實時熒光定量PCR技術(shù)及其應用

1、實時熒光定量PCR技術(shù)及其應用摘要：實時熒光定量PCR 技術(shù)是在PCR 反應體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR 反應進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，具有操作簡便、快速高效，高通量，而且高敏感性等特點，該技術(shù)在分子診斷、分子生物學研究、動植物檢疫以及食品安全檢測等方面有廣泛的應用。文章對實時熒光定量PCR 的原理、主要類型、優(yōu)點、影響因素及應用等進行了綜述。關(guān)鍵詞：實時熒光定量PCR 類型 優(yōu)點 影響因素 應用實時熒光定量PCR技術(shù)(real-time fluores-cence quantitative PCR, RTFQ PCR)是1996年由美國

2、Applied Biosystems公司推出的一種新技術(shù),它不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,具有靈敏度高、特異性強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。1目前，該技術(shù)已廣泛應用于分子生物學、醫(yī)學等學科和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，特別是在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物的定性檢測、品系鑒定、轉(zhuǎn)基因成分含量的檢測中發(fā)揮著重要作用2。1 實時熒光定量PCR技術(shù)的原理實時熒光定量PCR 的原理是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理是當一個熒光分子（供體分子）的熒光光譜與另一個熒光分子（受體分子）的激發(fā)光譜重疊時，供體熒光分子自身的熒光強度衰減，受體熒光分子的熒光強度增強。Ct 值

3、是指每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct 值是實時熒光PCR 中一個很關(guān)鍵的因素，C 代表循環(huán)（Cycle），t代表閾值（Threshold）。每個模板的Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可做出標準曲線。因此，根據(jù)熒光探針的發(fā)光基團所發(fā)出的熒光強度與PCR 產(chǎn)物的數(shù)量呈對應關(guān)系，只要對熒光信號進行“實時”檢測并獲得未知樣品的Ct 值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。與普通PCR 相比，實時熒光定量PCR 可以利用熒光信號實時監(jiān)測PCR 反應過程中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物的變化，可以對初始模板量進行定

4、量分析。簡單地說，實時熒光定量PCR 的基本原理就是樣本核酸擴增呈指數(shù)增長，在反應體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA 含量與擴增產(chǎn)物的對數(shù)成正比，由于反應體系中的熒光染料或熒光標記物（熒光探針）與擴增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴增產(chǎn)物量成正比，因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。2 實時熒光定量PCR 技術(shù)的主要類型熒光定量PCR 所使用的熒光化學材料可分為兩大類，即熒光染料和熒光探針。熒光染料以SYBR Green為主要代表，是非特異性熒光化學材料。熒光探針包括TaqMan、分子信標、熒光標記引物、雜交探針等，屬于特異性熒光材料。2.1 SYBR GreenSYBR Green是一種

5、能夠與雙鏈DNA 小溝結(jié)合的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green發(fā)出微弱的熒光，但是一旦與雙鏈DNA 結(jié)合，其熒光強度大大增強。因此，一個反應發(fā)出的全部熒光信號與出現(xiàn)的雙鏈DNA 量成正比，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR 體系中的雙鏈DNA 的數(shù)量3。其優(yōu)點是檢測方法簡單，通用性好，價格相對較低，是許多實驗室開展熒光定量實驗的首選。SYBR Green的缺點在于它能夠和所有的雙鏈DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)、非特異性擴增產(chǎn)物引起的熒光信號會影響定量的準確性。但可以通過優(yōu)化PCR 的反應條件、選擇設(shè)計良好的引物，來減少或去除引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生；另外，也可以通過對擴

6、增產(chǎn)物的溶解曲線進行分析來判斷熒光信號的真實性。2.2 TaqMan 探針TaqMan 探針技術(shù)是有美國Perkin Elmer（PE）公司研制的一種實時PCR 定量技術(shù)，在PCR 擴增加入一對引物的同時加入1 個特異性的熒光探針，此熒光探針為一個3045 bp的寡核苷酸，它設(shè)計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對，其5端標記熒光發(fā)射基團，3端標記熒光淬滅基團。當探針保持完整時，3端淬滅基團抑制了5端發(fā)射基團的熒光發(fā)射。但在PCR 擴增中，模板變性后低溫退火，引物與探針同時與模板結(jié)合，在引物的介導下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq DNA 聚合酶的53外切酶活性將探針

7、5端連接的熒光發(fā)射基團從探針上切割下來，游離于反應體系中，從而脫離3' 端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號。由于被釋放的熒光基團數(shù)目和PCR 產(chǎn)物數(shù)量是相對應關(guān)系，且熒光強度同被釋放的熒光基團的數(shù)目也是正比關(guān)系，因此該技術(shù)可對模板進行準確定量4。TaqMan 探針技術(shù)特異性好、準確性高、假陽性低、重復性比較好。但是需要設(shè)計特異性的探針，因此成本較高5。2.3 分子信標分子信標技術(shù)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)狀雙標記寡核苷酸探針，環(huán)部與靶DNA 序列互補，為1535 bp；莖部是由互相配對的堿基組成，但與靶DNA 無序列同源性，約8 bp。在探針的5端和3端分別標記熒光發(fā)射基團和熒光

