H5亞型高致病性禽流感病毒HA基因重組新城疫病毒活載體疫苗接種后氣管黏膜損傷的研究.docx

1、H5亞型高致病性禽流感病毒HA基因重組新城疫病毒活載體疫苗接種后氣管黏膜損傷的研究疫病毒活載體疫苗接種后氣管黏膜損傷的研究!董俊斌*,馬學(xué)恩】，步志高2(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱150001)中圖分類號:S852.65'9.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號;1004-7034(2010)01-0007-04關(guān)鍵詞：H5亞型高致病性禽流感病毒;HA基因；重組新城疫病毒；氣管黏膜損傷摘要：為了研究H5亞型高致病姓禽流感病毒HA基因重組新城疫病毒活裁體疫苗rLaSota-HA(GD)的

2、免疫機(jī)理，用rLaSot&-HA(GD)免疫2日齡SPF雛雞，分別在接種后的1,3,5,10,15,18天取氣管進(jìn)行電鏡、光鏡觀察，利用免疫組化染色(IHC)方法檢測病毒在氣管內(nèi)的分布。結(jié)果表明：接種rLaSota-HA(GD)后第1天纖毛細(xì)胞有脫纖毛現(xiàn)象，杯狀細(xì)胞破碎，黏液成分增多，黏膜下層的纖維裸露在表面上，并可看到纖毛細(xì)胞的纖毛上有球形粒子，杯狀細(xì)胞、基細(xì)胞大量增生；接種后第18天纖毛細(xì)胞脫纖毛區(qū)域進(jìn)一步增大。接種后第3天黏膜下層水腫，淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，黏膜上皮形成空泡狀，表層由數(shù)層不成熟的細(xì)胞組成；接種后第10天腺體腔閉塞。免疫組化染色可見氣管固有層細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，

3、棕色顆粒出現(xiàn)在胞漿中。結(jié)果說明氣管黏膜的損傷是機(jī)體重要的防御機(jī)制和免疫機(jī)制的表現(xiàn)。ThachealepitheliumlesionofchickensvaccinatedwithrecombinantNDVLaSotavaccinestrainexpressingHAgeneofH5highlypathogenicityAvianinfluenzavirusDONGJun-bin",MAXue-en1,BUZhigao2(1.TheCollegeofAnimalScienceandMedicine,InnerMongpliaAgriculturalUniversity,Hohhot0

4、10018vChina；2.XationalKrylboralor),ofVeterinaryBiotechnologytHarbinVeterinaryResearchInstitutetChineseAcademyofAgriculturalSciences,llarhin150001,China)Keywords:H5highlypathogenicityAvianinfluenzavirus；HAgene；recombinantNDV；thachca!epitheliumlesionAbstract:Vaccinationwasgivenbyeyedropandintranasally

5、inslillationwithrl冬Sota-HA(GD)(2x106EiDjo/chicken)totwo-day-oldSPFchickenafter1,3,5,10.15,18days.Thetrachraswerecollected.Uhrastructuralchangesinthetrachralrpilheliumwereexaminedbyscanningelectronmicroscopy.Onday1postvaccation(PV)scanningelectronmicroscopyrevealedhypertrophyofgobletcellandsmallpat-c

6、hcij*ofthedeciliatrdepitheliumaroundthedisorientedanddeformedcilia.Ondays1PVhyperplasiaofgobletcellsarcomiKaniedbyanin*creaseinmucus.Ondays1PVglobularparticlesfoundinareasofthetracheaepitheliumwilhtipsofciliaadheringtothemtgobletcellsandbasalcellregenerated.Non-ciliatedplaqueswereobserveduntildayi8P

7、V.Buttheygradually<iecrrasr<linsize,iuglitmicroscopyshowedsmallvacuolescontaininglymphocytesandheterophilsplasmacelkintheepithelia)layer.Thesubmucosaisslightlyedematous,immatureepi*theliumproliferatedinsomeareas.Thetracheaislinedwithseverallayersofiminuturecellsondays3PV.Thereishyperplasiaofmu

