傳代細(xì)胞制備流感病毒疫苗工藝研究進(jìn)展.docx

1、傳代細(xì)胞制備流感病毒疫苗工藝研究進(jìn)展，呂宏亮I,付秀花'，鄭明2(1.乾元浩生物股份有限公司，北京】00081；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)收稿日期2009-05-05文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1002-1280(2009)06-0043-06中圖分類號(hào)S859.797摘要目前人及動(dòng)物用流行性感冒病毒疫苗(流感疫苗)的生產(chǎn)大多采用雞胚。這種傳統(tǒng)的方法勞動(dòng)強(qiáng)度大，雞胚用量大，需要繁瑣的純化工藝去除雞胚蛋白減少過敏反應(yīng)，流感的大流行性以及新發(fā)流感的流行迫切需要一種新的疫苗生產(chǎn)方法：用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗。細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗經(jīng)過研究和發(fā)展，從可用于生產(chǎn)的Vero、MDCK、PER-C6

2、細(xì)胞的生物學(xué)鑒定、分析到流感病毒的重配、適用、培養(yǎng)以及下游工藝的懸浮培養(yǎng)、濃縮、純化、安全以及效果觀察都取得長足進(jìn)展。本文從細(xì)胞流感疫苗的細(xì)胞基質(zhì)、病毒適用、重配、培養(yǎng)、濃縮、純化及其疫苗的安全、效果觀察方面綜述了細(xì)胞流感疫苗的研發(fā)重點(diǎn)。關(guān)鍵詞傳代細(xì)胞；流感疫苗；研究進(jìn)展AdvanceinCellDerivedInfluenzaVirusVaccineProcessDevelopmentLUHong-liang1,FUXiu一hua1,ZHENGMing2(1.QianyuanhaoBiologicalCo.,Ltd,Beijing100081；2.ChinaInstituteofVeteri

3、naryDrugControl,Beijing100081China)Abstract:Thisarticlediscussedthemammaliancelllineusedtogrowinfluenzavirusadaptedcultivation,aswellasdownstreamprocessdevelopment,suspensioncultivation,concentration,purificationforinfluenzavaccines.Influenzavirusesforproductionwerepresentlyproducedinembryonatedhen&

4、#39;seggs.Thisconventionalstandardmethodologywasextremelycumbersome;itrequiredmillionsofeggsandanextensivepuriGcationtoreducetheamountofcontaminatingeggproteinsandtominimisetheriskofallergiesagainsteggalbumin.Theshortageofeggsinapandemicsituation,theselectionofegg-adaptedvariantsandthepresenceofadve

5、ntitiousviruseshasemphasisedthenecessityforproductionofinfluenzavaccinesonawellcharacterisedstablemammaliancellline.Mammaliancell-derivedvaccines,producedinnontumorigeniccelllines,havebeendevelopedandshowntobeeffectiveproductionsystemsasalternativestoeggs.EstablishedVero,MDCK,PER-C6technologyhasbeen

6、successfullyadaptedtoisolation,reassortantviruswithreversegeneticstogeneratehighgrowthvirusstrainaswellastolargescaleproductionofahugevarietyofinfluenzavirusstrains.TTieproductionin11200literfermenterculturesunderserumfreeconditionsgaveantigenyieldscomparabletotheconventionalembryonatedeggtechnology

7、.ThedevelopmentofarapidandefficientpuriGcationschemeresultedinasafehighpurityvaccinewhichwasatleastasimmunogenicasconventionalegg一derivedvaccinesinamousemodel.Clinicaltrialsindifferentregiondemonstratedthatthecell一derivedinfluenzavaccinewaswelltolerated,safeandhighlyimmunogenicinhumans.Keywords：cell

8、line；influenzavirusvaccine；researchprogress作者簡介：呂宏亮（1%6年-），博士，主要從事病逐性疫苗研究和生產(chǎn)。E-mail：hongliangnvsi人和動(dòng)物的流感總是不斷地危及人和動(dòng)物的健康以致生命安全,造成嚴(yán)更的社會(huì)影響和經(jīng)濟(jì)損失。近年來禽流感不僅在一些國家和地區(qū)流行，給養(yǎng)禽業(yè)帶來重大的損失，而且禽流感病毒感染人并致人發(fā)病和死亡。特別是最近源自墨西哥的新流感毒株引起的人甲型H1N1流感在不長的時(shí)間里已波及世界達(dá)74個(gè)國家和地區(qū)，發(fā)病人數(shù)超過二萬人,其中死亡一百多人;在加拿大還出現(xiàn)該新流感毒株由人傳至豬群并致其發(fā)病的病例。一些流感病毒打破了感染宿主

