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1、 通則0512高效液相色譜法 ( 2016年3月26日 ) (藥典四部60頁) 13 / 13高效液相色譜法:系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱,對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。 注入的供試品,由流動相帶入色譜柱內(nèi),各組分在柱內(nèi)被分離,并進(jìn)入檢測器檢測, 由積分儀或數(shù) 據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。1.對儀器的一般要求和色譜條件高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。色譜柱內(nèi)徑一般為3.94.6mm,填充劑粒徑為310m。超高液相色譜儀:是適應(yīng)小粒徑(約2m)填充劑的耐超高壓、小進(jìn)樣量、低死體積、 高靈敏度檢測的高效液相色譜儀。(1)
2、160;色譜柱反相色譜柱:以鍵和非極性基團(tuán)的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復(fù)合硅膠和聚合物等;常用的填充劑優(yōu)十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。正相色譜柱: 用硅膠填充劑,或鍵合極性基團(tuán)的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠 和 氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反向色譜。離子交換色譜柱:用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。手性分離色譜柱:用手性填充劑填充而成的色譜柱。色譜柱的內(nèi)徑和長度,填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、載體表面基團(tuán)殘留量,填充的致
3、密與均勻程度等均影響色譜柱的性能,應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)來選擇合適的色譜柱。溫度會影響分離效果,品種正文中未指明色譜柱溫度時系指室溫,應(yīng)注意室溫變化的影響。為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的溫度,但一般不宜超過60。殘余硅羥基未封閉的硅膠色譜柱,流動相的pH值一般應(yīng)在28之間。殘余硅羥基已封閉的硅膠、聚合物復(fù)合硅膠或聚合物色譜柱可耐受更廣泛pH值的流動相,適合于pH值小于2或大于8的流動相。(2) 檢測器 最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器,包括二極管陣列檢測器,其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測
4、器、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器, 其響應(yīng)值不僅與被測物質(zhì)的量有關(guān),還與其結(jié)構(gòu)有關(guān);蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器, 對所有物質(zhì)均有響應(yīng),結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)在蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值幾乎僅與被測物質(zhì)的量有關(guān)。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器和示差折光檢測器的響應(yīng)值與被測物質(zhì)的量在一 定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,但蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值與被測物質(zhì)的量通常呈指數(shù)關(guān)系,一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測器,對流動相的要求不同。紫外-可見分光檢測器所用流動相應(yīng)符合紫外可見分光光度法(通則0401)項下對溶劑的要求;采用低波長檢測時,還應(yīng)考慮有機溶劑的截止使用波長,并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)
5、光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器不得使用含不揮發(fā)性鹽的流動相。(3)流動相 反相色譜系統(tǒng)的流動相常用甲醇水系統(tǒng)和乙腈水系統(tǒng),用紫外末端波長檢測時,宜選用乙腈-水系統(tǒng),流動相中應(yīng)盡可能不用緩沖鹽,如需用時,應(yīng)盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時,流動相中有機溶劑一般不低于5%,否則導(dǎo)致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。正相色譜系統(tǒng)的流動相: 常用兩種或兩種以上的有機溶劑,如二氯甲烷和正己烷等。品種正文項下規(guī)定的條件除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外,其余如色譜柱內(nèi)徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器靈敏度等,均可適當(dāng)改變,以達(dá)到系統(tǒng)適應(yīng)性試驗的要求
6、。調(diào)整流動相組分比例時,當(dāng)小比例組分的百分比例X小于等于33%時,允許改變范圍為0.7X1.3X; 當(dāng)X大于33%時,允許改變范圍為X-10%X+10%。若需使用小粒徑(約2m)填充劑,輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配;如有必要,色譜條件也應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時,應(yīng)以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。當(dāng)必須使用特定牌號的色譜柱方能滿足分離要求時,可在該品種正文項下注明。2.系統(tǒng)適用性試驗色譜系統(tǒng)的適用性試驗: 通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性等五個參數(shù)。色譜系統(tǒng)的適用性試驗定義: 按各品種正文項下要求對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗
7、 即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗, 必要時,可對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,以符合要求。(1)色譜柱的理論板數(shù)(n) 用于評價色譜柱的分離效能。 由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同,采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時, 應(yīng)指明測定物質(zhì),一般為待測物質(zhì)或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下,注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液,記錄色譜圖,量出供試品主成分色譜峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰的保留時間tR 和峰寬(W)或半高峰寬(Wh/2), 按下式計算色譜柱的理論板數(shù): n = 16( tR / W)2 或 n = 5.54( tR / Wh/2 )2 tR、W、
