感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)在損傷修復(fù)中的作用及分子機制(一)

1、感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)在損傷修復(fù)中的作用及分子機制一【摘要】為探討感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)SP在損傷修復(fù)中的作用，圍繞感覺神經(jīng)與修復(fù)進程中創(chuàng)面/傷口 SP代謝的關(guān)系、SP在修復(fù)細胞表達 生長因子及受體、表皮干細胞遷移、分化等方面的作用開展了研究。 研究證實感覺神經(jīng)釋放的SP可上調(diào)成纖維細胞表達神經(jīng)肽，誘導(dǎo)成纖 維細胞表達生長因子及受體，調(diào)控表皮干細胞遷移、分化的作用，進 入肉芽組織內(nèi)的表皮干細胞可跨胚層向血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞分 化，提示感覺神經(jīng)肽SP參與介導(dǎo)感覺神經(jīng)調(diào)控損傷修復(fù)?！娟P(guān)鍵詞】感覺神經(jīng)肽損傷修復(fù) P物質(zhì)Effectofse nsory neuropeptideSP onwoun dheali

2、 ngan ditsmolecularmecha nis mAbstract:Toi nv estigatetheeffectofse nsory neuropeptidesubsta ncePSPo nwoun dheal ingan drelatedmolecularmecha nism.Theresearchwascarriedouto ntherelatio n shipbetwee nsen sory nervesa ndmetabolismofse nsory neuropeptideSP inth ewoun ds,theroleofSPi ntheexpressio no fg

3、rowthfactorsa ndthosereceptorsby repaircells,a ndparticipatio nin migrati onan ddiffere ntiatio no fepidermalstem cells.Theresultswereasfollows:SPreleasedfromse nsory nerves in ski nwounds up regulatedneuropeptideexpressionofthefibroblastcellsjnducedfibrobla stcellstoexpresssomegrowthfactorsa ndthos

4、ereceptors,playeda nimporta ntr ole in migrati onan ddiffere ntiatio no fepidermalstemcells,whichca ntran sdifferentiateintofibroblastorendothelialcellsifthestemcellsmigratedintogradurationtissue.TheresultssuggestthatSPasamediatorofsensorynerversparticipates intheregulationofwoundhealing.Keywords:se

5、nsoryneuropeptide;woundrepair;substanceP感覺神經(jīng)肽為感覺神經(jīng)元胞體合成的一類神經(jīng)肽，包括P物質(zhì)(SP)降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)神經(jīng)肽Y(NY) K物質(zhì)等，其中SP與損傷修復(fù) 關(guān)系最為密切。組織損傷可刺激感覺神經(jīng)末梢儲存的 SP進入損傷組織， 與巨噬細胞、T淋巴細胞、肥大細胞等免疫細胞的特異受體結(jié)合，通過 刺激免疫細胞釋放細胞因子，參與組織修復(fù)早期的炎癥階段的調(diào)控； SP與成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、角質(zhì)細胞細胞相應(yīng)受體結(jié)合，可促 進DNA合成和細胞增殖1。由于感覺神經(jīng)末梢釋放的SP受內(nèi)肽酶降解，半衰期僅數(shù)分鐘，因而以 往認為SP對組織修復(fù)的影響有限。近

6、年來研究已證實，與組織修復(fù)有 關(guān)的成纖維細胞、上皮細胞也可表達SP,損傷組織中SP含量變化與感 覺神經(jīng)纖維的數(shù)量以及愈合類型關(guān)系密切：在肉芽組織增生階段，感 覺神經(jīng)纖維的數(shù)量和SP含量均高于肉芽組織成熟期；增生性瘢痕組織 中SP含量高于正常皮膚或生理愈合的瘢痕組織2。因此，人們推測 感覺神經(jīng)釋放的SP和組織細胞表達的SP存在某種聯(lián)系，SP是周圍神 經(jīng)調(diào)控組織修復(fù)重要因子。為了驗證上述假設(shè)，作者所在的課題組對 此開展了較深入的研究，本文報告其主要研究成果。1SP為介導(dǎo)感覺神經(jīng)調(diào)控傷口愈合的重要細胞因子以大劑量辣椒素化學(xué)毀損成年大鼠感覺神經(jīng)后行皮膚全層切割傷辣 椒素組，免疫組化示肉芽組織細胞間隙、