8、cousglandcellscausingnarrowongorobliterationofglandularlaminainimmunohistochemical(IHC)stainingondays10PV.Sprcilficstainingwaslocalizedinthrsubmucosacells.Thisresponseisprobablyanattemptbythemucociliarydefensemechanism.1999年，歐洲學(xué)者率先建立了第1個(gè)高致病性新城疫病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)(reversegeneticsystem,RGS)(,：O研究表明，新城疫病毒基因組在不

9、同位點(diǎn)插入外源報(bào)告基因或免疫原基因，經(jīng)細(xì)胞或雞胚收稿日期:2008-12-26;修回日期：2009-10-28基金項(xiàng)目：“973"國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2OO5CB5232OO)作者簡介：董俊斌(1975-)，女(蒙古族)，博士研究生.通訊作者：步志高(1965-)厚，研究員，博士.連續(xù)高代次傳代仍保持高度的遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性l，-41o筆者選擇生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用的、免疫效果良好的新城疫病毒Sota弱毒疫苗株建立了相應(yīng)的反向遺傳操作系統(tǒng)，成功救獲了野生型病毒株，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了表達(dá)H5亞型高致病性禽流感免疫原HA基因的重組新城疫病毒.前期試驗(yàn)結(jié)果證明救獲的重組病毒板Sota-

10、HA(GD)保持了LaSota親本株良好的雞胚生K適應(yīng)性、高度生物安全性及遺傳穩(wěn)定性,免疫維雞可分別對新城疫病毒強(qiáng)毒及H5亞型高致病性禽流感病毒的致死攻擊形成完全保護(hù),用其預(yù)防新城疫和H5亞型高致病性禽流感病毒具有良好的應(yīng)用前景。試驗(yàn)用H5亞型商致病性禽流感病毒HA基因重組新城疫病毒活載體疫苗rLaSo-ta-HA（GD）接種2日齡SPF雛雞進(jìn)行氣管黏膜損傷和病毒定位研究，并對其免疫機(jī)理進(jìn)行了初步探討。1材料1.1試驗(yàn)動(dòng)物SPF雛雞，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有SPF雛雞免疫試驗(yàn)均在哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的負(fù)壓隔離器中進(jìn)行。1.2抗體和疫苗免疫組化一抗（抗新城

11、疫病毒NP蛋白單克隆抗體）、rLaSota-HA（GD）,由哈爾濱獸醫(yī)研究所外來病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。1.3主要試劑DAB顯色試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司；美國ZYMED公司Sp-9000免疫組化忒劑盒,購自北京中山生物技術(shù)有限公司。2方法2.1試驗(yàn)動(dòng)物分組將24只2日齡SPF雛雞隨機(jī)平均分成2組，第1組為陰性對照組，用PBS接種;第2組為試驗(yàn)組，用rUSota-HA（GD）毒株接種（本組中免疫組化空白對照組為試驗(yàn)組組織在染色過程中用PBS代替一抗）。2.2接種分別用PBS.rLaSota-HA（GD）毒株（以效價(jià)2乂仔曰口如）經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼途徑人工免疫2日齡SPF雛雞,每只雞100ji

12、L;分別在接種后的1,3,5,10,15,18天取2只雞以心臟注氣的方式處死，取氣管放在固定液中待做電鏡觀察和H.E,染色、免疫組化染色。2.3房理診斷、尸體解制和電鏡觀察每天對各組雞觀察2次，記錄臨床癥狀，于接種后1,3,5,10,15,18天分別取2只雞進(jìn)行尸體解剖，取氣管上部大小為10nn»x10nun的組織固定在3%戊二醛中，然后置于0.1mol/L、pH值為7.4的緩沖液中4乞固定4h；l%俄酸中4弋作用30min；用PBS緩沖液連續(xù)洗6次,梯度酒精脫水，臨界點(diǎn)干燥;噴金;掃描電鏡觀察。2.4H.E.染色取氣管上部大小為16n）n）x30mm的組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24h,

