殼聚糖對白血病細胞糖基轉(zhuǎn)移酶表達的影響及對細胞的抑制作用

1、殼聚糖對白血病細胞糖基轉(zhuǎn)移酶表達的影響及對細胞的抑制作用【摘要】 目的： 觀察殼聚糖對白血病細胞（K562,SHI1）的作用。方法： 以不同濃度的殼聚糖處理白血病細胞K562后，運用RTPCR方法檢測實驗組K562細胞中多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2（ppGalNAcT2）mRNA表達差異。另用不同濃度的殼聚糖分別作用于白血病K562細胞和SHI1細胞，MTT法檢測殼聚糖對兩種細胞的相對抑制率。結(jié)果： 與陰性對照組比較，實驗組K562細胞的ppGalNAcT2表達降低，且隨殼聚糖濃度升高，表達量進一步減少；MTT實驗顯示不同濃度的殼聚糖對K562細胞和SHI1細胞均有抑制作用，并呈濃度依賴性。

2、結(jié)論： 殼聚糖對腫瘤細胞有一定的抑制作用，同時還可以減少ppGalNAcT2在mRNA水平的表達。 【關(guān)鍵詞】 多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2； 殼聚糖； RTPCR； 白血病細胞Abstract Objective: To observe the effect of chitosan on leukemia cells(K562,SHI1).Methods： The leukemia cells were treated by different concentration of chitosan. The expression of ppGalNAcT2 on K562 cells wer

3、e determined by RTPCR method. The leukemia cells were treated by different concentration of chitosan， and the relative inhibition rate was determined by MTT assay. Results： With adding the chitosan to compare with the negative group, the expression of ppGalNAcT2 in the experimental group K562 cells

4、reduced, and had the inverse ratio with the chitosans concentration. In the MTT assay, the chitosan with various concentrations had the inhibitory action on the K562 cells and the SHI1 cells. Conclusion： The chitosan suppressed the K562 cells and the SHI1 cells multiplication, and its action advance

5、d along with the concentration. Chitosan influenced the expression of ppGalNAcT2 in leukemia cell K562 reduced its expression quantity.Key words ppGalNAcT2; chitosan; RTPCR; leukaemia cell殼聚糖化學名：（1，4）N乙酰D葡萄糖胺是甲殼素（chitin）經(jīng)脫乙?；玫降漠a(chǎn)物，又名甲殼胺、脫乙酰殼多糖等，是天然多糖中唯一的堿性多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在體內(nèi)能被溶菌酶等降解，降解產(chǎn)物能完全被人體吸

6、收，無毒副作用1。近年研究表明殼聚糖及其衍生物有抗腫瘤和增強機體免疫功能作用。杜昱光等2發(fā)現(xiàn)殼寡糖在體外可抑制肝癌、宮頸癌、白血病和S180腹水癌等多種癌細胞的生長，并抑制腫瘤細胞的DNA合成，在體內(nèi)殼寡糖可抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，并延長其生存期。本實驗以慢性髓源性白血病細胞K562的多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2（ploypeptide：Nacetylgalactosaminyltransferase2，ppGalNAcT2）作為研究對象，對不同濃度殼聚糖作用48 h后的白血病細胞ppGalNAcT2的mRNA表達變化進行探索，同時利用MTT法檢測殼聚糖對K562和急性單核細胞白血病細胞SH

7、I1的相對抑制率，為殼聚糖作為抗腫瘤輔助藥物提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 材 料 殼聚糖膠囊由中科院大連化學物理研究所饋贈，RPMI1640培養(yǎng)基為美國Gibco產(chǎn)品，Taq DNA聚合酶,dNTP MIX為MBI公司產(chǎn)品，MTT購自Sigma公司，PCR儀為美國MJ產(chǎn)品，酶聯(lián)免疫檢測儀為BioTek產(chǎn)品。1.2 殼聚糖的配制 從殼聚糖膠囊中獲得殼聚糖，用無血清培養(yǎng)基配成相應(yīng)濃度。1.3 細胞的培養(yǎng)與處理 白血病細胞SHI1由蘇州大學附屬第一人民醫(yī)院血液研究所提供，K562細胞由本教研室復蘇后常規(guī)培養(yǎng)（37,5% CO2)。細胞生長至對數(shù)生長期，分為4組，使殼聚糖濃度分別為0，50，100，

8、200 g/ml。常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細胞。 1.4 總RNA的制備與鑒定 細胞總RNA的提取采用 Trizol一步法3。用752紫外分光光度計分別于260 nm和280 nm處測量D值。以D（260 nm)與D(280 nm)的比值確定RNA的純度，以D(260 nm)值確定RNA的量并稀釋到終濃度為1 g/ml。 1 l樣品RNA含量=D(260 nm)×40 g/ml×稀釋倍數(shù)1.5 RTPCR反應(yīng)（兩步法）檢測ppGalNAcT2表達1.5.1 反轉(zhuǎn)錄cDNA反應(yīng)體系 六堿基隨機引物 1 l；ddH2O（DEPC處理）12 l；25×10 min預熱；細

