NAMPT通過SIRT1ASlncRNAmiR-22SIRT1通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮租細胞的衰老,增殖和遷移

1、NAMPT通過SIRT1ASlncRNA/miR-22/SIRT1通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮租細胞的衰老,增殖和遷移通過大量的文獻報道證實，在心血管疾病中內(nèi)皮祖細胞（EPCs）的重要性。以前的研究表明磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）在通過Sirtuinl（SIRT1）調(diào)節(jié)EPC的發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，但是具體的機制還沒有闡明。在刺激伴有NAMPT的EPCs以后，SIRT1和SIRT1反義長鏈非編碼RNA（ASlncRNA）上調(diào)。將一個SIRT1ASlncRNA過表達載體轉(zhuǎn)染到EPCs中，SIRT1表達上調(diào)。將一個一個小干擾RNA（siRNA）靶向注射到SIRT1ASlncRNA伴隨NAMPT以后，SIRT1AS

2、lncRNA下調(diào)并且NAMPT-誘導SIRT1表達也降低。我們用軟件分析和雙重熒光素酶標記實驗證實，miRNA-22調(diào)節(jié)SIRT1和SIRT1ASlncRNA。我們的數(shù)據(jù)證實SIRT1ASlncRNA通過競爭性吸附miR-22,減輕miR-22誘導的SIRT1下調(diào)。通過測量EPC衰老，增殖和遷移，我們發(fā)現(xiàn)NAMPT通過SIRT1ASlncRNA/miR-22/SIRT1通路抑制內(nèi)皮租細胞的衰老，并促進EPC的增殖和遷移。這些發(fā)現(xiàn)為動脈粥樣硬化和其它心血管疾病患者的預防和治療提供了一個新的理論基礎。這些研究結(jié)果為動脈粥樣硬化（AS）等心血管疾病的防治提供了新的理論依據(jù)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每

3、年有1670萬人死于心血管疾病，占全因死亡率的50%以上。AS的發(fā)病機制是復雜的，但由于引發(fā)事件，包括血管內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮功能及局部微血管系統(tǒng)的再生修復為AS的預防和治療等提供新的治療策略。最近的研究表明，內(nèi)皮祖細胞（EPCs）可以分化為血管內(nèi)皮細胞，促進血管生成，并是AS為發(fā)病機制提供重要的作用。喬治等人發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E（apoE）基因敲除小鼠內(nèi)皮祖細胞減少，血管修復能力下降。止匕外，有研究表明，煙酰胺轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶（NAMPT）作用于血管內(nèi)皮細胞，這表明NAMPT可能在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。在血管內(nèi)皮細胞，NAMPT被證明能顯著上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，促進血管內(nèi)皮

4、細胞。止匕外，對人臍靜脈血EPCs中，降低伊半乳糖甘酶的活性，增加端粒酶NAMPT活動，從而促進血管生成的。因此，我們推測，通過抑制NAMPT的形成影響EPC衰老。在哺乳動物中，NAMPT的限速酶的煙酰胺腺喋吟二核甘酸（NAD）生物合成途徑將煙酰胺煙酰胺單核甘酸。范等人發(fā)現(xiàn)在人血管平滑肌細胞通過激活SIRT1抑制p53的功能，NAMPT增加NAD+水平，從而發(fā)揮抗衰老的作用。最近，高濃度葡萄糖被發(fā)現(xiàn)通過抑制SIRT1的活動表明，SIRT1參與介導的內(nèi)皮祖細胞衰老誘導EPCs的衰老。以前，我們表明在內(nèi)皮祖細胞NAMPT生理濃度（1nm）增強SIRT1的表達，可能抑制EPCs的衰老。以前，我們發(fā)現(xiàn)

5、NAMPT減弱ox-LDL誘導的衰老細胞通過上調(diào)SIRT1的表達是通過PI3K/ERK途徑。此外，研究表明NAMPT調(diào)節(jié)SIRT1通過替代途徑，如通過長鏈非編碼RNA（IncRNA）,這是一個轉(zhuǎn)錄本長度超過200個核甘酸,不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，但可以調(diào)控基因表達，參與細胞增殖、分化、凋亡、和其他生理過程。止匕外，lncRNAs已發(fā)現(xiàn)與各種病理疾病過程相關(guān)。最近，lncRNA被證明影響心臟和血管的生長和分化，并與動脈粥樣硬化性心臟病和心力衰竭有關(guān)。SIRT1lncRNA是天然反義轉(zhuǎn)錄（NAT）SIRT1，并且SIRT1lncRNA的表達增加SIRT1蛋白水平，而過表達SIRT1作為一個lnc