8、W h/2 可用時間或長度計(下同),但應(yīng)取相同單位。(2) 分離度(R) 用于評價待測物質(zhì)與被分離物質(zhì)之間的分離程度,是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關(guān)鍵指標(biāo)。 可以通過測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度, 對色譜系統(tǒng)分離效能進(jìn)行評價與與調(diào)整。 也可以通過測定待測物質(zhì)與某一降解產(chǎn)物的分離度,無論是定性鑒別還是定量測定,均要求待測物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對照色譜峰及其他色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外,待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大于1.5。分離度的計算公式為: 式中 tR2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時間 tR1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時間 W1、W2及W1
9、,h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬(如圖)。 當(dāng)對測定結(jié)果有異議時,色譜柱的理論板數(shù)(n)和分離度(R)均以峰寬(W)的計算結(jié)果為準(zhǔn)。(3)靈敏度 用于評價色譜系統(tǒng)檢測微量物質(zhì)的能力,通常以信噪比(S/N)來表示。通過測定一系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛頊y定信噪比。 定量測定時,信噪比應(yīng)不小于10; 定性測定時,信噪比應(yīng)不小于3。 系統(tǒng)適用性試驗中可以設(shè)置靈敏度實驗溶液來評價色譜系統(tǒng)的檢測能力。(4)拖尾因子(T) 用于評價色譜峰的對稱性。 拖尾因子計算公式為: 式中 W0.05h為5%峰高處的峰寬;d1為峰頂在5%峰高處橫坐標(biāo)平行線的投影點至峰前沿與此平行線交點的
10、距離(如圖)。 以峰高作定量參數(shù)時,除另有規(guī)定外,T值應(yīng)在0.951.05之間。以峰面積作定量參數(shù)時,一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分, 但嚴(yán)重拖尾會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準(zhǔn)確性, 此時應(yīng)在各品種正文項下對拖尾因子作出規(guī)定。(5) 重復(fù)性 用于評價色譜系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)樣時響應(yīng)值的重復(fù)性能。 采用外標(biāo)法時,通常取各品種項下的對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次, 除另有規(guī)定外,其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%; 采用內(nèi)標(biāo)法時, 通常配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對照品溶液,加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液, 配成3種不同濃度的溶液,分別至少進(jìn)樣2次, 計算平均校正因子,其相
11、對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。3.測定法(1) 內(nèi)標(biāo)法 按各品種正文項下的規(guī)定,精密稱(量)取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì),分別配成溶液, 各精密量取適量,混合配成校正因子測定用的對照溶液。 取一定量進(jìn)樣,記錄色譜圖。 測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高, 按下式計算校正因子: 式中 AS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高; AR為對照品的峰面積或峰高; cS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度; cR為對照品的濃度。再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液,進(jìn)樣,記錄色譜圖,測量供試品中待測成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高,按下式計算含量: 式中 AX為供試品的峰面積或峰高; cX為供試品的濃度; A's為內(nèi)標(biāo)
12、物質(zhì)的峰面積或峰高; c'S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度; f為內(nèi)標(biāo)法校正因子。 采用內(nèi)標(biāo)法,可避免因供試品前處理及進(jìn)樣體積誤差對測定結(jié)果的影響。(2)外標(biāo)法 按各品種項下的規(guī)定,精密稱(量)取對照品和供試品,配制成溶液, 分別精密取一定量,進(jìn)樣,記錄色譜圖, 測量對照品溶液和供試品溶液中待測物質(zhì)的峰面積(或峰高), 按下式計算含量: 式中各符號意義同上。 由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量,當(dāng)采用外標(biāo)法測定時, 以手動進(jìn)樣器定量環(huán)或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣為宜。(3)加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質(zhì)含量時,可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時,按各品種項下的規(guī)定,精密稱(量)取待測物質(zhì)對照
13、品和參比物質(zhì)對照品各適量,配制待測物校正因子的溶液,進(jìn)樣,記錄色譜圖, 按下式計算待測物的校正因子:校正因子= 式中 cA為待測物的濃度; AA為待測物的峰面積或峰高; cB為參比物質(zhì)的濃度; AB為參比物質(zhì)的峰面積或峰高。也可精密稱(量)取主成分對照品和雜質(zhì)對照品各適量,分別配制成不同濃度的溶液,進(jìn)樣,記錄色譜圖,繪制主成分濃度和雜質(zhì)濃度對其峰面積的回歸曲線,以主成分回歸直線斜率與雜質(zhì)回歸直線斜率的比計算校正因子。校正因子可直接載入各品種項下,用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。需作校正計算的雜質(zhì),通常以主成分為參比,采用相對保留時間定位,其數(shù)值一并載入各品種項下。測定雜質(zhì)含量時,按各品種項下規(guī)定的雜
14、質(zhì)限度, 將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤?,作為對照溶液;進(jìn)樣,記錄色譜圖, 必要時,調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍(以噪聲水平可接受為限)使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量 程的10%25%。除另有規(guī)定外,通常含量低于0.5%的雜質(zhì),峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)小于10%; 含量在0.5%2%的雜質(zhì),峰面積的RSD應(yīng)小于5%; 含量大于2%的雜質(zhì),峰面積的RSD應(yīng)小于2%。然后,取供試品溶液和對照品溶液適量,分別進(jìn)樣,除另有規(guī)定外,供試品溶液的記錄時間,應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍,測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積,分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較,計算各雜質(zhì)含量。(4) 不加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質(zhì)含量時,若無法獲得待測物質(zhì)的校正因子,或校正因子可以忽略, 也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述(3)法配制對照溶液、進(jìn)樣調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍和計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差
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