9、胞株RNA（1 g/ml） 5 l；dNTP MIX 1 l；上下顛倒混勻并離心，65×5 min；迅速置于冰上至少1 min，再加入5×firstband 緩沖液 5 l；反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/l）1 l；上下顛倒混勻并離心，42×50 min，70×20 min，37×20 min后進行PCR反應(yīng)。1.5.2 擴增PCR反應(yīng)體系 10×PCR 緩沖液5 l；MgCl2(25 mmol/L) 3 l；dNTPs(10 mmol/L)1 l；Taq E(5 U/l) 0.3 l；引物（各10 pmol/l）1+1 l；上述反轉(zhuǎn)錄生成的

10、cDNA 2 l；無RNase ddH2O 36.7 l；反應(yīng)條件： 94預變性 5 min，94 變性 45 s，55 退火 50 s，72 延伸1 min。35個循環(huán),72 再延伸 7 min。1.6 1.5%瓊脂糖凝膠電泳 RTPCR擴增產(chǎn)物20 l與上樣緩沖液4 l混合上樣，與pUC MIX DNA 標準參照物一起在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離。在1×TAE電泳緩沖液中100 V恒電壓電泳45 min，溴化乙啶（EB）染色，UVP圖像分析儀攝像并分析結(jié)果。1.7 MTT比色法 實驗在96孔塑料培養(yǎng)板中進行，K562細胞和SHI1細胞以濃度為1×105/ml鋪板。陰性

11、對照組以培養(yǎng)基代替藥物；實驗組藥物終濃度為50，100，200，400，800 g/ml。每組設(shè)3個復孔，設(shè)3個空白調(diào)零孔。常規(guī)培養(yǎng)，于44 h加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入SDS/HCl終止反應(yīng)，并于37放置約4 h，使結(jié)晶溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm波長處測光密度，計算3個孔D的平均值，按下式計算不同濃度殼聚糖對細胞的抑制率。相對抑制率=陰性對照組D值-實驗組D值陰性對照組D值×100%2 結(jié)果2.1 殼聚糖對K562細胞中ppGalNAcT2表達的影響 從條帶的亮度可以看出，陰性對照組的ppGalNAcT2表達量最高，加入殼聚糖后表達降低，且隨藥物濃度增加，表達逐步減

12、弱（圖1）。軟件計算ppGalNAcT2與內(nèi)參actin條帶亮度的相對值，得到ppGalNAcT2的相對表達柱形圖，隨著殼聚糖濃度的升高，ppGalNAcT2的表達量明顯下降（圖2）。 14：殼聚糖濃度依次為0，50，100和200 g/ml；M：標準參照物圖1 K562細胞ppGalNAcT2的表達（略）Fig 1 Expression of ppGalNAcT2 on K5622.2 殼聚糖對K562細胞增殖的相對抑制率 殼聚糖在體外能抑制K562細胞的生長。低濃度殼聚糖對細胞的抑制作用不明顯，低于200 g/ml濃度時其對細胞的抑制率小于10%，但隨著殼聚糖濃度的升高，細胞的生長抑制率迅

13、速升高，當殼聚糖濃度為800 g/ml時有多數(shù)細胞生長明顯受到抑制，抑制率達60.57%（圖3）。 14：殼聚糖濃度依次為0,50,100和200 g/ml圖2 K562細胞T2的相對表達（略）Fig 2 Relative expression of ppGalNAcT2 on K562圖3 殼聚糖對K562細胞的抑制作用（略）Fig 3 Inhibition effect of chitosan on K5622.3 殼聚糖對SHI1細胞增殖的相對抑制率 殼聚糖在體外同樣能抑制SHI1細胞的生長。低濃度殼聚糖對細胞生長抑制作用不明顯，但隨濃度升高抑制率迅速升高。濃度在200 g/ml時，抑制

14、率為10.75%，而當濃度達800 g/ml時抑制率為41.81%（圖4）。相對于K562細胞，殼聚糖對SHI1細胞的抑制作用較弱。 圖4 殼聚糖對SHI1細胞的抑制作用（略）Fig 4 Inhibition effect of chitosan on SHI13 討論 腫瘤細胞中的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)異常與腫瘤的生物學行為，如惡性轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移和浸潤等密切相關(guān)，而糖鏈結(jié)構(gòu)異常的基礎(chǔ)是糖基轉(zhuǎn)移酶的變化4。因此，研究腫瘤細胞的糖基轉(zhuǎn)移酶表達差異，有助于了解腫瘤的生物學行為機制。通過研究浸潤性不同的白血病細胞株的糖基轉(zhuǎn)移酶表達差異，有助于揭示糖基轉(zhuǎn)移酶與白血病細胞株浸潤能力的關(guān)系，從而為從糖生物學角度治療白