6、RNA突變不影響C2C12細胞SIRT1蛋白水平。止匕外，通過microRNA下調(diào)SIRT1（MIR）-34a消除SIRT1在C2C12細胞lncRNA的作用。在這項研究中，在EPCs中，我們探討是否NAMPT調(diào)節(jié)SIRT1通過SIRT1lncRNA,并且我們探討NAMPT對SIRT1在AS中的具體機制。2.1 細胞培養(yǎng)小鼠內(nèi)皮祖細胞（原始細胞，中國）進行培養(yǎng)（Gibco、卡爾斯巴德、CA、美國）含10%胎牛血清（FBS、Gibco）。NAMPT（小鼠重組；米爾皮塔斯、CA、美國生物、）是添加到濃度為1nM,如果需要的話。2.2 載體重構(gòu)和轉(zhuǎn)染SIRT1ASlncRNA通過PCR擴增。正向引物

7、5-CGGGGTACCTATGCTAGAACAATGAAG-3（KpnI位點，下戈U線）和反向引物5-CCGGCTCGAGTTGCCTGCCTGTTGAGGA-3（XhoI酶切位點，下劃線）。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆入pcDNA3.1（Invitrogen公司，美國），經(jīng)測序和克隆。pcDNA3.1-SIRT1為lncRNA的質(zhì)粒進行PCR突變產(chǎn)生的突變體，和八個突變位點均在miR-22結(jié)合位點。SIRT1的lncRNA的siRNA,miR-22的模仿和抑制劑均購自Ambion（中國）。細胞接種于六孔板中，1x105細胞/毫升，與脂質(zhì)體2000孵育24h后轉(zhuǎn)染時進行細胞融合達70%（Invitroge

8、n）根據(jù)制造商的指示。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，miRNA,siRNA濃度為4聞/ml,50nM/孔，50nM/孔。轉(zhuǎn)染后，EPCs收集和進行進一步的分析?？俁NA,用Trizol試劑分離的細胞（液氮）根據(jù)制造商的指示。然后，1微克總RNA的制備與第一鏈cDNA合成試劑盒（Fermentas,德國）。引物是SIRT1的IncRNA基因特異性引物（向前：5-AATCCAGTCATTAAACGGTCTACAA-3;反:5-TAGGACCATTACTGCCAGAGGA-3）和SIRT1基因特異性引物（向前：5-TTGGCACCGATCCTCGAAC-3;反：5-CCCAGCTCCAGTCCAGTCAGAACTAT-

9、3）。GAPDH作為內(nèi)對照。實時熒光定量PCR是在ABIPRISM7500序列檢測系統(tǒng)進行（美國）與SYBRGreen一起（TaKaRa,中國）。比較循環(huán)閾值（CT）法用于定量。2.4 免疫印跡分析全細胞提取物用細胞裂解試劑制備（西格瑪，穆村，美國）根據(jù)制造商的說明。采用BCA法測定蛋白濃度定量（皮爾斯，羅克福德，IL,美國），和蛋白質(zhì)樣品進行10%SDS-PAGE和WesternBlot檢測使用SIRT1,半乳糖甘酶，和GAPDH抗體（CST,美國）。檢測與羊抗兔IgG抗體進行標記辣根過氧化物酶（皮爾斯）和電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)（supersignal西微微；Pierce）。2.5 雙重熒光素酶

