2011)以及最先進(jìn)的X射線光電子光譜學(xué)技術(shù)(Yala et al. 2010)描述相互黏著的生物細(xì)胞的表面化學(xué)性質(zhì)。紅外光譜學(xué)技術(shù)在微生物領(lǐng)域應(yīng)用了40多年(Heber et al. 1952;Norris 1959)。FTIR(傅里葉變換紅外光譜學(xué))被廣泛應(yīng)用微生物生態(tài)學(xué)研究和生物膜研究(如 Bosch et al. 2006; Ojeda et al. 2008;Mukherjee et al. 2011)。如前面提到的，使用FTIR為了生物膜的研究去描述化學(xué)官能團(tuán)的

26、有點(diǎn)是生物膜可以被無損地、直接地、在線地和實(shí)時(shí)地觀察。由于生物膜代表著一個(gè)極其復(fù)雜的系統(tǒng)，許多不同的信號(hào)產(chǎn)生于胞外聚合物、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的分子振動(dòng)，它們可以對(duì)整體的RTIR光譜也有影響。RTIR光譜能夠顯示生物大分子的特征函數(shù)以及生物膜樣品和它們的浮游生物配對(duì)物的比較。這些浮游生物配對(duì)物往往會(huì)顯示與多糖和蛋白質(zhì)相關(guān)的相關(guān)的官能團(tuán)的變化(Schmitt and Flemming 1998; Bosch et al.2006; Ojeda et al. 2008; Mukherjee et al. 2011)。使用FTIR的主要缺點(diǎn)是樣品在分析之前是干燥的。拉曼光譜學(xué)技術(shù)也能為樣品的的化學(xué)成分提供

27、信息，但是必須在水和環(huán)境中。因此，它比FTIR有優(yōu)勢(shì)并且從而被廣泛地用于生物分析(study of tissues, biofluidsand bacterial cells) (Beier and Berger 2009; Wagneret al. 2009; Carmona et al. 1997; Choo-Smith et al. 2001)。拉曼光譜學(xué)技術(shù)和表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)能夠分析水合生物膜樣品，包括EPS的成分(Hudson and Chumanov 2009, Ivleva et al. 2009)以及嵌入在EPS內(nèi)的微觀組織(Andrews et al. 2010

28、; Schwartz et al. 2009)。CLMS與拉曼光譜學(xué)的聯(lián)合使用已經(jīng)能夠?qū)Σ煌N類的自由生長(zhǎng)的生物膜的形成進(jìn)行原位比較(例如，野生型銅綠假單胞菌和它的突變體(Sandt et al. 2009)以及能夠區(qū)分不同種類的生長(zhǎng)在生物膜上細(xì)菌（例如，血鏈球菌和突變鏈球菌之間(Beier et al. 2010)）CLMS與拉曼光譜學(xué)在水合環(huán)境下聯(lián)合使用對(duì)描述多種物種生物膜的表面有了很好的保證。關(guān)于細(xì)菌細(xì)胞表面的分子成分的化學(xué)信息能通過在原子級(jí)上使用X射線光電子光譜學(xué)技術(shù)(XPS)獲取(Rouxhet et al. 1994; van der Mei et al. 2000)。各種原子（例

29、如，碳原子、氧原子、氮原子和磷原子）的組成百分比以及它們?cè)诩?xì)胞表面的鍵合環(huán)境都通使用XPS分析出來。一些研究已經(jīng)集中在將細(xì)胞表面成分的原子比例與細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞表面的物理化學(xué)性能聯(lián)系在一起(Hamadiet al. 2008; Ahimou et al. 2007; van der Mei et al. 2000;Amory et al. 1988)。某些研究已經(jīng)使用XPS來分析環(huán)境樣(Pastuszka et al. 2005)本或者分析在改變培養(yǎng)條件的情況下細(xì)胞表面的改變(Dufrêne and Rouxhet 1996; Herben etal. 1990)。上面提及到的研究