7、成纖維細胞和毛細血管周圍 SP CGRP免疫陽性染色明顯弱于感覺神經(jīng)正常組，傷后3天、9天，辣椒素組SP CGRP免疫陽性染色的吸光度分別為感覺神經(jīng)正常組 53.23%、64.80%和42.70%、40%3。辣椒素組大鼠傷口愈合延遲明 顯，傷后12天傷口面積仍為感覺神經(jīng)正常組的 2倍，肉芽組織肌成纖 維細胞標(biāo)識物彳 肌動蛋白Q SMA數(shù)量減少4。鏈脲佐菌素STZ 誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的皮膚感覺神經(jīng) A3類有髓神經(jīng)髓鞘水腫、變性， 無髓神經(jīng)空泡樣變性，微管、微絲排列紊亂，酶聯(lián)免疫ELISA檢測示皮膚SP含量僅為正常皮膚的24.64%- 38.35% 5。胎兔損傷皮膚修復(fù)呈無瘢痕愈合，免疫組化示愈

8、合皮膚SP CGRP陽性 染色數(shù)量低于成年兔。將已浸泡10-4mol/LSP的聚乙烯醇海綿放置于胎 兔皮膚切口內(nèi)，然后將胎兔送回子宮內(nèi)，傷后7天剖腹取出致傷胎兔， 見胎兔皮膚切口處有明顯瘢痕形成；如胎兔皮膚切口內(nèi)放置已浸泡生 理鹽水SP溶劑的海綿，愈合皮膚無瘢痕，鏡下無明顯纖維組織增 生以及膠原沉積6。研究結(jié)果提示，胎兒皮膚無瘢痕愈合與 SP低水 平表達有關(guān)。2成纖維細胞、表皮干細胞SP表達受外源性SP調(diào)控采用定量PCR Westernblot、ELISA等方法證實表皮干細胞可表達 SR 為了解感覺神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽對修復(fù)細胞表達 SP的作用，以SP10-510-7mol/L刺激體外培養(yǎng)的皮

9、膚和增生性瘢痕的成纖維細胞、皮膚表皮干細胞，分別檢測刺激前后細胞內(nèi) SP基因、蛋白表達和培養(yǎng) 液中SP濃度。結(jié)果說明外源性SP刺激后，皮膚和增生性瘢痕成纖維 細胞SPmRNA水平和培養(yǎng)液中SP濃度均顯著升高，刺激后24小時仍 高于刺激前水平，皮膚成纖維細胞 SP基因和蛋白表達的峰值時相較增 生性瘢痕提前3小時7SP刺激表皮干細胞后3小時，內(nèi)源性SP基 因和蛋白表達顯著上調(diào)，分別在刺激后14小時和18小時到達峰值；阻斷SP特異受體(陋1和NK 2)抑制SP表達上調(diào)8。上述結(jié)果 說明成纖維細胞、表皮干細胞表達 SP受外源性SP的影響，提示在皮 膚損傷時存在感覺神經(jīng)末梢釋放 P物質(zhì)可引起修復(fù)細胞長時

10、程神經(jīng) 內(nèi)分泌反響，這可能是損傷組織 P物質(zhì)含量高的重要原因。3SP可調(diào)控肉芽組織成纖維細胞表達生長因子及受體3.1SP調(diào)控生長因子及受體表達的量效與時效特征以往研究已證實，SP可刺激免疫細胞釋放生長因子，但對修復(fù)細胞的作用尚無報告。本研 究發(fā)現(xiàn)大鼠皮下注射辣椒素 50mg/kg毀損感覺神經(jīng)1周后行皮膚全層 切割傷，傷口肉芽組織SP免疫陽性染色減弱與表皮生長因子(EGF及受 體(EGFR、成纖維細胞生長因子2(FGF 2)、成纖維細胞生長因子受體 1(FGFR 1)的基因表達抑制同步。不同濃度(10-910-5mol/L)SP作 用于培養(yǎng)大鼠肉芽組織成纖維細胞，RT PCR、Westernbl

11、ot檢測示SP 可上調(diào)培養(yǎng)肉芽組織成纖維細胞表達EGF FGF 2、轉(zhuǎn)化生長因子卩l(xiāng)(TGFp 1)及其受體的基因和蛋白表達。調(diào)控生長因子與受體表達 的SP濃度閾值不同，通常上調(diào)生長因子表達的SP濃度低于對相應(yīng)受體上調(diào)的濃度，如上調(diào)成纖維細胞內(nèi)源性 EGFmRNA EGFRmRNA表達的SP濃度分別為10-810-6mol/L和10-610-5mol/L,上調(diào)FGF 2和 FGFR lrnRNA表達的sp濃度分別為 10-9io-5moi/L和io-6 10-5mol/L 9。采用上調(diào)上述生長因子及受體表達至峰值的 SP濃度作用于成纖維細胞， 觀察作用后表達的時效關(guān)系。實驗證實，SP作用后上述