13、按常規(guī)方法制作石蠟切片，H.E.染色,光鏡下觀察。2.5免疫組化染色（過釵化物酶標(biāo)記的鏈毒卵白素S-P法）分別將各組雞氣管16mmx30mm的組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24h,按常規(guī)制作石蠟切片，進(jìn)行免疫組化染色。試驗(yàn)中所用一抗為抗新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體，工作效價(jià)為1：600。將載玻片放入二甲苯（1）二甲苯（n）100%乙醇（I）一100%乙醇（H）95%乙醇85%乙醇一75%乙醇一50%乙醒,每種試劑中放10min；用純化水沖洗，PBS浸泡5min；脫蠟后用PBS溶液沖洗3遍，加入3%H2O,溶液中孵育10min；然后倒掉H2O2,在純化水中洗3次;再加入檸檬酸緩沖液，放入燒杯中在微波爐中

14、蒸煮,至沸騰時(shí)斷電，冷卻至室溫（10min）,反復(fù)蒸煮2次;冷卻至室溫后將檸檬酸緩沖液倒掉，并將載玻片置于PBS中洗2次（每次5min）；加上5%BSA封閉液.然后室溫放置20min；將載玻片上的多余液體甩去，加一抗（抗新城疫病毒NP蛋白單克隆抗體，空白對照試驗(yàn)即在組織切片上用PBS代替一抗）；加完一抗在4乞冰箱中保存過夜，放入PBS中洗3次，每次5min；加二抗（生物素標(biāo)記抗鼠IgG）,然后置于37龍溫箱中20min；加過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，放入PBS中洗3次，每次5min；加上辣根前標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，置于37乞溫箱中作用2（）min；將切片從溫箱中取出，放入PBS中洗3次

15、，每次5min；擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑（顯色劑的配制:在1mL水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻，再加1滴顯色劑C,搖勻,20-37乞保存），鏡下控制顯色時(shí)間;將顯色后的切片用清水沖洗一段時(shí)間后浸泡于蘇木精中染色；將復(fù)染后的片子置于水中沖洗，然后放入50%乙醇一75%乙醇一85%乙醇一95%乙醇一100%乙醇（I）-100%乙醇（U）二甲苯（I）一二甲苯（II）,每種試劑中放置5min；封片，鏡下觀察結(jié)果。3結(jié)果3.1電鏡觀察結(jié)果所有的試驗(yàn)雞接種后未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，也沒有明顯的呼吸道病理反應(yīng)。在PBS接種的陰性對照組可以清楚地看到氣管黏膜上皮是由纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞

16、組成的，大部分杯狀細(xì)胞處于靜止態(tài),處于分泌期的特別少，靜止態(tài)的杯狀細(xì)胞表面有顆粒狀的微絨毛和少量的球狀結(jié)構(gòu)，纖毛細(xì)胞的肝毛排列整齊（見圖1）。試驗(yàn)組從接種后的第1天開始均有纖毛細(xì)胞纖毛脫落、倒伏的現(xiàn)象（見圖2）；接種后的第3,5,7,10天纖毛脫落區(qū)域進(jìn)一步加大;從接種后的第15天開始纖毛細(xì)胞的纖毛開始恢復(fù),能看到新生的纖毛。對于試驗(yàn)組，從rdSota-HA（GD）毒株接種后的第1天開始靜止態(tài)的杯狀細(xì)胞減少,而處于分泌態(tài)的杯狀細(xì)胞開始增多（見圖3）；接種后的第3,5天氣管黏膜的杯狀細(xì)胞超常增生，數(shù)最增多，益液成分增多第10天杯狀細(xì)胞增生，破碎程度進(jìn)一步加大;從接種后的第18天開始杯狀細(xì)胞分泌程

