PCR異常擴(kuò)增曲線分析

1、PC厝常擴(kuò)增曲線分析1 .PCR正常擴(kuò)增曲線隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，相應(yīng)的熒光信號(hào)也不斷在增加，每進(jìn)行一個(gè)循環(huán)就采集一次熒光的信號(hào)，經(jīng)過一定的循環(huán)數(shù)后（比如40個(gè)循環(huán)），就可以得到下面的擴(kuò)增曲線圖（橫坐標(biāo)代表擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)cycle,縱坐標(biāo)代表熒光的強(qiáng)度）。這其中還需要弄清楚一些基本概念，如:基線：指在PCFT增反應(yīng)的最初的幾個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大。接近一條直線，該直線叫做基線。這個(gè)了解即可，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作沒什么影響。閾值線：一般來說，前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，閾值的設(shè)定就是3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，在PCFT增的指數(shù)期（如圖中箭頭所指）說的這么嚴(yán)肅，其實(shí)很多

2、儀器自動(dòng)設(shè)定的閾值線基本能夠滿足我們的實(shí)驗(yàn)要求,不需要我們手動(dòng)設(shè)置的。CT值：我們常會(huì)用CT值來計(jì)算我們的相對(duì)含量，即擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值線時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)，也就是圖中擴(kuò)增曲線和閾值線的交匯處的橫坐標(biāo)所顯示的值。2 .標(biāo)準(zhǔn)曲線做標(biāo)準(zhǔn)曲線有啥用？標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來確定未知的樣品的初始量。如果是需要絕對(duì)定量，是必須要有標(biāo)準(zhǔn)曲線的。怎么做呢？每個(gè)模板的CT值與該模板的起始的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)是存在線性關(guān)系的，起始的拷貝數(shù)越大，CT值就越小。標(biāo)準(zhǔn)品按照一定的倍數(shù)稀釋5-6個(gè)濃度左右，根據(jù)RT-PCR勺反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)，繪制線性曲線。而未知樣品的

3、拷貝數(shù)即可根據(jù)曲線方程計(jì)算得來。那么，問題來了，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品怎么確定呢？(1)如果是做絕對(duì)定量，標(biāo)準(zhǔn)品的要求比較高，這個(gè)的制備過程也相對(duì)復(fù)雜一些，但結(jié)果也更加精確。要求：必須是準(zhǔn)確定量的、標(biāo)準(zhǔn)化的、穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA(也可以是基因組DNA純化后的PCFT物等)，5-6個(gè)稀釋梯度；PCRE應(yīng)儀器要同一種，并且同時(shí)操作；反應(yīng)的條件一致：反應(yīng)體系、參數(shù)等等；反正能一致的都一致就對(duì)了(2)如果只是想看看擴(kuò)增效率(E)(E=10-1/斜率)，檢驗(yàn)PCR的反應(yīng)體系是否符合要求，我們有時(shí)候也采用待測(cè)試樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，逐步稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，最終看標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和R2是否符合要求，我比較懶，常會(huì)用這種方法，

4、不過有些發(fā)文章的要求會(huì)比較高，那還是要乖乖去做的。3.溶解曲線簡單點(diǎn)說，就是考察染料標(biāo)記法結(jié)果的特異性的。再簡單點(diǎn)，就是分分鐘確定你的引物是否有效。復(fù)雜的原理我就不解釋了，關(guān)鍵是怎么看和怎么判斷。如果反應(yīng)產(chǎn)物單一，曲線會(huì)出現(xiàn)一個(gè)尖峰；如果有二聚體或者非特異性的擴(kuò)增，就會(huì)出現(xiàn)至少兩個(gè)峰或者更糟糕。采用SYBRGree磔料時(shí)是必須要做溶解曲線的，畢竟這是一個(gè)非特異性的染料。50505K-22110CH二出odan一占MeltCurveTemperature()在實(shí)驗(yàn)中，大家還是會(huì)碰到很多問題的，下面列舉幾個(gè)比較常見的問題：(1)擴(kuò)增曲線經(jīng)過40個(gè)循環(huán)后沒有平臺(tái)期？或者擴(kuò)增曲線根本無法呈現(xiàn)指數(shù)上升？