12、生長因子及受體mRNA表達大多持續(xù)至作用后6小時，蛋白質(zhì)水平表達持續(xù)至16 24 小時9, 10。上述研究結(jié)果提示，SP不僅有直接促進損傷修復(fù)的作用1，同時上 調(diào)肉芽組織成纖維細胞表達生長因子與受體， 放大 S的促修復(fù)作用； 調(diào)控不同的生長因子與受體表達的 SP濃度閾值不同。3.2成纖維細胞核因子NF KB激活是SP上調(diào)生長因子表達的重要通路 NF幽是存在細胞漿的快反響轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控眾多的細胞因子和生長 因子的表達，以凝膠電泳阻滯實驗EMSA檢測SP刺激后的成纖維細胞 NF KB的DNA結(jié)合活性。研究發(fā)現(xiàn)10-7mol/L濃度SP作用30分鐘， NF KB活性可到達峰值；SP特異的受體NK1受

13、體阻斷劑GR73632 可阻斷SP的刺激效應(yīng)。SP對NF KB的活化可分別被抗氧化劑 PDTC 和鈣離子拮抗劑BAPTA AM抑制，提示sp的活化作用可能是通過氧 自由基和鈣離子介導(dǎo)。采用NF kB硫代寡核苷酸圈套能明顯抑制成纖 維細胞FGF 2表達，但對EGF表達無明顯作用11, 12。4SP在表皮干細胞遷移、分化中的作用及機制4.1SP是調(diào)控表皮干細胞增殖、遷移、分化的重要因子采用STZ糖尿病大鼠模型，觀察皮膚神經(jīng)肽含量病理性減少對表皮干細胞增殖的影響， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射STZ后 1周至4周，糖尿病大鼠皮膚SP含量與表皮 基底層表皮干細胞標(biāo)識物B1整合素、K19陽性染色細胞數(shù)均呈進行 性下

14、降，兩者明顯相關(guān)；STZ糖尿病大鼠創(chuàng)面局部應(yīng)用 SP創(chuàng)緣及新 生上皮B1整合素、K19陽性細胞數(shù)較對照組明顯增加13。提示SP 是維持表皮干細胞增殖的重要因子。以往認為表皮干細胞的遷移、分化主要與細胞外基質(zhì)成分的改變、細 胞之間的接觸、EGF FGF等細胞因子的作用有關(guān)，對感覺神經(jīng)肽的作 用了解甚少。本研究利用干細胞核標(biāo)記滯留的慢周期性，以5溴2 尿嘧啶脫氧核苷BrdU注射Wistar新生鼠，8周后行皮膚全層切割傷， 觀察傷口內(nèi)BrdU和表皮干細胞標(biāo)志物K19、B1整合素雙重免疫陽性 的細胞分布與傷口應(yīng)用 SP的關(guān)系14。研究發(fā)現(xiàn)皮膚全層切割傷后 創(chuàng)緣與創(chuàng)面中每日注射 SP10-7mol/L

15、250卩11次，傷后3天和5天分 別在創(chuàng)緣和肉芽組織可見 BrdU及K19、B1整合素免疫陽性細胞，說明 表皮干細胞已遷移進入上述組織；未注射 SP的大鼠創(chuàng)緣陽性細胞數(shù)明 顯少于注射SP的大鼠，肉芽組織也未見免疫陽性細胞。如以大劑量辣 椒素預(yù)先毀損感覺神經(jīng)后行皮膚切割傷，傷后3天創(chuàng)緣BrdU陽性數(shù)僅 為未注射SP的大鼠的14.43% 14。進一步研究說明，遷移入肉芽組 織的表皮干細胞除可分化為成纖維細胞外，也可跨胚層分化為血管內(nèi) 皮細胞。此外，有文獻報告，在損傷角膜局部，應(yīng)用SP可誘導(dǎo)血液中 骨髓間充質(zhì)干細胞向損傷部位遷移，促進修復(fù) 15。為了解SP對表皮干細胞分化方向的影響，將10-7mol/L濃度SP參加表 皮干細胞培養(yǎng)液中，參加后 96 小時，流式細胞儀檢測示， 89.7%的干 細胞分化為整合素a6和CD71高表達的短暫擴充細胞，對照組無變化16。將SP分別參加BrdU標(biāo)記的大鼠表皮干細胞(來源于表皮基底 層)培養(yǎng)液中，注射干細胞混懸液于毛囊發(fā)育不良的裸鼠皮下，并在 回植部位注射SP。注射干細胞混懸液28天后，參加SP的大鼠皮下毛 囊數(shù)目明顯較未參加SP的裸鼠增多，部份皮下毛囊的毛球、內(nèi)外毛根 鞘部位的細胞胞核中可見 BrdU陽性染色