9、的種屬界限，應(yīng)引起我們高度的警惕,并做出相應(yīng)的對(duì)策。接種人和動(dòng)物流行性感冒病毒疫苗(流感疫苗)是預(yù)防流感、控制人和動(dòng)物流感大流行、預(yù)防動(dòng)物流感感染人或人流感感染動(dòng)物的最經(jīng)濟(jì)旦行之有效的方法。傳統(tǒng)的制備流感疫苗的方法需采用雞胚,培養(yǎng)周期過長，不得不對(duì)數(shù)百萬個(gè)雞胚逐一進(jìn)行接種和收獲，生產(chǎn)過程很難實(shí)現(xiàn)全程自動(dòng)化，勞動(dòng)強(qiáng)度大，時(shí)間消耗多，不易于質(zhì)量控制和保證，有時(shí)病毒不能在雞胚上復(fù)制，產(chǎn)量低。如果要保證雞胚的供應(yīng)，疫苗生產(chǎn)前6個(gè)月就要做好詳細(xì)的安排。雞胚存在潛在污染的可能，且雞胚培養(yǎng)的流感病毒經(jīng)過連續(xù)傳代后常常引起變異,使所制備的流感疫苗抗原性與人群(或畜禽群)中的流感毒株不能完全匹配。雞胚尿囊液中雜

10、質(zhì)比較多,使疫苗生產(chǎn)后期的濃縮難度(容易堵塞)增加，雞胚還可能因存在潛在病毒的污染而降低敏感性。只有那些經(jīng)過認(rèn)證的養(yǎng)雞場才可以提供無抗體、無潛在致病因子污染的SPF雞胚。另外，在禽流感高發(fā)期，可能會(huì)因?yàn)殡u的大量感染死亡而缺乏制備疫苗的原料，旦此時(shí)如果仍使用雞胚生產(chǎn)流感疫苗,則存在著極大的安全隱患。因此,WHO建議使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒來替代雞胚制備流感疫苗，使其抗原性更接近自然流行株，還可減少宿主蛋白成分,降低接種對(duì)象的變態(tài)反應(yīng)，如牛腎傳代細(xì)胞(Madin_Darbycaninekidney,MDCK)、非洲綠猴腎細(xì)胞(Africangreenmonkeykidneycell,Vero)

11、或其他細(xì)胞系。此外，利用雞胚生產(chǎn)流感疫苗,在處理使用后的雞胚殘?bào)w時(shí)只能采用焚燒或其他無害化的處理方法,既增加成本，又污染環(huán)境，而利用細(xì)胞生產(chǎn)疫苗則擺脫了對(duì)雞胚的依賴，沒有處理雞胚殘?bào)w這一環(huán)節(jié)，既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保。在人和動(dòng)物對(duì)流感疫苗的需求不斷增加的形勢下，研制出可以擺脫對(duì)雞胚的依賴、在短期內(nèi)提供足夠疫苗產(chǎn)品以滿足流感大規(guī)模流行時(shí)需要的流感疫苗，已成為目前流感疫苗研制中的方向。用細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗，除了在質(zhì)最、產(chǎn)最上都優(yōu)于目前的雞胚，在其他方面的優(yōu)勢如表1所示。表1雞胚與細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒的優(yōu)缺點(diǎn)過程優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)對(duì)胚分離、培養(yǎng)候選疫苗株已經(jīng)使用多年,工藝成熟高產(chǎn)株多次傳代產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的突變，雞勝的供應(yīng)需要作計(jì)