5、這種情況下很有可能是你的起始模板濃度太低了，即便經(jīng)過40個(gè)循環(huán)也是達(dá)不到平臺(tái)期的，可以通過增加循環(huán)數(shù)來驗(yàn)證是否是該問題。(2)溶解曲線的問題：比如多個(gè)峰，或者尖峰的前面有個(gè)小小的小峰，或者沒有峰？這個(gè)跟引物以及反應(yīng)的體系溫度有關(guān)系，如果說沒有峰值或者雜亂無章，很有可能是引物的問題，建議重新設(shè)計(jì)引物。有時(shí)候有小的峰，可以通過優(yōu)化反應(yīng)條件，比如退火溫度的優(yōu)化來消除這個(gè)影響。常見異常曲線分析：1確認(rèn)軟件設(shè)置是否正確對(duì)照試劑盒說明書，檢查時(shí)間、溫度、循環(huán)數(shù)、熒光采集等是否設(shè)置正確。有一個(gè)比較容易忽略的設(shè)置問題是，需要看下所選用的試劑中是否含有ROXH乍為參比熒光染料。2確定耗材及儀器配件是否使用正確耗

6、材對(duì)于熒光定量PC林說比較重要，很多異常的擴(kuò)增曲線是由于耗材使用不當(dāng)引起的。常見的耗材相關(guān)問題包括：1）錯(cuò)誤使用成普通PCFa器所對(duì)應(yīng)的耗材普通PCRffi材一般透光度比較差，會(huì)造成熒光擴(kuò)增曲線異常，比如打折的擴(kuò)增曲線（圖三）。A0Ef圖三：錯(cuò)誤使用普通PCRft材的結(jié)果2）未選擇跟儀器加熱模塊規(guī)格匹配的耗材熒光定量PCR儀加熱模塊分0.2ml跟0.1ml兩種，如果0.1ml加熱模塊用成0.2ml耗材，則會(huì)造成耗材壓扁，甚至造成機(jī)器故障；如果0.2ml加熱模塊用成0.1ml耗材，則會(huì)造成反應(yīng)管的外壁和熒光定量PCFa器的溫控模塊沒有充分接觸，從而出現(xiàn)熱傳導(dǎo)不充分，進(jìn)而影響酶的活性，會(huì)引起重復(fù)性

7、不好（圖四），或者溶解曲線多峰（非特異擴(kuò)增），甚至是假陰性結(jié)果；圖四：耗材規(guī)格跟加熱模塊不匹配造成重復(fù)孔間差異3）使用了質(zhì)量比較差的耗材目前市面上熒光定量PCRft材種類繁多，質(zhì)量也是良莠不齊，在耗材選擇上盡量選擇質(zhì)量、品牌好一點(diǎn)的，否則會(huì)引起一系列問題，造成不必要的浪費(fèi)。比如質(zhì)量不好的耗材可能會(huì)引起熒光值不穩(wěn)定，這會(huì)造成反應(yīng)孔的自動(dòng)基線扣除錯(cuò)誤，得到不準(zhǔn)確的CT值（圖五左圖），更換質(zhì)量好的耗材后，熒光信號(hào)正常（圖五右圖）；MulticomponentPlot，心儂口加儂2.ia>j930IWO030L了MgLWQ.mDI500i-wojoaot.30).030t-200.000cjDo

8、.mol.OOQi.CWWOJ9W=必FOODJO«OJ5»»OJ3M3i400.000M».cmSM.tmTMM圖五：質(zhì)量不好的耗材引起熒光值不穩(wěn)定圖（上）如果使用的PCR5應(yīng)板封膜質(zhì)量不好，在PCRS程中受到水蒸氣的影響，容易產(chǎn)生變形（圖六），這樣會(huì)引起“opticalwarping”，即“光學(xué)扭曲”現(xiàn)象（圖七左圖），該實(shí)驗(yàn)中由于使用了ROX作為參比染料，ROX有效的校正了這種熒光信號(hào)的變化，均一化的擴(kuò)增圖結(jié)果是正常的。圖六：PCRS程中水蒸氣使得封膜變形2»J3OOMultjcornponentPlot打OgOms1»J

