米曲霉的制備

1、 畢 業(yè) 論 文課題名稱(chēng) 米曲霉的制備姓 名 學(xué) 號(hào) 所在系 制藥與生物工程系 專(zhuān)業(yè)年級(jí)P09生物制藥 指導(dǎo)教師 職 稱(chēng) 講師 指導(dǎo)教師 職 稱(chēng) 二O一二年六月八日摘要頁(yè)眉來(lái)？ 微生物在醬油生產(chǎn)制曲工藝和發(fā)酵過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，在高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝過(guò)程中，培養(yǎng)良好的米曲霉菌種不僅可以提高醬油中總氮、氨基酸態(tài)氮含量和醬油風(fēng)味,而且還可以提高原料利用率。因此米曲霉種曲培養(yǎng)是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)醬油的有效保證。本論文主要介紹米曲霉在不同階段的擴(kuò)大培養(yǎng)方法，包括試管菌種、錐形瓶菌種、種曲罐菌種、種曲等方面的培養(yǎng)方法及注意事項(xiàng)。米曲霉培養(yǎng)溫度為2832英文數(shù)字的字體。不要讓我再提醒第三次了。,培養(yǎng)時(shí)間為72h,

2、半角全角的標(biāo)點(diǎn)，回去一個(gè)一個(gè)的標(biāo)點(diǎn)點(diǎn)著改，我也不想提醒第三次了。我重申一下，我只負(fù)責(zé)指出你哪塊有問(wèn)題，不是負(fù)責(zé)?？薄Ｄ愕米约簷z查的差不多再發(fā)給我吧。米曲霉生長(zhǎng)最旺盛作用,此時(shí),曲料的曲酶孢子數(shù)大于8×109個(gè)/g,蛋白酶活力可達(dá)1000mg/100g以上。關(guān)鍵詞 米曲霉；溫度；時(shí)間；試管菌種；三角瓶菌種；擴(kuò)大培養(yǎng)目錄引言11 菌種的種類(lèi)11.1 米曲霉11.2 黑曲霉12 菌種的選擇條件12.1 不產(chǎn)生黃曲霉毒素及其他真菌毒素12.2 酶系全、酶活力高22.3 對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖快22.4 釀制的醬油風(fēng)味好23試管實(shí)驗(yàn)23.1 滅菌23.2 培養(yǎng)基的制備23.3 培養(yǎng)基的鑒別

3、23.4 接種培養(yǎng)33.5 菌種的留選34 錐形瓶培養(yǎng)34.1 原料配比34.2 接種培養(yǎng)35種曲制備35.1 種曲原料要求35.2 做料前檢查事項(xiàng)45.3 做料45.4 蒸料45.5 抽真空45.6 降溫45.7 接種55.8 自動(dòng)培養(yǎng)55.9 開(kāi)罐55.10操作過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題56種曲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)66.1感官特性6外觀6香氣6手感66.2孢子數(shù)的測(cè)定6樣品的稀釋6制片7觀察計(jì)數(shù)7注意事項(xiàng)7參考文獻(xiàn)9謝辭10引言還是段前段后的問(wèn)題，自己上百度查查。米曲霉是一類(lèi)產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，半知菌亞門(mén)，絲孢綱，屬真菌中的一種常見(jiàn)種。菌落生長(zhǎng)較快，質(zhì)地疏松，初成白色、黃色，后轉(zhuǎn)黃褐色至淡綠褐色，背面無(wú)色，分布

4、甚廣，主要在糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物和土壤等處。米曲霉具有豐富的蛋白酶系，能產(chǎn)生酸性、中性和堿性蛋白酶，廣泛應(yīng)用于食品、釀酒等發(fā)酵工業(yè)中，培養(yǎng)良好的米曲霉菌種不僅可以使醬油產(chǎn)生濃郁的醬香及酯香，提高醬油的的風(fēng)味而且還可以提高其原料利用率。因此培養(yǎng)優(yōu)良的米曲霉種曲是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)醬油的重要保障。1 菌種的種類(lèi)1.1 米曲霉米曲霉滬3.042菌株是目前國(guó)內(nèi)醬油生產(chǎn)廠家普遍使用的優(yōu)良菌，其來(lái)源是福建省永春縣醬園中篩選出來(lái)米曲霉，中國(guó)科學(xué)院編號(hào)為3.863菌株，后經(jīng)上海釀造科學(xué)研究所進(jìn)一步誘變篩選獲得滬釀3.042，中科院保藏好3.951。該菌株分生孢子大，數(shù)量多，生長(zhǎng)繁殖速度快，對(duì)雜菌抵抗力強(qiáng)，易制曲，