12、劃,H3N2難以用雞厘分離檢測雞胚疫苗的單向免疫擴(kuò)散試劑容易在WHO范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化和接受可能低估細(xì)胞疫苗的效力細(xì)胞培養(yǎng)分離候選疫苗株范圍大、快速需要適'底細(xì)胞系的鑒定，外源因子的去除和安全性研究檢奩細(xì)胞疫苗的引向免疫擴(kuò)散試劑細(xì)胞與疫苗基質(zhì)細(xì)胞必須匹配缺乏細(xì)胞系的標(biāo)椎化細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的制造可規(guī)模化、快速、不依賴于生物材料的供應(yīng)、清潔、易于質(zhì)底控制，生產(chǎn)貝險(xiǎn)低、純度高、穩(wěn)定性好、不含卵清蛋白需要研究和發(fā)展，外源病毒需要控制，生產(chǎn)設(shè)施比較貴下面從細(xì)胞基質(zhì)、病毒培養(yǎng)、生產(chǎn)工藝幾個(gè)方面對(duì)使用細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗的研究進(jìn)展加以綜述。1細(xì)胞基質(zhì)的研究過去曾經(jīng)采用原代雞腎、雞胚腎細(xì)胞培養(yǎng)制備流感疫苗，現(xiàn)主要使

13、用Vero、MDCK、PER-C6、傳代雞胚腎細(xì)胞(PBS-1)等細(xì)胞系。這些細(xì)胞系無外源因子污染、無致腫瘤性、對(duì)流感病毒易感、病毒滴度高，且PBS-1細(xì)胞可將病毒釋放到液體中，減低了后續(xù)工藝的勞動(dòng)強(qiáng)度。Solvay.GSK及Chiron選擇MDCK細(xì)胞系,Baxter-AG選擇Vero細(xì)胞系，Sanofi-pasetur與Crucell公司合作開發(fā)PER-C6細(xì)胞流感疫苗。傳代細(xì)胞如Vero細(xì)胞系可用于很多病毒的分離培養(yǎng)，是世界衛(wèi)生組織和我國生物制品規(guī)程許可的疫苗生產(chǎn)細(xì)胞系，在160代次以內(nèi)可用于疫苗生產(chǎn)，如脊儲(chǔ)灰質(zhì)炎疫苗、狂犬病疫苗、乙型腦炎疫苗等。在我國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編(2006

14、-2008)中也匯集了一些已采用傳代細(xì)胞作為基質(zhì)生產(chǎn)的動(dòng)物疫苗，如豬細(xì)小病毒病疫苗，豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，豬回腸炎疫苗,犬瘟熱、腺病毒、細(xì)小病毒、副流感病毒2型呼吸道感染癥四聯(lián)疫苗等。目前用于甲型、乙型流感病毒增殖和感染性滴度檢測的細(xì)胞主要是MDCK細(xì)胞，并經(jīng)常用雞胚培養(yǎng)，進(jìn)行流感病毒分離o1995年Govorkova等：首次嘗試使用Vero細(xì)胞分離、繁殖甲型流感病毒，證明Vero細(xì)胞是適合流感病毒生長的。1996年乙型流感病毒也得以在Vero細(xì)胞上分離成功，并進(jìn)一步證明在Vero細(xì)胞上獲得的流感病毒血凝素（Haemagglutinin,HA）與在MDCK上得到的HA比較，氨基酸序列一致，但

15、與從雞胚上得到的HAM基酸序列在196198上不同。電鏡和免疫學(xué)試驗(yàn)還證明甲型、乙型流感病毒在Vero細(xì)胞上形態(tài)變化、感染過程與在MDCK上是一樣的。1998年開始,Kistner等在奧地利用Vero細(xì)胞研制滅活全病毒流感疫苗，免疫BALB/c小鼠后所獲得的血凝抑制抗體滴度比雞胚苗高很多，主要為】gGl和IgG2a/2b,誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答和細(xì)胞因子都好于雞胚苗。從Vero細(xì)胞最初分離夏制病毒，分離株的HA抗原性、遺傳穩(wěn)定性、Vero細(xì)胞受體的特異性和流感病毒感染右效性、流感病毒感染Vero細(xì)胞后的蛋白合成和感染病毒后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化等方面可得出以下結(jié)論:Vem細(xì)胞可用于臨床樣本的流感病毒