9、1;30mj3ooIEJ000mjooo1»jW"EO1MJMG12DXMX1WXVOO1CDpmsoqoaBonooTDJCim60,000WJOOOOJOOOAmplificationPlot圖七：光學(xué)扭曲結(jié)果圖及ROX勻一化結(jié)果圖除了耗材外，跟儀器配套使用的配件也要檢查是否使用正確，比如配套的8聯(lián)管托架，在使用的時(shí)候只用托架的下半部分，如果忘記把上半部分取下，有可能會(huì)影響擴(kuò)增（圖八）o)DOO)DOOMulticomponentPlot550,000500,000mOOjOdO工2OO,DCIO150.000100.00050.000£3W.W0X3M.OO

10、Oo20OJOOO圖八：未將托架上半部分取下，造成有些靶標(biāo)未擴(kuò)增3確定所用試劑是否正常如果設(shè)置都正確，耗材及配件也都沒問題，但是擴(kuò)增曲線還是異常，這時(shí)候要確定下所用試劑是否正常。首先要確定試劑是否有效，包括查看試劑是否在有效期內(nèi)，是否反復(fù)凍融多次，運(yùn)輸條件是否正常?？梢酝ㄟ^比較試劑的批次號(hào)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)中的陽性對(duì)照結(jié)果，確定試劑的有效性。其次要觀察擴(kuò)增完的試劑體積，如果在擴(kuò)增過程中有試劑的蒸發(fā)，可能會(huì)引起擴(kuò)增曲線抬升現(xiàn)象，如果實(shí)驗(yàn)體系中加入了ROX乍為參比熒光,RO歡光可以區(qū)分?jǐn)U增曲線抬升是真擴(kuò)增，還是蒸發(fā)。比如反應(yīng)體系存在蒸發(fā)，水分丟失，ROXt度會(huì)增加，RO造比熒光上抬（圖九左圖），而正?？字?/p>

11、RO觀光會(huì)一直不變（圖九右圖），所以在加完試劑上機(jī)前，一定要檢查耗材是否已經(jīng)密封，防止試劑蒸發(fā)，試劑蒸發(fā)嚴(yán)重的還可能導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)室的氣溶膠污染。,MulticomponentPlotMulticomponentPlot西Mid加總MM*A0111M*m到crcntJ400000MiiItirfihipniif>i11Plot圖九：試劑蒸發(fā)引起擴(kuò)增曲線抬升4確定實(shí)驗(yàn)過程中的操作細(xì)節(jié)如果以上都正常，還要確定下實(shí)驗(yàn)過程中的操作細(xì)節(jié)。比如在做標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候是否是梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，如果不是梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，可能會(huì)引起標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率或者R2值異常；從冰箱冷凍中取出的試劑是否有混勻，如果試劑融化后沒有

12、混勻，這時(shí)候取出的試劑不是均一的，會(huì)影響后面的擴(kuò)增；定量PCR®混液跟核酸模板加好后是否混勻，如果沒有混勻，特別是樣本體積比較大的時(shí)候（超過PC神系的20%,更容易發(fā)生opticalmixing現(xiàn)象。因?yàn)闃颖臼撬鄷?huì)在上層，試劑（含有甘油成分）會(huì)在下層，在前期的PCFH程中不足以混勻完全，這樣會(huì)形成折射，熒光較強(qiáng)，而一般加熱幾個(gè)循環(huán)后樣本跟預(yù)混液會(huì)混勻，熒光就變穩(wěn)定了（圖十）。圖十：樣本跟預(yù)混液未混勻現(xiàn)象還有上機(jī)的反應(yīng)體系里盡量不要有大的氣泡，有氣泡的話，中間容易形成折射，干擾熒光的采集（圖十一）。所以實(shí)時(shí)熒光定量PC也驗(yàn)的細(xì)節(jié)還是要特別注意的。MulticomponcntPlot巴