10、實驗全長SIRT13UTR和SIRT1ASlncRNA的擴增并克隆至UpsiCHECK-2載體上（Promega）。在提供結(jié)合位點突變體用QuikChange定點誘變試劑盒II（Stratagene公司創(chuàng)建的，CA,美國）。載體和miR-22模擬轉(zhuǎn)染熒光素酶活性，并用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測（Promega）按照制造商的指示。實驗是在三個獨立的實驗重復進行。2.6 端粒酶活性的測定端粒酶活性的基因檢測采用端粒重復序列擴增協(xié)議（TRAP）測定（羅氏應用科學，印第安納波利斯，美國）按照制造商的指示。簡而言之，2x105內(nèi)皮祖細胞進行裂解，裂解試劑200毫升，和細胞裂解液離心16000轉(zhuǎn)20分鐘4C。

11、0.5微克的細胞提取液作為PCR反應的模板（50微升）。擴增產(chǎn)物（2.5用于雜交和ELISA檢測。端粒酶活性被描述為相對端粒酶活性（RTA）。每組均含有陰性和陽性對照。端粒酶活性計算對EPCs相對于RTA陽性對照細胞的占比。細胞增殖在DNA合成期間，在96孔板中采用BrdU摻入測量比色法檢測細胞增殖（BrdUELISA試劑盒，羅氏，德國）。轉(zhuǎn)染48h和孵育后，媒體被細胞BrdU標記（10mM5-bromo-2-脫氧尿喀噬核音）3h,在37C孵育。細胞固定和過氧化物酶標記的抗BrdU抗體在室溫下90分鐘。然后，過氧化物酶底物（3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺）加入，和BrdU摻入定量的差異，在波長3

12、70nm吸光度減去492。細胞增殖率為對照值的平均百分比（100%）。2.8 細胞遷移率實驗細胞遷移率（BDBiosciences公司,CA,美國）用侵襲小室，在DMEM中培養(yǎng)液（0.6毫升）被添加到下室。細胞被稀釋到2x106細胞/毫升，在無血清的DMEM中，并100川的細胞中加入上室和5%CO2氣氛中孵育37C6小時，4%戊二醛15分鐘加入修復細胞插入濾波器的下側(cè)。此外，用棉簽去除濾膜上部剩余的細胞。用0.1%的結(jié)晶紫染色10分鐘，用PBS清洗，顯微鏡下計數(shù)。2.9 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行（芝加哥、IL、美國）。兩組之間的差異采用雙尾t檢驗，三組或更多組之間

13、的差異采用單因素方差分析、多重比較分析。p0.05（*）被認為具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果3.1. NAMPT上調(diào)SIRT1ASlncRNA的表達,在EPCs中SIRT1的表達我們先前表明NAMPT上調(diào)SIRT1的表達。對SIRT1ASlncRNA的發(fā)現(xiàn)，我們表明，NAMPT劑量依賴性上調(diào)SIRT1ASlncRNA表達（圖1A）。因止匕，我們推測，在EPCs,同時上調(diào)SIRT1ASlncRNA和SIRT1的表達，提示SIRT1ASlncRNA可能誘導SIRT1NAMPT激活機制中發(fā)揮作用。因為NATs一般調(diào)節(jié)基因表達，我們探討是否NAMPT調(diào)節(jié)SIRT1通過SIRT1ASlncRNA。SIRT1ASl

14、ncRNA表達載體在EPCs中，SIRT1表達增加（圖1B、C、D）。EPCs中當siRNA靶向轉(zhuǎn)染SIRT1ASlncRNA隨著NAMPT，結(jié)果表明下調(diào)SIRT1ASlncRNA的表達能削弱NAMPT對SIRT1表達的促進作用（圖1B、C、D）。這些結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)SIRT1的表達通過lncRNAASSIRT1的表達。3.2. NAMPT調(diào)節(jié)SIRT1通過SIRT1ASlncRNA/miR-22通路IncRNA可通過多種機制發(fā)揮作用調(diào)節(jié)SIRT1的表達，它可以與miRNA調(diào)控基因表達的作用。根據(jù)米蘭達和RNAhybrid軟件分析，有提供結(jié)合位點的SIRT1和SIRT1的IncRNA（圖2A