16、分離，并可有效復(fù)制產(chǎn)生較高的感染滴度;能保持樣本中流感病毒HA分子的遺傳穩(wěn)定性;流感病毒在感染Vero和MDCK細(xì)胞時(shí)，其蛋白合成過程和細(xì)胞形態(tài)變化非常相似。2流感病毒的改造、培養(yǎng)以人用流感疫苗為例，流感疫苗毒株的制備通常是WHO推薦的流行株與國家實(shí)驗(yàn)室保存的在雞胚中具有高滴度的PR8株進(jìn)行雙重感染產(chǎn)生商生長性的重配株（Highgrowthreassortant,HGR），分發(fā)給疫苗生產(chǎn)企業(yè)用于每年的疫苗生產(chǎn)。用逆向遺傳學(xué)制備疫苗毒株和傳統(tǒng)方法相比具有以下優(yōu)勢:定向改造毒株,避免過去傳統(tǒng)方法的肓目性、不確定性;去除沒有經(jīng)過驗(yàn)證的細(xì)胞系、野毒株污染或其他病原;排除HA的致病性，可用于非致病性、高

17、致病性毒株的重配。這樣重配的流感病毒疫苗株不但具備流行株的表面抗原（HA和NA）,同時(shí)也獲得PR8毒株的毒力減弱和在細(xì)胞中高效復(fù)制能力。目前反向遺傳學(xué)技術(shù)多用于流感毒株的改造和細(xì)胞適應(yīng)，以便獲得高滴度的病毒。Ozaki等把野毒株A/England/1/53與在雞胚中繁殖較快的疫苗株P(guān)R8根據(jù)2+6策略基因重配，并篩選出Vero細(xì)胞生K適應(yīng)重組株Eng53/v-a。感染Vero細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)Eng53/v-a比PR8繁殖生長得更好，試驗(yàn)證明NS基因（非結(jié)構(gòu)基因）發(fā)揮了作用，而NS基因產(chǎn)物在293T細(xì)胞中使病毒滴度下降了10310倍，在MDCK中降低了5倍。Ma-血等用反向遺傳學(xué)突變了豬流感病毒H1N

18、1（A/SW/SK/18789/02）的HA基因，獲得2個(gè)突變體，突變體高度減毒并能在MDCK細(xì)胞匕大量復(fù)制，遺傳學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，有望作為疫苗的后選株。巴斯德研究所對(duì)兒種不同的細(xì)胞系（BHK.Vero和MDCK細(xì)胞系）、培養(yǎng)基、靜止培養(yǎng)、不同類型微載體的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，最后通過連續(xù)提供新鮮培養(yǎng)基并調(diào)整pH值的大容量:生物反應(yīng)器進(jìn)行研究，在生產(chǎn)過程中添加胰蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn)Roux瓶或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Vero細(xì)胞，為獲得生K快旦產(chǎn)fl：高的病毒（7d后HA滴度為256512/mL）,整個(gè)過程都應(yīng)在無血清培養(yǎng)基MDSS2中進(jìn)行。如采用含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行病毒生產(chǎn)后,在病毒生產(chǎn)階段采用MDSS2,病毒產(chǎn)最相當(dāng)?shù)停?d后H

19、A滴度為0128/mL）°由于病毒HA滴度不會(huì)超過128512/mL,且在病毒接種于Vero細(xì)胞與病毒產(chǎn)生之間需要較長的時(shí)間。通常用MDCK分離新病毒的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將無血清培養(yǎng)基略作改進(jìn)后，可在反應(yīng)器中灌注培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，快速大量生產(chǎn)病毒，在無血清條件下生長數(shù)代的MDCK細(xì)胞生產(chǎn)的病毒產(chǎn)量最高。毒種可以是雞胚傳代株、細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)株或僅在MDCK細(xì)胞中傳了1代或2代的新分離病毒。早期研究發(fā)現(xiàn)流感病毒在Vero細(xì)胞中不能很好的復(fù)制增殖w-。因?yàn)榱鞲胁《痉橇呀獾难刈柚沽瞬《緦?duì)細(xì)胞的感染性，通過在細(xì)胞維持液中加入適量:的胰酶，有效地裂解其血凝素后，使病毒能吸附感染細(xì)胞，但在病毒培養(yǎng)過