30、目前僅僅在浮游細(xì)菌上完成，但是對(duì)建立理化特性的技術(shù)與XPS之間的相關(guān)性極為有用，這里用的用的細(xì)胞是在分析之需要凍干。幾乎非常少的研究試圖將XPS分析與附著成面的浮游細(xì)胞的細(xì)胞表面物理化學(xué)性質(zhì)聯(lián)系在一起(Cerca et al. 2005; Dufrene et al. 1996; Denyer et al. 1990;Mozes et al. 1989)。在這些研究中，XPS分析已經(jīng)可能對(duì)細(xì)胞表面分子進(jìn)行識(shí)別，包括對(duì)初始粘附的表面進(jìn)行識(shí)別。Cerca et al.(2005)意識(shí)到初始粘附與隨后生物膜的生長(zhǎng)一直不存在相關(guān)聯(lián)系并且斷定細(xì)胞表面附著的高分子介質(zhì)可能與介導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞的相互作用不同。同時(shí)

31、XPS在識(shí)別細(xì)胞表面高分子成分的變化方面存在著潛力，將來的研究應(yīng)該集中在將表面附著細(xì)胞和浮游細(xì)胞進(jìn)行比較從而了解生物膜形成過程中的生理變化與細(xì)胞表面變化的相關(guān)性。聯(lián)合分析化學(xué)和用于描述細(xì)菌描述表面特性的膠體方法的應(yīng)用已經(jīng)鼓勵(lì)多學(xué)科的研究活動(dòng)（見圖3）。然而影響細(xì)胞表面的特殊生物分子的細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)（例如基因表達(dá)調(diào)節(jié)）與導(dǎo)致附著的化學(xué)功能團(tuán)的觀察到的變化之間的聯(lián)系需要將來去調(diào)查研究。就表面蛋白（見下一節(jié)）而言，這是值得更多關(guān)注的，但是通過特定的化學(xué)分析將細(xì)胞表面的特殊指紋與導(dǎo)致高分子（它是形成指紋的原因）產(chǎn)生的生物機(jī)制連接在一起目前沒有看到。圖3此外，最近Mukherjee et al. (201

32、1)、Karunakaran 和 Biggs (2011)已經(jīng)表明附著細(xì)胞與自由浮動(dòng)細(xì)胞的細(xì)胞表面特性存在差別。因此，當(dāng)推斷或預(yù)測(cè)由生物膜的形成和維持引起的相互作用時(shí)，細(xì)菌的膠體特性應(yīng)該進(jìn)一步把這些變化考慮進(jìn)去。細(xì)胞內(nèi)的活動(dòng)怎樣呢？畢竟它也是生物學(xué)過程在微生物學(xué)家的帶領(lǐng)下，人們對(duì)識(shí)別基因和蛋白質(zhì)生物學(xué)的基礎(chǔ)環(huán)境的適應(yīng)策略如生物膜形成的廣泛研究在近幾十年里已經(jīng)完成?，F(xiàn)在被人們廣泛接受的是有生物膜的細(xì)胞生理學(xué)與自由浮動(dòng)浮游增長(zhǎng)方式的細(xì)胞生理學(xué)是截然不同的。基因組測(cè)序技術(shù)和如通過芯片對(duì)基因組進(jìn)行分析技術(shù)的利用性能使得生物膜研究領(lǐng)域超越更多傳統(tǒng)的基于顯微鏡的微生物學(xué)并且能夠?qū)?xì)胞代謝進(jìn)行詳細(xì)的分析。D

33、NA芯片技術(shù)已經(jīng)被用于識(shí)別大腸桿菌生物膜的一些現(xiàn)在比較適用的整個(gè)基因表達(dá)研究的整個(gè)基因表達(dá)譜(see areview by Wood 2009)。有關(guān)銅綠假單胞菌生物膜DNA芯片的研究已經(jīng)表明少量的基因被差異性表達(dá)(Stoodley et al. 2002;Whiteley et al. 2001)。對(duì)附著、自動(dòng)聚集以及一些新的基因簇的基因編碼傾向于對(duì)對(duì)生物膜細(xì)胞的高度表達(dá)或者誘導(dǎo)后過渡到生物膜生長(zhǎng)(Schembri et al. 2003)。與基因芯片檢測(cè)技術(shù)平行，轉(zhuǎn)錄分析技術(shù)已經(jīng)被用于研究生物膜的形成。這項(xiàng)技術(shù)被用于研究生物膜生成過程中的生理機(jī)能、表型、運(yùn)動(dòng)、代謝活性和細(xì)胞間的信息傳遞。這