5、制曲時(shí)間為48h，其蛋白酶活力比原處發(fā)的菌株提高30%以上。1.2黑曲霉黑曲霉AS3.350與米曲霉滬釀3.042混合制曲，對(duì)提高蛋白質(zhì)原料的利用率以及產(chǎn)品風(fēng)味均有一定的效果。2 菌種的選擇條件2.1 不產(chǎn)生黃曲霉毒素及其他真菌毒素目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)中應(yīng)用的米曲霉、醬油米曲霉、溜曲霉等菌株，雖然屬于黃曲霉菌群，但均未發(fā)現(xiàn)黃曲霉素，因而是安全的。2.2 酶系全、酶活力高段前段后尤其是蛋白酶活力要求高。醬油的成分絕大部分來(lái)自制曲過(guò)程中微生物分泌的多種酶類(lèi)對(duì)原料的分解，除蛋白酶、淀粉酶等酶系以外，還有谷氨酰胺酶、脂肪酶和植物組織分解酶（包括果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶）等，當(dāng)前國(guó)內(nèi)普遍推廣的米曲霉滬釀3

6、.042,酶系比較全，酶活力較高，適于釀造醬油，但其酸性蛋白酶及纖維素酶活力不高。因此，將其和酸性蛋白酶活力高的黑曲霉混合制曲發(fā)酵，能夠明顯的提高原料的利用率。2.3 對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖快這樣的菌株生長(zhǎng)適應(yīng)期短，孢子萌發(fā)快，能迅速居于生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)地位，抑制雜菌的生長(zhǎng)。滬釀3.042米曲霉十幾年來(lái)在釀造工業(yè)一直保持著生命力，最主要原因就在于它對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，制曲管理容易。2.4 釀制的醬油風(fēng)味好優(yōu)良的菌株不僅要求無(wú)毒性、酶系全，酶活力高、生長(zhǎng)快、制曲容易，而且釀造出來(lái)的醬油風(fēng)味必須良好，否則就不適用。 試管實(shí)驗(yàn)3.1 滅菌凡用于菌種培養(yǎng)的皿具要徹底清洗和滅菌，試管滅菌前需要配上棉塞并用防潮紙

7、包扎管口。3.2 培養(yǎng)基的制備試管菌種用土豆培養(yǎng)基（配制方法：將300g去皮馬鈴薯切塊加1000ml蒸餾水煮沸1020min再用紗布過(guò)濾，濾液補(bǔ)加蒸餾水至1000ml再加20g葡萄糖和20g瓊脂，加熱溶化分裝后，在121的條件下滅菌20分鐘）。3.3 培養(yǎng)基的鑒別把新配制并經(jīng)滅菌的斜面菌種于2530條件下培養(yǎng)34天，然后檢查確保無(wú)污染方可使用。3.4 接種培養(yǎng)段前段后把在無(wú)菌條件下移接的米曲霉斜面菌種于2530條件下培養(yǎng)72h待菌種發(fā)育成熟后方可使用。3.5 菌種的留選為使菌種保持良好特性應(yīng)定期做好分純工作宜半年進(jìn)行一次留選產(chǎn)生性能好的菌株。4 錐形瓶培養(yǎng)4.1 原料配比錐形瓶種培養(yǎng)基每瓶采用