20、程中病毒滴度下降很快，無法得到大量有效的繁殖，甚至有時(shí)測不到HA,沒有感染的病毒粒子釋放。經(jīng)培養(yǎng)液胰酶檢測發(fā)現(xiàn)，胰酶活性在孵育30min時(shí)已完全被滅活,是因?yàn)閂ero細(xì)胞在生長中不斷地分泌出一種50-100kD的蛋白抑制因子，并游離于基質(zhì)中，滅活胰前的活性。如果在病毒復(fù)制過程中間隔補(bǔ)充胰酶量，結(jié)果顯示病毒的滴度、產(chǎn)率得到極大的提高，即使傳5代、10代后病毒滴度仍能維持在較高水平,與在雞胚中獲得的滴度相當(dāng)'。胰酶對(duì)流感病毒在大多數(shù)細(xì)胞中的復(fù)制增殖發(fā)揮重要的作用，將Vem細(xì)胞單層用PBS沖洗3遍，加入含1.0jig/mLTPCK(TolylsuIfonylphenylalanylchlor

21、omethylketone,TPCK,甲苯磺酰苯丙氨酰氨甲酮)-胰酶的MEM-BSA(牛血清白蛋白)，在37T、5%CO,條件下,分別在50mL培養(yǎng)瓶、6孔板和24孔板中進(jìn)行培養(yǎng),48h后胰酶的活性基本消失殆盡，旦50mL培養(yǎng)瓶下降最快,6孔板次之,24孔板最慢。同時(shí)在恒河猴腎細(xì)胞(LLC-MK?)、豬腎細(xì)胞(MDSK)和MDCK細(xì)胞培養(yǎng)過程中也發(fā)現(xiàn)了胰前活性消失現(xiàn)象，但比在Vero細(xì)胞中消失得要慢一些。用Vero細(xì)胞在6孔板中進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，當(dāng)每孔中的培養(yǎng)液量不同時(shí)，胰酶的活性降低速度也有不同,2.2mL/孔、3.0miy孔和4.5mI7孔組培養(yǎng)24h后，胰酶的最終濃度分別下降為初始濃度的9.1

22、%、30.0%和42.7%,說明單位面積細(xì)胞的培養(yǎng)液體積越多，胰酶抑制因子的濃度越低，細(xì)胞的生長越好。研究表明，當(dāng)HIN1和H3N2流感病毒在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳15代后，即使反復(fù)添加胰酶，病毒的產(chǎn)最也會(huì)稍微低于在MDCK細(xì)胞中的產(chǎn)批，然而傳至10代時(shí),病毒的產(chǎn)量與MDCK細(xì)胞相當(dāng)。因此，流感病毒培養(yǎng)中適量的胰酶是細(xì)胞生產(chǎn)病毒不可缺少的因素。3生產(chǎn)工藝的研究人用流行性感冒病毒疫苗的工藝技術(shù)是19世紀(jì)40-50年代發(fā)展起來的，每年全球生產(chǎn)3億5千萬人份，每人份含H3N2、H1N】、B型流感病毒HA各15展,整個(gè)過程包括流感的預(yù)測、毒株篩選、候選疫苗株的確定、生產(chǎn)、分發(fā)等。傳統(tǒng)的雞胚流感疫苗的生產(chǎn)

23、，一般是采用雞胚接種，經(jīng)35勾培養(yǎng)72h后，置4幻冷卻過夜,收獲尿囊液。分別對(duì)不同批次的尿囊液進(jìn)行無菌、滅活試驗(yàn)血凝滴度檢測。合格的尿囊液合并，經(jīng).22頭m進(jìn)行過濾,300kDcutoff的膜包進(jìn)行3050倍濃縮,然后進(jìn)行成糖密度區(qū)帶超速離心純化。由于病毒培養(yǎng)方式的改變，后續(xù)的工藝也隨之改變，呈現(xiàn)提高疫苗的安全性、生產(chǎn)效率的趨勢。動(dòng)物用流感疫苗也用雞胚生產(chǎn)，但一般沒有后期的濃縮和純化過程。目前3家公司已獲得細(xì)胞生產(chǎn)人用流感疫苗的生產(chǎn)許可。Vero細(xì)胞生產(chǎn)的流感疫苗已經(jīng)進(jìn)行了免疫原性的評(píng)價(jià)并被批準(zhǔn)規(guī)?；a(chǎn)'成。Baxter利用微載體Cytodex-3懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)