34、項(xiàng)技術(shù)中使用的純培養(yǎng)菌有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、十細(xì)菌、綠膿桿菌和霍亂弧菌(Beenken et al. 2004; Beloinet al. 2004; Ren et al. 2004; De Souza et al. 2004; Whiteleyet al. 2001; Moorthy and Watnick 2005)。然而，沒有出現(xiàn)具體的生物膜的形成全球模式。雖然如此，在全球基因表達(dá)譜中識(shí)別的特殊基因角色的確認(rèn)有可能用于有針對(duì)性的遺傳變異研究。因此，基因操作對(duì)了解和識(shí)別與生物膜形成和附著有關(guān)的特性至關(guān)重要(Stoodley et al. 2002; Hall-Stoodley et a

35、l. 2004; Beloin andGhigo 2005)。例如，OToole et al(2000)用CRC突變銅綠假單胞菌研究生物膜的發(fā)展。csrA基因（這是一個(gè)用于碳源代謝多效調(diào)控蛋白）的中斷增加了生物膜的形成。同時(shí)，這篇評(píng)論的目的不是詳細(xì)描述所有的導(dǎo)致增強(qiáng)或減弱生物膜形成的基因突變，接下來的幾段將進(jìn)一步給出一些例子。Prigent-Combaret et al. (2000)通過對(duì)影響大腸桿菌生物膜的curli轉(zhuǎn)錄的積極和消極調(diào)節(jié)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，OmpR/EnvZ（EnvZ DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)節(jié)器）和CpxR/CpxA（CpxA DNA結(jié)合反應(yīng)調(diào)節(jié)器）(Stoodley et

36、al. 2002)。Barrios et al. (2006)研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中的Hha(滲透脅迫調(diào)節(jié)器)和YbaJ(假設(shè)蛋白)由于缺失的原因，通過減少生物膜的質(zhì)量來調(diào)節(jié)生物膜。Hha 和 YbaJ的缺失恢復(fù)了細(xì)胞的流動(dòng)性并且減少了細(xì)胞的集成。Domka et al. (2006)完成的研究表明大腸桿菌中的yceP(假設(shè)蛋白)和yliH （通過吲哚運(yùn)輸調(diào)節(jié)對(duì)生物膜形成的抑制）有助于生物膜的形成。Sheludko et al. (2008)研究了固氮螺菌生物膜上脂多糖(LPS)和卡爾科弗盧爾結(jié)合多糖(CBPS)合成中突變的影響。固氮螺菌Sp245生物膜的厚度和抗原性以及在LPS和CBPS合成缺失

37、的突變表明在酸性LpsI合成中缺失的突變?cè)谟H水性表面生成比較厚的生物膜，并且這種在細(xì)菌的親水性表面生成的、不能合成CBPS生物膜是不太明顯的。這項(xiàng)研究斷定LPS結(jié)構(gòu)中一個(gè)根本性的改變是與親水性和疏水性表面上的相關(guān)突變體的生物膜形成活動(dòng)相關(guān)的。它也能提供了表面高分子（如LPS）和附著物之間的聯(lián)系并且是與上一節(jié)提到的膠體研究的聯(lián)合起來去研究生物活性與表面性質(zhì)的聯(lián)系的選擇物。細(xì)菌密度感知信號(hào)系統(tǒng)中特定的基因突變已經(jīng)導(dǎo)致生物膜形成的改變。當(dāng)描述空腸彎曲菌生物膜時(shí)，Reeser etal. (2007)發(fā)現(xiàn)最大生物膜的形成所需要空腸彎曲菌彎曲突變的群體感應(yīng)在它們形成生物膜能力方面與野生菌相比明顯在減少。