8、麩皮20g面粉4g經(jīng)混合后，拌入20ml清水，充分拌勻裝入預(yù)先洗滌，干燥配制好棉塞及經(jīng)1kg/c蒸汽壓、滅菌30min的300ml錐形瓶中裝瓶量及料厚1cm為準(zhǔn)。4.2 接種培養(yǎng)菌種培養(yǎng)過(guò)程，搖兩次瓶，首次在曲料開(kāi)始發(fā)白結(jié)塊時(shí)（約20小時(shí)）進(jìn)行，相隔4-6h當(dāng)曲料再行結(jié)塊，則進(jìn)行第二次搖瓶，經(jīng)過(guò)兩天培養(yǎng)后把三角瓶輕輕倒置過(guò)來(lái)（也可不倒置）繼續(xù)培養(yǎng)1天，全部長(zhǎng)滿(mǎn)黃綠色孢子米曲霉發(fā)育成熟即可使用，或4冰箱待用。5 種曲制備5.1 種曲原料要求制種曲是為了培養(yǎng)優(yōu)良的種子，原料必須適應(yīng)曲霉菌旺盛繁殖的需要。曲霉菌繁殖時(shí)需要大量糖分，而豆粕含淀粉較少，因此在生產(chǎn)加工時(shí)，在加入豆粕的同時(shí)還要加入一定量的面

9、粉或炒麥。為了使曲霉菌繁殖旺盛，大量著生孢子，保持曲料松散和空氣流通是很必要的，炒麥或麩皮過(guò)細(xì)會(huì)影響通風(fēng)，應(yīng)時(shí)刻注意曲料的生長(zhǎng)情況，隨時(shí)開(kāi)風(fēng)機(jī)看曲料是否發(fā)白結(jié)塊，進(jìn)行翻曲。5.2 做料前檢查事項(xiàng)段前段后(1) 檢查設(shè)備是否清洗干凈。(2) 水、電、氣是否送到(3) 將冷熱水灌水注滿(mǎn)。(4) 對(duì)蒸汽過(guò)濾器進(jìn)行消毒，注意消毒時(shí)壓縮氣閥打開(kāi)。(5) 檢查噴霧頭的噴霧狀態(tài)是否良好（水珠不宜過(guò)大）。(6) 調(diào)整好電柜，各項(xiàng)溫度指標(biāo)。5.3 做料將麩皮與面粉按9:1比例，混合均勻后按1:1的比例混合（一般117kg麩皮、13kg面粉、130kg水）用面碎機(jī)打兩遍后裝盤(pán)，裝盤(pán)不宜過(guò)厚（按130kg來(lái)算，每盤(pán)

10、重2.7kg左右）。5.4 蒸料將料車(chē)放入罐后，將溫度計(jì)放好（以能清晰看到30-40）之間為宜，關(guān)閉罐門(mén)，打開(kāi)密封條、閥門(mén)，同時(shí)將罐體相連的閥門(mén)關(guān)好，打開(kāi)蒸汽閥進(jìn)蒸汽，首先要預(yù)熱一次，通氣壓力開(kāi)之0.1Mpa后排氣目的是將罐內(nèi)冷氣排除，預(yù)熱完畢后方可蒸料，將溫度開(kāi)之121左右、壓力0.2Mpa左右，關(guān)閉蒸汽閥計(jì)時(shí)，保溫保壓30min左右，目的是殺菌（切記保溫保壓過(guò)程中溫度要一直在120左右，壓力在0.2Mpa左右，保溫完成后打開(kāi)排氣閥排氣之壓力為0）。5.5 抽真空將與外界相連的一個(gè)排氣閥關(guān)閉同時(shí)疏水閥關(guān)閉，加層的排水閥關(guān)閉，然后再打開(kāi)真空總閥，自來(lái)水閥，最后打開(kāi)真空泵閥，將氣壓將至-0.04

11、Mpa左右時(shí)，按順序關(guān)閉抽真空裝置。5.6 降溫首先用熱水循環(huán)（因開(kāi)始時(shí)熱水罐溫度很低，與我們所需溫度相差甚遠(yuǎn)），當(dāng)熱水罐溫度開(kāi)至40左右時(shí)，可以關(guān)閉熱循環(huán)，改為冷水循環(huán)，在降溫過(guò)程中，為加速降溫，可以打開(kāi)風(fēng)機(jī)，將風(fēng)機(jī)頻調(diào)的稍大即可，當(dāng)溫度降至60左右時(shí)，開(kāi)始增壓至壓力到-0.04Mpa（開(kāi)始抽真空到-0.04Mpa，但在降溫過(guò)程中壓力壓力會(huì)將至-0.08Mpa終于）蒸料降溫過(guò)程中冷干機(jī)是一直開(kāi)著的。5.7 接種段前段后當(dāng)風(fēng)溫將至35時(shí)，方可接種，接種前要用75的酒精將接種容器消毒，消毒后將接種容器吹干后方可倒入菌種接種量一般為26個(gè)三角瓶，接種時(shí)要慢慢晃動(dòng)接種器避免接種菌容器被菌種阻塞，接種