24、胞，批次培養(yǎng)細(xì)胞可達(dá)2x10”個(gè)細(xì)胞，接毒感染復(fù)數(shù)(Multiplicityofinfection,MOI)為0.01TCID/細(xì)胞，病毒吸附1h后加入胰酶,32P35T孵育4872h,研制成功了人用季節(jié)性流感裂解苗和大流行流感全病毒疫苗，并成功通過了臨床試驗(yàn)。生物反應(yīng)器或Wave""培養(yǎng)MDCK或Vero細(xì)胞，培養(yǎng)基有含血清或無血清的，細(xì)胞經(jīng)4d培養(yǎng)，密度可達(dá)106107個(gè)/mL,微載體密度25g/L,微載體類型為Cytodexl或Cytodex3,病毒滴度HA可達(dá)到2.32.9log/100jiL,MOI為0.050.1TCJDjo/細(xì)胞。流感季節(jié)性流行和可能的大流行促

25、使人們研究快捷的生產(chǎn)方法,Kistner等”們采用野毒株直接在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)以生產(chǎn)滅活全病毒疫苗。通過30L或100L生物反應(yīng)器培養(yǎng)流感病毒，病毒滴度達(dá)loglOTCID/mL,經(jīng)滅活，在動(dòng)物試驗(yàn)中具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)交叉中和抗體、細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)同型或異型的流感病毒攻擊產(chǎn)生保護(hù)。最近的一項(xiàng)工藝研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)病毒原液的HA達(dá)393HAU/100皿，濁度到0.479OD(700nm)，蛋白和DNA含量分別為72jig/mL、5.73jig/mL時(shí)進(jìn)行收獲、合并，經(jīng)0.65jim膜過濾J/4000B-丙內(nèi)酯滅活A(yù)4531微濾、750kD切向流波器超濾、分子篩層析、離子交換層析純化

26、、配苗等后續(xù)工藝，澄清工藝的抗原收獲率為79%,微濾工藝收獲率為93%,濁度下降2%左右，采用750kD中空纖維柱超濾時(shí)，收獲率為97%，蛋白和DNA的含量下降分別為16%和33%,濃縮液經(jīng)Sepharose4FF純化,HA活性的收獲率可達(dá)85%,截量每小時(shí)處理0.15倍柱體積的濃縮液，蛋白和核酸減少35%和34%,收集的病毒純化液再經(jīng)陰離子交換層析純化,收獲率為80%,1mL介質(zhì)吸附160kHAU的病毒，宿主DNA減少67倍。整個(gè)工藝過程的病毒產(chǎn)量50%-60%，總蛋白減少19倍，宿主DNA減少500倍，基本滿足細(xì)胞流感疫苗的生產(chǎn)需求也有實(shí)驗(yàn)室研究用一種Euonymuseumpaeus的親和

27、素做配體制成瓊脂糖、纖維素、多聚化合物、玻璃顆粒的親和介質(zhì)分離純化流感病毒。試驗(yàn)結(jié)果表明，用纖維素、多聚化合物作成的膜親和層析比傳統(tǒng)親和層析具有更高的效率，去除DNA的效率達(dá)到0.2%1%,雜蛋白去除率31%50%,和流感病毒具有高親和性，有希望代替目前的兩步層析用于MDCK細(xì)胞流感疫苗的純化切。隨著細(xì)胞培養(yǎng)制備流感疫苗的研究發(fā)展，安全性、有效性的研究也在不斷深入。Novatis疫苗公司）用MDCK細(xì)胞制備的疫苗已通過歐盟n期臨床試驗(yàn),和雞胚流感疫苗相比,具有相同的免疫原性,無明顯的輕度、中度反應(yīng)，在老人和其他人群中具有艮好的耐受性。Halperin等利用MDCK細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒制成裂解滅活疫

28、苗，對(duì)112名健康成人注射此疫苗，同時(shí)與同類的雞胚培養(yǎng)的疫苗比較，結(jié)果兩種疫苗在注射后的不良反應(yīng)與免疫后抗體滴度水平均無明顯差異，證明細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗是安全有效的，應(yīng)值得進(jìn)一步推廣。加拿大的Percheson等使用源于MDCK細(xì)胞的BV-5F1細(xì)胞（被證實(shí)無致腫瘤性），經(jīng)擴(kuò)增后轉(zhuǎn)至大規(guī)模發(fā)酵罐中的微載體上培養(yǎng),接種流感病毒，繼續(xù)培養(yǎng)，收獲的病毒液按照雞胚培養(yǎng)的裂解流感疫苗的純化方法進(jìn)行純化，主要包括高心、超濾、甲醛滅活、裂解、配苗。然后運(yùn)用隨機(jī)、雙盲的臨床人體觀察方法對(duì)此類細(xì)胞滅活疫苗和雞胚滅活疫苗同時(shí)接種健康人群，結(jié)果證明此類新型疫苗在成人試驗(yàn)中是安全有效的。4今后的研究方向和重點(diǎn)細(xì)胞基質(zhì)

