黃曲霉素B1(AFB1)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

1、 黃曲霉素B1（AFB1）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用。1 使用目的：本試劑盒用于飼料、谷物、血清等相關(guān)液體樣本中黃曲霉素B1（AFB1）殘留的定量檢測。2 實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒采用直接競爭ELISA方法，在微孔板包被有黃曲霉素B1（AFB1）偶聯(lián)抗原，加入黃曲霉素B1（AFB1）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離黃曲霉素B1（AFB1）與微孔條上預(yù)包被的黃曲霉素B1偶聯(lián)抗原互相競爭抗黃曲霉素B1（AFB1）抗體酶標(biāo)記物，用TMB底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在450nm波長下進(jìn)行檢測，吸光值與樣品中黃曲霉素B1（AFB1）含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中黃

2、曲霉素B1（AFB1）的含量。 3 試劑盒組成 3.1 預(yù)包被的AFB1偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）。3.2 AFB1標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是： 0 ng/ml，0.1 ng/ml,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1 ng/ml。3.3抗AFB1抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）。3.4顯色液A：1瓶（6ml）。3.5顯色液B：1瓶（6ml）。3.6終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。3.7樣本稀釋液：1瓶（10×, 6ml），用于樣品稀釋用。3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。3.9說明書一份

3、。44 需要而未提供的材料4.1 設(shè)備4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀。 4.1.2粉碎機(jī)。4.1.3量筒。4.1.4振蕩器。4.1.5漏斗。4.1.6Whatman No 1或相當(dāng)?shù)臑V紙。4.1.7微量移液器。4.2 試劑4.2.1去離子水或蒸餾水。4.2.2 甲醇。5 貯存5.1 試劑盒貯存于28，切勿冷凍5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存6 注意事項(xiàng)6.1 使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書。6.2 不要使用過期試劑盒。6.3 試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2），建議至少回溫2小時。6.4 標(biāo)準(zhǔn)品中含有黃曲霉素B1（AFB1），使用時應(yīng)特別注意，操作時應(yīng)帶手套。6.5 終止

4、液中含有硫酸，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。6.6 不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會影響試驗(yàn)結(jié)果。6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。6.8 稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果6.9 混合試劑時應(yīng)避免起泡。7 工作液準(zhǔn)備7.1 AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ng/ml,0.1ng/ml ,0.3 ng/ml,0.9 ng/ml,2.7 ng/ml,8.1ng/ml7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用7.3 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用7.3 顯色劑：已備用，避免光線直照7

5、.4 反應(yīng)終止液：已備用8 樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）8.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘8.3用Whatman No 1濾紙過濾8.4取100µl處理后的樣品，加入400µl樣本稀釋液8.5取50l稀釋液進(jìn)行分析（稀釋倍數(shù)10）9 酶免分析步驟9.1 實(shí)驗(yàn)須知9.1.1 實(shí)驗(yàn)開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2），時間約2小時。回溫至室溫（25±2）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于28干

6、燥保存注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準(zhǔn)確度。9.1.2 使用后請立即將試劑放回28保存9.1.3 請不要改變分析程序9.1.4 請使用精確的微量移液器9.1.5 操作一旦開始，請不要中斷任何程序9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請嚴(yán)格按照要求操作9.1.7 為避免交叉污染，每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣9.1.8 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面9.2 分析步驟9.2.1 預(yù)先進(jìn)行編號，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回28保存9.2.3 樣品稀釋液（1

7、0×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)9.2.4 在B0孔中加入50µl0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50l的標(biāo)準(zhǔn)品溶液9.2.6 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗黃曲霉素B1抗體酶結(jié)合物9.2.8 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘。 9.3 37溫浴30min （溫浴過程中不時輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，最后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以完全除去孔中液體。9.4 反應(yīng)9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中

8、先加入50µl顯色液A，再加 50µl顯色液B；輕微晃動反應(yīng)板使之徹底混勻9.4.2 37溫浴10min9.4.3 每孔中加入50µl終止液，混勻9.4.4 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。10 結(jié)果計算10.1定量分析10.1.1所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。B標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B00 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值10.1.2以黃曲霉素B1濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應(yīng)

9、點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為AFB1濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中AFB1濃度C（ng/ml）10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。 10.2 半定量測定10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。11 特異性物質(zhì) 交叉反應(yīng)黃曲霉素B1 100%黃曲霉素B2 80%黃曲霉素G1 75%黃曲霉素G2 30%12 試劑盒參數(shù)本試劑盒檢測下限為0.1ppbB0吸光度最