12、完成后 打開(kāi)增氧閥門(mén)，增氧至壓力為0Mpa時(shí)打開(kāi)罐后排氣閥。5.8 自動(dòng)培養(yǎng)接種完成后打開(kāi)自動(dòng)培養(yǎng)開(kāi)噴霧1.5-2小時(shí)前期噴霧不需要太多，一般以5min-8min/h為宜，在后期24h左右至50h噴霧10-12min/h為宜，后期50-60h 8min-10min/h，60h以后停止噴霧。表1 自動(dòng)培養(yǎng)過(guò)程控制時(shí)間（h）0-66-3030-3838-6060-72風(fēng)溫（）28-3228-3230-3430-3428-32風(fēng)頻（Hz）1517202015自動(dòng)培養(yǎng)過(guò)程中，風(fēng)溫不要超過(guò)33，因?yàn)轱L(fēng)溫在33時(shí)料溫已超過(guò)34。5.9 開(kāi)罐開(kāi)罐后將風(fēng)機(jī)的風(fēng)頻調(diào)至20Hz 將種曲吹干備用。5.10 操作過(guò)程

13、中應(yīng)注意的問(wèn)題（1） 這些無(wú)意義的空格都去掉麩皮和面粉的配比保證為9：1。（2） 加水量確保加水量和物料的總質(zhì)量之比為1：1。如果加水不足則會(huì)導(dǎo)致在培養(yǎng)過(guò)程中因前期缺水而后期無(wú)法彌補(bǔ)，從而導(dǎo)致孢子數(shù)過(guò)低。（3） 粉碎時(shí)至少用粉碎機(jī)粉碎兩遍，直到?jīng)]有成團(tuán)的物料為標(biāo)準(zhǔn)。若粉碎不徹底米曲霉很難充分的利用碳源和氮源，因而影響米曲霉的生長(zhǎng)繁殖。（4） 裝盤(pán)時(shí)應(yīng)盡量保證每盤(pán)中的重量基本一樣，物料鋪的均勻一致，若鋪的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)后一段時(shí)間在物料裝盤(pán)之前還應(yīng)先用手搓一下防止物料結(jié)塊，在培養(yǎng)過(guò)程中影響通風(fēng)。（5） 入罐時(shí)一定要記住放溫度計(jì)，以便在培養(yǎng)過(guò)程中控制溫度。（6） 蒸煮過(guò)程中切記不要開(kāi)沖鏡水，防止觀察鏡遇涼

14、水而炸裂，在排冷空氣時(shí)應(yīng)盡量排盡，以便后期滅菌過(guò)程的保溫保壓。（7） 抽真空前或抽真空后記住一定要把排水閥、疏水閥關(guān)閉，使罐體保持一個(gè)相通的狀態(tài)確保后期罐體降溫的進(jìn)行，抽真空時(shí)先開(kāi)真空總閥最后開(kāi)真空泵、，抽完真空后要及時(shí)生壓為后面的接種做準(zhǔn)備。（8） 降溫時(shí)可打開(kāi)風(fēng)機(jī)同時(shí)將風(fēng)頻調(diào)至45Hz。這樣即可縮短降溫時(shí)間又能節(jié)約資源。（9） 接種前應(yīng)將和接種有關(guān)的器具進(jìn)行消毒，接種時(shí)料溫一定要保持在36以下風(fēng)溫38以下，此溫度最適合米曲霉的生長(zhǎng)繁殖。（10） 培養(yǎng) 接種完后應(yīng)立即打開(kāi)與罐體相接的培養(yǎng)閥，這樣為了確保罐體的氣壓與外界大氣壓相同，以便后期噴霧的進(jìn)行。培養(yǎng)過(guò)程中噴霧水應(yīng)定期進(jìn)行更換，過(guò)濾器應(yīng)定