15、,B,C）。在合成miR-22模仿內(nèi)皮祖細胞轉(zhuǎn)染，SIRT1和SIRT1表達的IncRNA被抑制（圖2D）。雙熒光素酶報告基因檢測證實miR-22結(jié)合SIRT1和SIRT1的lncRNA（圖2E）。因此，為lncRNA可能調(diào)節(jié)SIRT1通過miR-22。在共轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞與SIRT1的lncRNA過表達載體和miR-22的模仿，SIRT1表達的抑制是相對于模仿組僅轉(zhuǎn)染miR-22減少。在共轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細胞與SIRT1ASlncRNA-m（miR-22結(jié)合位點突變）表達載體和miR-22模擬結(jié)合，SIRT1表達不能被抑制（圖3A）。此外，miR-22減少NAMPT對于SIRT1表達的作用（圖3A）

16、。隱私，我們的數(shù)據(jù)顯示NAMPT通過SIRT1ASlncRNA/miR-22信號通路調(diào)節(jié)SIRT1的表達。3.3. NAMPT通過SIRT1ASlncRNA/miR-22信號通路調(diào)節(jié)EPC的衰老因為SIRT1與細胞衰老緊密相關(guān)，我們假設NAMPT通過SIRT1ASlncRNA/miR-22信號通路調(diào)節(jié)EPC的衰老?！比樘歉拭傅谋磉_水平升高，被認為是衰老的一個標志。端粒的長度也與衰老相關(guān)，端粒酶維持端麗序列的長度和修復損壞的染色體。因此，細胞衰老的程度可以通過乳糖甘酶和端粒的活性進行評估。我們發(fā)現(xiàn)NAMPT抑制伊gal表達增加端粒酶的活性（圖3B,C）。SIRT1ASlncRNA和NAMPT抑制

17、細胞衰老，而miR-22抑制細胞衰老。另外，miR-22減弱NAMPT和SIRT1ASlncRNA的抗衰老作用，但是SIRT1ASlncRNA不阻礙miR-22的促衰老作用（圖3B,C）。因此，NAMPT通過SIRT1ASlncRNA/miR-22/SIRT1信號通路調(diào)節(jié)EPC的衰老。3.4. NAMPT通過SIRT1ASlncRNA/miR-22/SIRT1信號通路調(diào)節(jié)EPC的增殖和遷移內(nèi)皮祖細胞前體細胞遷移、增殖調(diào)節(jié)EPC的增殖、遷移、分化為血管內(nèi)皮細胞，促進血管內(nèi)皮修復和新生血管形成的。我們發(fā)現(xiàn)NAMPT和SIRT1lncRNA促進EPC的增殖和遷移，而抑制miR-22EPC的增殖和遷移

18、（圖4）。miR-22也減少NAMPT和SIRT1ASlncRNA誘導EPCs的增殖和遷移。對SIRT1結(jié)合位點突變miR-22lncRNA（SIRT1lncrna-m）并沒有阻止抑制miR-22從EPC的增殖和遷移（圖4）。這些數(shù)據(jù)表明，通過SIRT1ASlncRNA/miR-22/SIRT1信號通路調(diào)節(jié)EPC的增殖和遷移。討論AS是多種心血管疾病的病理基礎，從而威脅到數(shù)以百萬計的全球人口健康。在缺血或血管損傷的病例中，在骨髓的EPCs可以遷移至外周循環(huán)和心肌缺血或損傷部位，分化為成熟的內(nèi)皮細胞，促進新生血管形成，從而減輕組織缺血和修復血管損傷。NAMPT表達于心臟、大腦等組織具有多種生物學

19、效應。目前，關(guān)于NAMPT在心血管疾病中的作用缺乏一致的。例如，一些研究表明NAMPT導致內(nèi)皮功能障礙誘導炎癥和粘附分子的表達。然而，一些研究表明，內(nèi)皮細胞中NAMPT過表達提高內(nèi)皮細胞抗衰老等因素引起的氧化應激的能力，如高血糖濃度，最終促進內(nèi)皮細胞的增殖。NAMPT也表明上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達和活性內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）,通過AKT和MAPK信號通路，以及增加NO的生成，從而改善血管內(nèi)皮細胞功能。此外，NAMPT可能施加不同的影響在不同濃度中也不同。然而，迄今為止，只有少數(shù)的研究中關(guān)于NAMPT在EPCs中的作用。的表達在內(nèi)皮祖細胞中表達，并且最近的一項研究表明，SIRT1減緩