8、淬滅基團。當溶液中的模板與分子信標結(jié)合配對時，分子信標的構(gòu)象改變成鏈狀使得熒光發(fā)射基團與淬滅基團分開，當熒光基團被激發(fā)時，就發(fā)出熒光信號。與探針互補的靶分子數(shù)量越多，熒光信號也就越強，從而實現(xiàn)了對目的基因的定量檢測。分子信標的方法優(yōu)點是特異性強，熒光背景低。其缺點是設(shè)計困難，雜交探針不能完全與模板結(jié)合，穩(wěn)定性較差，價格高6。3 熒光定量PCR與常規(guī)PCR的比較熒光定量PCR是將熒光技術(shù)應用于PCR,即使用熒光染料或熒光標記的探針,與PCR過程中的擴增產(chǎn)物結(jié)合,在PCR的每一次循環(huán)中,都可觀察到熒光強度的變化,這種變化對應于擴增產(chǎn)物量的增加,通過繪制標準曲線,最終可得到反應初期的靶基因數(shù)量。熒光

9、定量PCR用特定的儀器將PCR的擴增、檢測和結(jié)果分析結(jié)合在一起,實現(xiàn)了真正意義上的實時絕對定量,相比于常規(guī)PCR具有許多優(yōu)點。3.1實時測定,節(jié)約時間常規(guī)RT-PCR在PCR反應后,常需要使用凝膠電泳其染色(EB為致癌物質(zhì))、DNA測序、Southernblot等方法對結(jié)果進行人工或自動化定量,這些后續(xù)步驟不僅使測定時間變長,而且在樣品的傳遞過程中還增加了污染的機會,而熒光定量PCR不需要擴增后的這些處理就可直接對待測樣本實時定量同時,從逆轉(zhuǎn)錄開始到完整定量結(jié)束的整個過程都可實現(xiàn)自動化,這極大地節(jié)約了時間和勞動量。3.2重復性好,測定偏差小PCR的重復性可用循環(huán)閾值來衡量,在熒光定量PCR過程

10、中,連續(xù)不斷地監(jiān)測反映體系中熒光信號的變化,當信號增強到某一閾值(根據(jù)熒光信號基線的平均值和平均標準差,計算出以99.7%的置信度大于平均值的熒光值,即為閾值)時,此時的循環(huán)次數(shù)即為循環(huán)閾值。熒光定量PCR循環(huán)閾值的變異系數(shù)在2%以下,而常規(guī)RT-PCR變異系數(shù)多在14%左右,毫無疑問,實時逆轉(zhuǎn)錄PCR比常規(guī)PCR的測定偏差明顯減小。3.3靈敏度高,特異性好常規(guī)PCR有時為提高靈敏度,常需要進行二次擴增,但這同時也降低了特異性,增加了污染的可能性和假陽性錯誤。而對于熒光定量PCR,其高靈敏度不需要進行二次擴增,這將減少假陽性機率。因此,熒光定量PCR在提高反應靈敏度的同時,也保證了其特異性。4

11、 影響實時熒光定量PCR試驗結(jié)果的因素從DNA出發(fā)進行定量相對比較簡單，一般在保證引物及探針的特異性、PCR 反應體系的合理性以及DNA 模板的純度和完整性的情況下，可以保證試驗的順利進行。從RNA 出發(fā)對mRNA 進行定量時，操作比較復雜，影響試驗結(jié)果的因素也比較多。4.1 RNA 的完整性因為RNA 一旦降解所定量的結(jié)果就不能正確反映樣品中mRNA 的量，所得的結(jié)果也是錯誤的。所以在RNA 提取過程中要嚴格遵守操作規(guī)范，避免RNA 酶的污染7-8。4.2 RNA 樣品中的基因組DNA 污染提取的RNA 樣品中不可避免地混有少量的基因組DNA?；蚪MDNA 對試驗有兩個影響：一是影響對RNA

12、 的精確定量；二是影響PCR 擴增的特異性。4.3 PCR 反應體系的優(yōu)化PCR 擴增過程必須保證擴增產(chǎn)物只有特異的目標產(chǎn)物，為此，首先要保證PCR 反應體系達到最優(yōu)。目前許多公司都有用于實時定量PCR 反應的試劑盒，可以方便PCR 反應的操作。4.4 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄所得cDNA 的量必須精確地等于相應的mRNA 的量，反轉(zhuǎn)錄對于實時定量PCR 來說是非常關(guān)鍵的一步。目前常用的反轉(zhuǎn)錄酶有2 種：AMV-RT 和MMLV-R。反轉(zhuǎn)錄常用的引物有隨機引物、Oligo-dT 和特異引物。相比之下Oligo-dT 和特異性引物更適合實時定量PCR9。4.5 利用實時定量PCR 研究基因表達時，一般用相對