38、Huang et al. (2009)的研究也已經(jīng)報(bào)道突變鏈球菌生物膜形成包括細(xì)菌依賴彎曲密度感知信號(hào)系統(tǒng)。通過掃描電子顯微鏡、光顯微鏡和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在鏈球菌突變中，變形基因的淘汰被表明損害生物膜生長(zhǎng)(Sztajer et al. 2008)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白YdgG的缺失減少了細(xì)胞外以及提高了細(xì)胞內(nèi)群體感應(yīng)分子自動(dòng)誘導(dǎo)物2 (AI2).的濃度。由于YdgG加強(qiáng)了AI-2的轉(zhuǎn)運(yùn)，YdgG的缺失導(dǎo)致生物膜厚度和流動(dòng)的細(xì)胞的數(shù)量減少(Herzberg et al. 2006)。通常，細(xì)菌彼此之間是通過使用化學(xué)信號(hào)分子或自動(dòng)誘導(dǎo)劑進(jìn)行交流（AI）。原核微生物例如革蘭氏陰性菌產(chǎn)生?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL

39、）作為信號(hào)分子以及革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生寡肽作為信號(hào)分子(Miller and Bassler 2001)。細(xì)菌能對(duì)由同種細(xì)菌以及其它種類的細(xì)菌產(chǎn)生的大量的AI作出反應(yīng)，AI為內(nèi)部和外部物種交流提供了基礎(chǔ)。有LuxS蛋白產(chǎn)生的自動(dòng)誘導(dǎo)劑-2信號(hào)（AI-2）介導(dǎo)革蘭氏陰性菌與物革蘭氏陽性菌種間的交流。作為遺傳反應(yīng)，群體感應(yīng)細(xì)菌的信息交流通過AHL和AI-2系統(tǒng)與生物膜的生成產(chǎn)生聯(lián)系(Costerton et al. 1999; Bassler 2002; Simoes et al. 2007)。除了AI-2控制生物膜的生成之外，AHL介導(dǎo)基因的表達(dá)表明物種（如銅綠假單胞菌(De Kievit et

40、al. 2001)、鼻疽菌(Brackman et al.2009)）之間控制生物膜的生成以及在自然環(huán)境樣本（如埋石灰?guī)r和水回收系統(tǒng)）中控制生物膜的生成(McLeanet al. 1997; Hu et al. 2003)。遺傳分析為人們提供了關(guān)于細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境改變的潛力、生物膜的形成以及能顯示哪些基因已經(jīng)在過程中轉(zhuǎn)錄的mRNA的測(cè)定（通過DNA微陣列）信息。另一方面，蛋白質(zhì)成分的分析為人們提供了關(guān)于樣本在精確的時(shí)候發(fā)生的新陳代謝活動(dòng)的信息。蛋白質(zhì)組學(xué)能夠同時(shí)在蛋白質(zhì)水平上對(duì)全部基因的表達(dá)進(jìn)行分析，并且為研究生物系統(tǒng)提供了關(guān)鍵的策略(Hatzimanikatisand Lee 1999)。因此，

41、蛋白質(zhì)對(duì)于研究觀察發(fā)生在生物形成過程中的生理變化提供了有力的工具。 使用半定量二維凝膠電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)比較生物膜和自由浮游生物的胞外蛋白質(zhì)圖譜并且表明不同在包括代謝、運(yùn)輸和調(diào)節(jié)過程中蛋白質(zhì)存在明顯的區(qū)別(Otto et al.2001; Sauer and Camper 2001; Steyn et al. 2001;Oosthuizen et al. 2002; Trémoulet et al. 2002; Vilain etal. 2004a, b; Welin et al. 2003; Resch et al. 2005; van Alenet al. 2010)。在蛋

42、白質(zhì)分析中進(jìn)步也已經(jīng)產(chǎn)生了基于非凝膠的定量技術(shù)的問世，例如相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素標(biāo)記技術(shù)（iTRAQ）。Mukherjee et al. (2011) and Pham etal. (2010)都用iTRAQ技術(shù)去確定大腸桿菌的生物膜和浮游細(xì)胞和牙周病原菌Tannerella forsythia之間的蛋白質(zhì)數(shù)量。對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步分析有可能使用各種統(tǒng)計(jì)技術(shù)將蛋白質(zhì)表達(dá)與生物膜形成中潛在的代謝途徑聯(lián)系在一起(Mukherjee et al. 2011)。除了細(xì)胞質(zhì)可溶性蛋白質(zhì)，通過外膜蛋白質(zhì)的雙向凝膠電脈對(duì)蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)完成，例如1型傘端大腸桿菌在粘附形成生物表面期間外膜蛋白的成分發(fā)生了