15、血病提供思路。 白血病是一種造血組織的惡性疾病，俗稱“血癌”，是某一類型的白血病細胞在骨髓或其他造血組織中的腫瘤性增生，可浸潤體內(nèi)各器官、組織，使各個臟器的功能受損，產(chǎn)生相應(yīng)的癥狀和體征。糖基化是真核細胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾方式中的一種。這些糖蛋白與一系列的生物學功能有著廣泛的聯(lián)系，如細胞間的黏附，自我與非自我的識別，分子運輸與清除，受體激活，細胞的內(nèi)吞作用等。某些糖基轉(zhuǎn)移酶活性升高或降低,就會產(chǎn)生癌變，故一些糖基轉(zhuǎn)移酶活性被視為癌變的重要標志。本實驗用RTPCR方法檢測殼聚糖作用于K562細胞后ppGalNAcT2的mRNA表達變化，ppGalNAcT2在未處理組K562細胞中表達較高，隨著加入

16、殼聚糖濃度的提高，表達量逐漸降低。結(jié)果表明殼聚糖可抑制白血病細胞K562的ppGalNAcT2表達。 甲殼素作為一種天然的堿性多糖，具有抗癌作用。實驗證明，特別是甲殼素六聚糖具有很強的抑制腫瘤作用，它通過增強機體非特異性免疫對腫瘤有抑制作用，其機制是促進巨噬細胞活性，作用途徑是影響非殺傷性細胞（NK）活性IL2的分泌6。本實驗采用MTT法，用不同濃度殼聚糖作用于白血病細胞K562，SHI1，于48 h后檢測D值，發(fā)現(xiàn)隨殼聚糖濃度升高，其對細胞的抑制率逐漸增加。但在低濃度時有波動，可能由于實驗是微量操作，細胞濃度和加樣量的極微差異都會導致實驗結(jié)果的波動。實驗結(jié)果顯示殼聚糖對細胞有抑制作用，但對低

17、濃度殼聚糖的抑制作用，還需調(diào)整實驗中多糖濃度進一步研究。 通過本次實驗發(fā)現(xiàn)殼聚糖對白血病細胞K562和SHI1都有抑制作用，其機制可能是帶陽離子的殼聚糖，直接作用于帶負電荷比正常細胞多的腫瘤細胞，從而抑制了實驗中兩種細胞的生長。但也不排除其他的可能。近年來,研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡的異常在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,許多抗腫瘤藥物都是通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮其作用。新近研究表明殼聚糖也具有誘導細胞凋亡的作用，Hasegawa等7研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖可誘導膀胱癌細胞凋亡,從而抑制其增殖。腫瘤細胞的凋亡受許多因素的影響,其中癌基因、抑癌基因、細胞因子在其中起著重要作用。因此,誘導腫瘤細胞凋亡也可能是殼聚糖抑制

18、腫瘤細胞生長的重要機制。 多肽：N乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(ppGalNAcT)催化O聚糖合成的第一步反應(yīng)，將UDPGalNAc上的GalNAc基團轉(zhuǎn)移至蛋白多肽鏈上特定序列中的Thr或Ser從而合成GalNAcOSer/Thr。ppGalNAcT及其家族作為黏蛋白O糖基化的起始酶，在一些蛋白質(zhì)上，OGlcNAc和O磷酸化相互競爭同一或鄰近的位點8，可能與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，細胞的信號傳導等密切相關(guān)。腫瘤細胞表面可有類似黏蛋白的糖蛋白，含有豐富的O糖基化結(jié)構(gòu)域，在腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤生長過程中黏蛋白起著重要的作用，ppGalNAcT可能通過各種途徑調(diào)節(jié)細胞的生長及浸潤轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作

19、用。通過本次實驗結(jié)果，初步推測殼聚糖降低白血病細胞K562的糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAcT2的表達，同時ppGalNAcT2的表達降低可能影響K562細胞的生長與轉(zhuǎn)移浸潤，使細胞的生長受到抑制，正如MTT試驗結(jié)果顯示，加入殼聚糖后細胞生長受到不同程度的抑制。但白血病細胞K562的糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAcT2表達的降低與細胞增殖受到抑制，這兩者之間是否存在某種聯(lián)系，還需進一步實驗研究探討?！緟⒖嘉墨I】 1 Angnihotri SA,Mallikarjuna NN,Aminabhavi TM. Recent advances on chitosanbased micro and nanoparticles in drug delivery J. J Control Re1ease,2004, 100(1) : 5-28.2 杜昱光, 白雪芳, 金宗濂, 等. 殼寡糖抑制腫瘤作用的研究J. 中國海洋藥物, 2002, 21(2) : 18-21.3 仇 灝