13、定量的方法相對定量必須用到內(nèi)標基因?？煽康膬?nèi)標基因應是在不同細胞類型、不同試驗條件下都穩(wěn)定表達的持家基因。常用的內(nèi)標基因有-tublin、actin、GAPDH、18sRNA、efla 和Cyclophilin 等10。盡管在大多數(shù)情況下這些持家基因的表達非常穩(wěn)定，但是最近有報道認為這些持家基因的表達在某些情況下會發(fā)生變化。也就是說并不是任何內(nèi)標基因都適合任何試驗。在選擇內(nèi)標基因時，應仔細考慮各種因素，選擇合適的內(nèi)標基因或內(nèi)標基因組合。5 實時熒光定量PCR方法的應用實時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛地應用于基因表達的定量(細胞因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子等)和等位基因的鑒定(單核苷酸多態(tài)性的檢測)等

14、分子生物學基礎(chǔ)研究領(lǐng)域11。同時,由于其能夠快速、簡便地擴增微量DNA序列,且特異性好、靈敏度高和操作簡單等特點,被廣泛地用于各種病原體的檢測(病毒、細菌、真菌、寄生蟲等)的檢測監(jiān)控以及定量分析。5.1植物病害檢驗檢疫實時熒光PCR技術(shù)由于其高特異性和靈敏性的特點,目前被認為是植物病原鑒定和病害診斷的革命性方式,已經(jīng)成為植物病害診斷中新的可靠方法12。甚至一些尚不能得到純培養(yǎng)的病原菌可以實時熒光定量方法檢測出來,并且通過內(nèi)參基因和定量樣品的處理可以對其在植物組織中的菌量進行定量檢測13。王中康14等已經(jīng)建立了柑桔難培養(yǎng)韌皮桿菌的實施熒光檢測方法,利用該方法不僅可以定性、定量檢測出不同組織中柑桔

15、黃龍病菌,還對病菌在其傳播媒介昆蟲-柑桔木虱體內(nèi)的循環(huán)進行了深入研究15。P.Kogovsek16通過熒光RT-PCR快速檢測出PVYNTN之間潛在的塊莖壞死和標準PVYN分離菌株,該方法還可以探測到PVYO株系,敏感性高于ELISA法7個數(shù)量級。在出入境檢驗檢疫中,實時熒光定量檢測由于其高靈敏度和快速可靠操作簡便的特點而成為首選檢驗方法。劉紅光等17利用熒光定量的方法檢測了柑橘衰退病,其檢測靈敏度較常規(guī)PCR提高了100倍;郭京澤等18根據(jù)辣椒輕斑駁病毒衣殼蛋白區(qū)域編碼序列,設(shè)計了辣椒輕斑駁病毒的特異TaqMan熒光探針,檢測結(jié)果只有感染辣椒輕斑駁病毒的樣本進行熒光PCR檢測呈陽性,而煙草花

16、葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯Y病毒的熒光PCR檢測都呈陰性,所建立辣椒輕斑駁病毒實時熒光PCR檢測方法靈敏度高,是DAS-ELISA法的100倍;李博等19依據(jù)萎蔫短小桿菌糖甜菜致病變種的16S23SrRNA間隔區(qū)ITS序列,設(shè)計引物CfbF/CfbR.PCR擴增3個糖甜菜葉斑菌及29個參比菌株,僅靶標菌擴增出191bp產(chǎn)物。已經(jīng)有大量檢疫性植物病害有了規(guī)范化的實時熒光檢測方法,而熒光檢測的高靈敏度使其可以進行無癥帶菌樣品的檢測,為重大疫害生物的非疫區(qū)建設(shè)提供了保障,保證了植物生產(chǎn)安全。5.2醫(yī)學和動物檢疫動物檢疫對畜牧業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要,而且一些動物病害還直接威脅著人體的健康。近年來,瘋牛病、

17、綿羊癢病已被證實與人的克雅氏病有直接關(guān)系。因此,國際上嚴格禁用肉骨粉作所有牲畜的飼料用途,動物源性食品、某些日用消費品的安全性也受到關(guān)注。熒光定量PCR在動物檢疫方面的應用之一是對動物源性飼料、食品或其他日用品中牛羊源性成分進行檢測,它可使檢測變得更加簡便和準確。實時熒光PCR更主要的應用方向是醫(yī)學和動物病害的檢測和鑒定?？漳c彎曲菌是人類主要的食源性病原之一,常規(guī)細菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果不可靠。陽成波等20先后建立基于TaqMan探針R和SYBRGreen I的熒光定量方法來檢測空腸彎曲菌,檢測限度為5cfu,整個檢測過程在60min內(nèi)完成。張鶴曉等21根據(jù)A型流感病毒的核酸保守區(qū)共有序列,開發(fā)、設(shè)計