29、生產(chǎn)流感疫苗，涉及流感病毒分離、流感病毒重配、適應(yīng)、培養(yǎng)、濃縮、純化以及質(zhì)域控制的過程，實(shí)際上是生產(chǎn)流感疫苗的安全性、有效性、穩(wěn)定性，因此我們應(yīng)在以F環(huán)節(jié)加強(qiáng)研究：4.1病毒種子的安全性流感病毒臨床樣本的分離通常采用MDCK細(xì)胞。該細(xì)胞系的生物學(xué)特性未經(jīng)驗(yàn)證，同時(shí)來自人呼吸道的分泌物以及未驗(yàn)證的細(xì)胞系均有潛在的外源病毒污染，不能用于疫苗候選株的培養(yǎng)。使用WH。認(rèn)證的細(xì)胞系分離、培養(yǎng)病毒是保證疫苗、毒種安全性的重要方面。加強(qiáng)細(xì)胞基質(zhì)外源病毒檢測是保證疫苗安全的重要環(huán)節(jié)。目前快速的PCR檢測細(xì)胞系中特定外源病毒方法獲得認(rèn)證和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估3，可用該方法檢測流感病毒株的外源病毒。4.2臨床樣本分離方法使用

30、MDCK細(xì)胞能成功地分離流感病毒，但Vero、PER-C6等其他細(xì)胞系在分離流感病毒的作用如何？是否優(yōu)于MDCK細(xì)胞仍值得研究。4.3高產(chǎn)重配株與候選疫苗株通過雞胚感染重配的高產(chǎn)重配株難以在細(xì)胞系上生長，需要在細(xì)胞上重配的高產(chǎn)株方能作為細(xì)胞候選疫苗株。通過逆向遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)行重組構(gòu)建候選疫苗株廣泛應(yīng)用于大流行疫苗和活疫苗株的構(gòu)建，由于其過程采用特殊的PCR基因質(zhì)粒操作、細(xì)菌轉(zhuǎn)化和傳代,實(shí)際上去除了外源病毒污染,降低了分離病毒株到疫苗病毒株種子批轉(zhuǎn)化的危險(xiǎn)，可用于分離病毒的重配、純化而去除可能的外源污染。因此疫苗公司要加大對(duì)該技術(shù)的掌握，而不能只依賴國家實(shí)驗(yàn)室。4.4單向免疫擴(kuò)散(SingleRa

31、dicalImmunodiffusionAssay,SRD)試劑在SRD分析中，一般要求抗原必須與疫苗中的抗原一致，多數(shù)是雞胚生產(chǎn)的抗原，缺乏細(xì)胞生產(chǎn)抗原的分析數(shù)據(jù)。但也有抗原制備來源不同影響分析結(jié)果的報(bào)道，因此要加強(qiáng)SRD分析中抗原來源影響抗原含量的研究。4.5緊急預(yù)防和治療用抗體制劑流感疫苗的研制還需時(shí)日，因此除有效的藥物(如此次甲型H1N1流感中使用達(dá)菲)治療以外，在人和動(dòng)物(名貴的種用動(dòng)物或?qū)櫸?發(fā)生流感的早-期，對(duì)其感染的個(gè)體是否可用有效抗體進(jìn)行治療,并對(duì)與其接觸的小群體用抗體進(jìn)行緊急被動(dòng)免疫。利用傳代細(xì)胞復(fù)制分離到的病毒制成抗原，并采用現(xiàn)有的技術(shù)制備成精制的抗體,本文認(rèn)為值得深入研

32、究。參考文獻(xiàn)：1GcrdilC.TheAnnualProductionCycleforInfluenzaVaccineJ.Vaccine,2003,21(16)：1776-1779.2'Kistncr0,BarrettN,MundtW,eial.DevelopmentofaNovelInfluenzaVaccineDerivedfromaContinuousCellLineJ.Altex,200I,I8(l)：50-54.3 MabroukT,EllisRW.InfluenzaVaccineTechnologiesandtheUseoftheCell-cultureProcess(ce