20、另外一個最近的研究還表明，SIRT1在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)NAMPT先前的研究表明Nampt促進SIRT1SIRT1的表達在不同的體細胞和生殖細胞中。血管內(nèi)皮細胞衰老，維持血管內(nèi)皮細胞功能。調(diào)節(jié)外周循環(huán)EPCs數(shù)量和減慢EPC衰老上調(diào)SIRT1ASIncRNA的表達，從而調(diào)節(jié)在EPCs中SIRT1的表達。SIRT1IncRNASIRT1NAT是一種IncRNA。最近的數(shù)據(jù)表明IncRNAs參與AS的發(fā)生，心臟衰竭，和許多其他的疾病。例如，LincRNA-P21已經(jīng)顯示出抑制增殖和促進凋亡巨噬細胞保護血管。因此，SIRT1ASlncRNA可能調(diào)節(jié)EPC的發(fā)展。在人類，小鼠，大鼠的表達研究中，有義

21、轉(zhuǎn)錄和NAT之間的關(guān)系是結(jié)果呈正相關(guān)。雖然NAT主要是正調(diào)控感基因的表達，但是調(diào)控的確切機制尚不明確。在目前的研究中，對lncRNA調(diào)控機制的常見方式是miRNA參與的相互作用。我們發(fā)現(xiàn)，SIRT1ASlncRNA緩解mir-22-誘導的抑制SIRT1通過競爭性結(jié)合miR-22。陳等人也證實miR-22的抑制增殖、運動、侵襲和通過直接靶向SIRT1人類膠質(zhì)母細胞瘤細胞進行。止匕外，有研究表明NAMPT下調(diào)mir-22-誘導抑制SIRT1,通過上調(diào)SIRT1ASlncRNA的表達最終促進SIRT1的表達，降彳氐EPC衰老，增強EPC的增殖和遷移。許等人發(fā)現(xiàn)hsa-miR-22通過抑制SIRT1的

22、表達，導致細胞衰老誘導pRb的磷酸化。唐等人發(fā)現(xiàn)MALAT1受ox-LDL誘導的血管內(nèi)皮功能障礙，部分通過競爭內(nèi)源性RNAmiR-22-3p進行。這些研究的結(jié)論表明，IncRNAs和miRNA之間的相互作用在基因表達調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)NAMPT調(diào)節(jié)SIRT1通過SIRT1ASIncRNA/miR-22的途徑。我們的數(shù)據(jù)為AS發(fā)展進一步的探索提供了依據(jù)，特別是機制涉及NAMPT,SIRT1,及相關(guān)IncRNAs的機制。AugsGQJdxB理二BJ一星匚aoJIdF.LIMNFT南1%13SlTTIASIheIHA5HTLoipnraMaiimEFCi.對wetfwilliIb

23、riradiiJlird口EiirrUrHiiMuof柏91MdpTRT-gPOEsihDvnEhAtNAAlfTDtLTEumWT1昭tmtWh|iriE即Cb*舊itMjpcIwilh岫MFT緝MjhiGEwirtibSIill抵gorGIRT1ASbrlNA-OL陽gnWITlMIjhHRMiif函具UponErtJtoiCTTl,亶用匚.心JncftMAaprriMDn留心EtwrurdbyH-qX&|&L13nd5IEnincpmsicnvrasnwajiredbjWeitrmblol(CLCADPMnerwrdasilhrrcrrhiKD.1ganb-Mscbk.ErwUr*中盅S

24、O:.jiDiM|.ASIRT1ASIncRNA:5,CUCCUA3,UUUUCCUGGCAGUAGAAGGACCGUCG3UGUCAUUAA51uoasajgzOBSmilfnAHAASIncRNABmmu-miR-22;3UGUCAAGA-AGUUGACCGIKGAA5I：lII：IIIIIHill：SIRT1ASIncRNA-5A7ACTTTTCTCCTCTGGCAGTA3-SIRT1ASIncRNA-Mu:5A1ACTTTTCTCCTGCACATCGA3,ControlNCmiR-22mimicsmiR22inhibitorsCmmu-mlR-22.3ugucAAGAAGUUGACCGUCGAa5IIIIIIIIIIIIIISIRT1:5*cauuUUCCAAAA