18、多條引物和探針序列,從中篩選敏感、特異的引物和探針,在循環(huán)參數(shù)、病毒核酸的提取方法、反轉(zhuǎn)錄條件的基礎(chǔ)上,建立了快速的通用型“一步法”檢測所有A型流感病毒的通用型熒光RT-PCR。宋志軍等22建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法,靈敏度可達5.0拷貝。楊素等23應用熒光RT-PCR技術(shù),利用口蹄疫病毒的5端UTR區(qū)的IRES片段設(shè)計和合成了可檢測7個血清型口蹄疫病毒群特異性引物和Taqman探針,結(jié)果表明:該方法敏感性高、特異性強,克服了傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法耗時長，敏感性和準確性較差,而且容易造成病毒擴散及環(huán)境污染的缺點,適用于大批量樣品的快速檢測

19、。5.3環(huán)境微生物檢測環(huán)境中存在著多種多樣的致病微生物,它們與許多傳染性疾病的傳播和流行密切相關(guān)。因此,定期檢測環(huán)境中致病微生物的動態(tài)(種類、數(shù)量、變化趨勢等)具有重要的實際意義。傳統(tǒng)檢測方法是對病原體進行人工培養(yǎng)或細胞培養(yǎng),或是對無法培養(yǎng)的病原體進行顯微鏡檢測,這些方法不僅耗費大量的人力、物力和財力,而且準確度差。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測環(huán)境中的微生物病原體,無需培養(yǎng)而是直接取樣進行分析,特異性強、靈敏度高、快速簡便且具有較高的精確度。Brooks24等對雨季時海水中的甲肝病毒,采用該技術(shù)進行了檢測及定量分析。結(jié)果表明,該技術(shù)對甲肝病毒的定性及定量測定均有很高的精確度。同時指出了PCR技術(shù)

20、對環(huán)境微生物定量測定的發(fā)展前景。Rebecca25等采用FQ-PCR對容易引起水傳播疾病的賈第蟲和隱孢子蟲進行了定量檢測分析,建立了定量分析方法。5.4轉(zhuǎn)基因檢測PCR技術(shù)是檢測轉(zhuǎn)基因最方便快捷的方法。因此,基于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中特異DNA片段的熒光定量PCR篩選鑒定方法已被一些國家作為農(nóng)產(chǎn)品及其加工食品中轉(zhuǎn)基因成分的標準檢測方法。其檢測的原理主要是利用RTQ-PCR檢測選擇標記、啟動基因以及轉(zhuǎn)入的靶基因。欒鳳俠26等針對轉(zhuǎn)基因小麥品系中通用的啟動子、終止子以及標記基因進行定性篩選檢測,同時用已知為單拷貝的Wx012基因作為內(nèi)源特異參照基因,繪制內(nèi)源基因和外源基因的標準曲線,建立了轉(zhuǎn)基因小麥的RTQ

21、-PCR檢測方法。陳紅運27等根據(jù)已商品化的轉(zhuǎn)基因植物品系的基本信息,選擇了CaMV35S啟動子,FMV35S啟動子,NOS終止子,NPT、pac和bar作為目標基因,設(shè)計特異引物和TaqMan熒光探針檢測轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品,包括轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因油菜籽和轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。李蔥蔥等28根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米Bt176中內(nèi)源基因Zein和外源基因cry1Ab設(shè)計引物及TaqMan熒光探針,成功建立了檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt176品系的RTQ-PCR方法。應用實時熒光PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因作物,不僅可以用于檢測轉(zhuǎn)基因成分,而且可以用于鑒定轉(zhuǎn)基因品系。Tesson29等確定了實時熒光定量PCR的技術(shù)條件,利用2

22、種發(fā)光探針及適當?shù)难h(huán)閾值,擴增1個轉(zhuǎn)移后的基因和1個對照基因,以分析轉(zhuǎn)基因鼠的基因接合性,結(jié)果表明:同型結(jié)合和異質(zhì)接合的動物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律,該方法為轉(zhuǎn)基因動物的同型結(jié)合及異質(zhì)接合研究提供了可靠方法,在轉(zhuǎn)基因動物繁育及基因劑量功能效應研究中具有廣泛用途。參考文獻1 余啟利.以人性化管理提升高校班級管理功能J.忻州師范學院學報，2007，23（2）：123-125.2 史濟民.Visual FoxPro 及其應用系統(tǒng)開發(fā)M.北京：清華大學出版社，2007.3 BECKER K，PAN D，WHITELY C B.Real-time quantutative po

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