33、ll-cultureInfluenzaVaccine)J.DevBiol(Basci),2002,110：125-134.4 PauMC,OphoratC,KoldijkMH,elal.TheHumanCellLinePER-C6ProvidesaNewManufacturingSystemfortheProductionofInfluenzaVaccincsJ.Vaccine,2001,19(17/19)：2716-2721.GriffithsE.WHORequirementsfortheUseofAnimalCellsasinVitroSubstratesfortheProductiono

34、fBiologicals：ApplicationtoInfluenzaVaccineProductionJ.DevBiolStand,1999,98：153-157.6 GovorkovaEA,MurtiG,MeignierB,etal.AfricanGreenMonkeyKidney(Vero)CellProvideanAlternativeHostCellSystemforInfluenzaAandBVimsJ.Jofvirology,1996,70(8)：5519-5524.7 Kislner0,BarrettPN,MundtW,etal.DevelopmentofaMammalianC

35、ell(Vero)DerivedCandidateInfluenzaVirusVaccineJ.Vaccine,1998,16(9/10)：960-968.8 NakamuraK,HommaM.ProteinSynthesisinVetoCellsAbortivelyInfectedwithInfluenzaBVinisJ.JGenVirol,1981,56(Pt1)：199-202.9 OzakiH,GovorkovaEAtUa/.GreenMonkeyKidney(Vero)CellsbyReverseGeneticsJ.JVirol,2004,78(4)：1851-1857.10 Mas

36、icA,BabiukLA,ZhouY.ReverseGenetics-genemtedElastase-dependentSwineInfluenzaJJGenVirol,2009,90(Pt2)：375-385.1iYouilR,SuQ.TonerTal.ComparativeStudyofInfluenzaVimsReplicationinVeroandMOCKCellUncs(J.JVirolMetho&,2004,120(1)：23-31LauSCtScholtissekC.AbortiveInfectionofVeroCellsbyanInfluenzaAVirus(FPV)

37、JJ.Virology,1995,212(1)：225-231.12 KaverinNV,WebsterRG.ImpairmentofMuhicycl。InfluenzaViniRGrowthinVero(WHO)CellsbyIxwsofTrypsinActivityJ.JofViroIo©J995169(4)：2700-2703.14RobertsonJS,CookP,AltwellAM,etal.ReplicativeAdvantageinTissueCultureofEgg-adaptedInfluenzaVirusoverTissue-cultureDerivedVirus

38、：ImplicationsforVaccineManufacture”.Vaccine,1995.13(16)：1583-1588.15AudsicyJM,TannockGA.Cell-basedInfluenzaVaccines：ProgresstoDate(J.Drugs,2008,68(11)：1483-1491.16 CoxRJ,MadhunAS,HaugeS.etal.KPhaseIClinicalTrialofaPER-C6(R)CellCruwnInfluenzaH7Viru«VaccineJ.Vaccinet2009,27(J3)：1889-1897.17 Genze

39、lY、OlmerR1,SchtfferBtetal.WaveMicrocarrierCultivationofMDCKCellsforInfluenzaVirusProductioninSerumContainingandSerum-freeMedia：JVaccine,2006,24(35/36)：6074-6087.18 Kistner0,HowardMK,SpmthM,etal.CellCulture(Vero)DerivedWholeVims(H5N1)VaccineBasedonWild-typeVirusStrainInducesCross-protectiveImmuneResp

40、onsesJJ.Vaccine,2007,25(32)：6028-6036.19 KalbfussB,WolffM,MorenwciscrR,ho/PurificationofCellCulture-derivedHumanInfluenzaaVirusbySize-exclusionandAnion-exchangeChromatographyJ.BiotechnolBioeng,2007,96(5)：932-944.20 OpitzL,ZimmermannA.LehmannS.CaptureofCellCulture-derivedInfluenzaVimsbyLectins：StrainIndependent,butHostCellDepcndcntfjj.JVirolMethods,2008J54(f/2)：61-68.21GrothN,MontomoliE,GentileC,etal.Safety,TolerabilityandImmunogenicityofaMammalianCell一cult