15、期進(jìn)行消毒。噴霧時(shí)應(yīng)該根據(jù)料面的干濕度來(lái)決定噴霧量的大小以及時(shí)間的長(zhǎng)短。（11） 開(kāi)罐以后將除風(fēng)機(jī)以外的所有開(kāi)關(guān)都關(guān)死，同時(shí)將風(fēng)頻調(diào)至20Hz左右將種曲吹干。為了防止菌種發(fā)熱應(yīng)將菌種放在低溫干燥的條件下保存。6 種曲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)6.1 感官特性 外觀菌絲整齊健壯、孢子旺盛、頂囊肥大，米曲霉呈新鮮黃綠色、無(wú)夾心、無(wú)異色，發(fā)芽率不低于90%,孢子數(shù)達(dá)100億個(gè)/g（以干基計(jì)）。 香氣具有種曲固有的曲香味，無(wú)霉味、酸味、氨味等不良?xì)馕丁?手感用手指觸及種曲，松軟而光滑，孢子飛揚(yáng)。6.2 孢子數(shù)的測(cè)定 樣品的稀釋稱(chēng)取1g種曲放入250ml錐形瓶中然后加入5ml酒精（95%）10mlH2SO4(1：10)

16、20ml蒸餾水45個(gè)玻璃珠放在旋渦混合器中振蕩23min，使分生孢子個(gè)個(gè)分散，然后用多層紗布過(guò)濾、沖洗，使濾渣不含孢子，稀釋至500ml容量瓶中。 制片段前段后取稀釋液1d滴于血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)格上，然后將蓋片輕輕由一遍向另一遍壓下，使蓋片與計(jì)數(shù)板完全密合，液中無(wú)氣泡，用濾紙吸干多余的溢出懸浮的孢子液，靜置數(shù)分鐘，待孢子沉淀。 觀察計(jì)數(shù)用低倍鏡頭或高倍鏡頭觀察。由于稀釋液中的孢子在血球計(jì)數(shù)板上處于不同的空間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而計(jì)數(shù)時(shí)必須逐格調(diào)動(dòng)微細(xì)螺旋，才能不使遺漏。孢子數(shù)位于大格的劃線(xiàn)上，應(yīng)一律取二邊計(jì)數(shù)，而棄另兩邊，以減少誤差。使16×25計(jì)數(shù)板時(shí)，只計(jì)板上四個(gè)角上

17、的4個(gè)大格（即100個(gè)小格）。如果使用25×16的計(jì)數(shù)板，除計(jì)四個(gè)角上的4個(gè)大格外，還需要計(jì)中央一大格的數(shù)目（即80個(gè)小格）。每個(gè)樣品重復(fù)觀察計(jì)數(shù)不少于2次，然后取平均值。即為該樣品種曲的孢子數(shù)。計(jì)算： （1）16×25血球計(jì)數(shù)板 孢子數(shù)（個(gè)/g）=N/100×400×10000×V/G =4×104×NV/G 式中 : N100小格內(nèi)包子總數(shù)，個(gè)； V孢子稀釋體積，mL； G樣品重量，g。（2）25×16血球計(jì)數(shù)板： 孢子數(shù)（個(gè)/g）=N/80×400×10000×V/G =5

18、15;104×NV/G 式中 ：N80個(gè)小格內(nèi)孢子數(shù)總數(shù)，個(gè)； V樣品稀釋體積，mL； G樣品重量，g。 注意事項(xiàng)(1)稱(chēng)樣時(shí)要盡量防止孢子的飛揚(yáng)。(2)測(cè)定時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)有許多孢子結(jié)集成團(tuán)或成堆，說(shuō)明樣品稀釋未能符合操作要求，因此必須重新稱(chēng)重、振搖、稀釋。（3）生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用時(shí)，種曲以干物質(zhì)計(jì)算。因而需要同時(shí)測(cè)定種曲水分，計(jì)算時(shí)樣品改為干重量。 樣品絕干重量=G(1-W）式中：G樣品重，g W樣品水分的百分比，%參考文獻(xiàn)段前段后1姚繼承,郭云芝.應(yīng)用復(fù)合制曲技術(shù)提高大醬產(chǎn)品質(zhì)量J.中國(guó)調(diào)味品2006(01).2馬凈麗.優(yōu)選曲種提高醬油產(chǎn)量、質(zhì)量的探討2007(01).3柏芳青,馬新村,趙雙梅.醬油制曲過(guò)程中的分段控制法J.中國(guó)調(diào)味品2007(02).