13、仁事：軸6=:5匚?,7O0OOO2.WQOOQJ.MJUW'工numjmm打gg?.ooo(m1SODODO13網(wǎng)1.7W.OOO1.300000I.fOCHH1.loomi.OOOOK)W»(KHsooooa(x»0圖H一:反應(yīng)體系中有氣泡其他異常曲線，實(shí)戰(zhàn)分析：異常曲線1：PCFT增抑制&FAM&FAM原因分析：H07存在擴(kuò)增抑制解決方案：將樣本稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增（抑制物的影響可通過稀釋樣本消除）原因分析：自動(dòng)基線問題解決方案:手動(dòng)設(shè)置基線。將BaselineEnd設(shè)置為“擴(kuò)增信號(hào)出現(xiàn)的前一個(gè)循環(huán)”即，圖片展原始為26,將其設(shè)置為20,點(diǎn)擊OK即可

14、恢復(fù)正常曲線。異常曲線3:熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果中無Ct值出現(xiàn)異常曲線2:自動(dòng)基線設(shè)置問題AmplificaCFcnA。淚褥底線設(shè)置有何震Cycles擴(kuò)增曲線原始曲線25202422108319CH43159202128262097321066381035440004500-0264411359111315裁21232527293133353739Q一一一一原因分析:(1)PC諂數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤：在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)沒有設(shè)置熒光信號(hào)采集;(2)模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況；(3)引物或者探針降解：可通過PAGEfe泳檢測(cè)其完整性；(4)電腦設(shè)置了自動(dòng)休眠。解決方案：按照原因分析進(jìn)行

15、一一核查，對(duì)癥處理。異常曲線4:斜直線型擴(kuò)增曲線13M(omn63PCRK驗(yàn)結(jié)果中有曲線出現(xiàn)末尾起跳但是沒有完整擴(kuò)增的現(xiàn)象PCRK驗(yàn)首次檢測(cè)呈斜直線型擴(kuò)增曲線，再次復(fù)檢后結(jié)果基本均為正常陰性。原因分析:分液不準(zhǔn)確，檢查檢測(cè)后的反應(yīng)管可發(fā)現(xiàn)管內(nèi)的PCRK應(yīng)液量明顯少于正常管;反應(yīng)管氣密性差，反應(yīng)過程中溶液蒸發(fā)引起探針濃度增加，導(dǎo)致曲線呈斜直線狀,解決方案:分液均勻，上機(jī)前檢查八連管液面是否在同一水平線上；八連管蓋蓋嚴(yán)，上機(jī)前檢查是否有縫隙異常曲線5:擴(kuò)增曲線末尾起跳曲線末尾起跳原因分析：(1)陰參曲線末尾起跳，通常表示存在污染；(2)復(fù)檢樣本，排除非特異性擴(kuò)增的可能性；(3)正常樣本也可存在曲線

16、末尾起跳，表示樣本濃度低或者加樣量不準(zhǔn)確。解決方案：排除是否存在污染；排除污染原因后復(fù)檢樣本，如果復(fù)檢后曲線為陰性直線則說明之前的末尾起跳為非特異性擴(kuò)增，如果復(fù)檢后曲線仍與之前一致則說明末尾起跳表小該樣本中待檢病毒核酸的濃度偏低。異常曲線6:山域型曲線原因分析：嚴(yán)重的蒸發(fā)會(huì)呈現(xiàn)先上升后下降的曲線，輕微的蒸發(fā)會(huì)是一種緩慢的上升，這兩類異常的曲線可以看一下檢測(cè)后的反應(yīng)管液面是否有下降的現(xiàn)象來證明。解決方案：上機(jī)檢測(cè)前檢查八連管管蓋，保證無縫隙后上機(jī)擴(kuò)增。異常曲線7:擴(kuò)增曲線有向上或者向下的尖峰原因分析：(1)儀器不穩(wěn)定導(dǎo)致的擴(kuò)增曲線異常(也可能突然停電或者電壓不穩(wěn))；(2)如果尖峰向下，可能是鹵素?zé)衾匣掳l(fā)射光源不穩(wěn)定(指鹵