43、明顯的變化(Resch et al.2005; Otto et al. 2001)。Pham et al. (2010)使用定量的非凝膠為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組技術(shù)也發(fā)現(xiàn)生物膜細(xì)胞中的外膜蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)了。全球基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)于浮游和生物膜表型的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)以及生物膜形成過程中基因突變菌株的調(diào)查極為有用（見圖4），然而，在這一領(lǐng)域的研究存在著價(jià)值，這些研究通常受到測(cè)序微生物的限制，尤其是銅綠假單胞菌和大腸桿菌，并且在生物膜形成過程中還沒有一個(gè)獨(dú)特的基因組能對(duì)表型變化負(fù)責(zé)。因此使得發(fā)展完全基于基因表達(dá)的策略比較困難。圖4觀察細(xì)菌從游離態(tài)到形成生物膜過程中發(fā)生的變化的研究已經(jīng)完成。然而，人們

44、因該更加努力的去發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)生物變化的影響以及細(xì)菌表面的物理化學(xué)特性的影響，這最終對(duì)生物膜的形成產(chǎn)生影響。生物膜各方面的全面的蛋白質(zhì)組分析能夠?yàn)樯飳W(xué)過程（胞內(nèi)蛋白質(zhì)），特殊的表面功能團(tuán)（表面和/或膜蛋白）和周圍胞外多聚合物（EPS中的蛋白質(zhì)）的聯(lián)系提供洞察力，但是，直到現(xiàn)在蛋白質(zhì)的研究重點(diǎn)仍然聚集在浮游細(xì)胞上，而不是直接在生物膜細(xì)胞上或者僅僅部分生物圖片上。結(jié)語生物技術(shù)在工業(yè)上的巨大潛力、生物膜在傳染病以及其它疾病上普遍存在和研究生物膜的復(fù)雜性已經(jīng)在研究團(tuán)隊(duì)中激發(fā)了廣大的興趣。為了減少研究生物膜的復(fù)雜性，目前的研究已經(jīng)采取了基于部分的研究并且在這樣做的過程中人們已經(jīng)獲得大量的關(guān)于生物膜形成的各

45、方面的知識(shí)，例如胞外聚合物的作用，環(huán)境條件的影響、基板性能和在生物膜形成過程中的分子控制。來自各種學(xué)科的技術(shù)創(chuàng)造性的應(yīng)用驗(yàn)證了生物膜的形成現(xiàn)象，并且?guī)砹硕鄬W(xué)科共同研究巨大的潛力。盡管在基于部分研究生物膜形成的方法中，多學(xué)科的聯(lián)合已經(jīng)激勵(lì)人們?nèi)パ芯繚撛诘纳锬た刂撇呗?，專門設(shè)計(jì)適合應(yīng)用需要的生物膜的目的是不會(huì)成功的。為了成功控制生物膜的形成，研究人員需要意識(shí)到生物膜的研究，例如，生物技術(shù)，已經(jīng)演變成了一門獨(dú)立的學(xué)科（見圖5）以及各種學(xué)科和研究的視野相互合作是至關(guān)重要的。謝鳴 這些作者希望對(duì)英國(guó)工程與物理科學(xué)研究委員會(huì)（EPSRC）為Karunakaran提供比格斯高級(jí)研究金(EP/E05355

46、6/01)以及進(jìn)一步的計(jì)劃援助(EP/E053556/01和 EP/E036252/1)比并且設(shè)菲爾德大學(xué)為Karunakaran 和 Ramalingam提供獎(jiǎng)學(xué)金表示感謝。這些作者聲明他們沒有利益沖突。參考文獻(xiàn)Adav SS, Lee DJ, Show KY, Tay JH (2008) Aerobic granular sludge:recent advances. Biotechnol Adv 26:411423Adav SS, Lin JCT, Yang Z, Whiteley CG, Lee DJ, Peng XF, ZhangZP (2010) Stereological ass

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