17、度下降，輕度分泌。圖1對照組氣管黏膜(SEM,1000x)Fig1Thetrachealinthecontrolgroup(SEM,1(XX)x)圖2接種后第1天氣管黏膜（SEM,】000x）Fig2Thetrachealafter1daypostvaccation(PV)(SEM.l(XX)x)接種后第3天黏膜上皮形成空泡狀，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,黏膜表面扭曲，漿細(xì)胞浸潤,表層由數(shù)層不成熟的細(xì)胞組成，血管明顯;接種后第10天黏膜腫脹，引起腺體腔狹窄甚至閉塞;接種后第18天淋巴細(xì)胞仍有浸潤（見圖6）。圖5氣管黏膜扭曲，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞浸潤(H.E.,400x)圖6氣皆黏膜淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(

18、H.E.,200x)Fig6Thesubmucosainfiltratedbymacrophagesandlymphocytes(H.E.,20()x)圖3增生的杯狀細(xì)胞(SEM,750x)Fig3Hyperplasiaoftheglobletcells(SEM,750x)用rUSota-HA（CD）毒株接種后第1天開始能明顯地看到少玷的帶有微絨毛的球形粒子（見圖4）,基細(xì)胞大埴增生，帶有微絨毛的球形粒子大小為34pin,可能是免疫性淋巴細(xì)胞的前身，接種后第18天球形粒子基本消失。3.3免疫組化染色結(jié)果rLaSota-HA（GD）毒株接種后第1天就發(fā)現(xiàn)氣管黏膜的固有層淋巴細(xì)胞、腺體細(xì)胞呈陽性反

19、應(yīng)，褐色顆粒出現(xiàn)在胞漿內(nèi)（見圖7）。空白對照組免疫組化染色陰性，陰性對照組免疫組化染色陰性（見圖8）。圖7氣管黏膜F層有褐色顆粒(IHC.200x)Fig7Specilficstaininglocalizedinthesubmucosace!ls(IHC,200x)圖4氣管黏膜上長有微絨毛的球形粒*(SEM,7000x)Fig4Alotofglobularparticlesfoundinlocalizedareasofthetracheaepithelium(SEM,7000x)3.2光鏡觀察結(jié)果接種后第1天杯狀細(xì)胞破碎，黏膜細(xì)胞腫脹，黏膜下層淋巴細(xì)胞浸潤，巨噬細(xì)胞浸潤，黏膜扭曲，纖毛細(xì)胞脫纖

20、毛，管腔內(nèi)含有膿性纖維,黏膜下層水腫，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，淋巴細(xì)胞浸潤在血管中（見圖5）；圖8陰性對照狙氣筲黏膜(IHC,200x)Fig8NospecificsUiningincells(IHC,200x)4討論Fig5Themucosalsurfaceisdistorted.thesubmucosaisimfiltratedbymacrophages,lymphocyte(H.E.,400x)用rLaSota-HA(GD)免疫2日齡雛雞后，雛雞并沒有出現(xiàn)臨床癥狀。頃MC和IbrahimAL用新城疫病毒鼻內(nèi)接種雛雞后，第5天發(fā)現(xiàn)氣管黏膜的杯狀細(xì)胞特別活躍，接種后第7天纖毛細(xì)胞有脫纖毛現(xiàn)象。在本

21、試驗(yàn)中，接種后第1天就看到纖毛細(xì)胞有脫纖毛現(xiàn)象。這種對氣管纖毛系統(tǒng)的損害在時(shí)間E的差異可能是由于病毒的毒力不同導(dǎo)致的。對氣管黏膜系統(tǒng)的損害可能是外來病毒、細(xì)菌和刺激物共同作用的結(jié)果叩】。倉鼠氣管黏膜在受到損傷后3648h開始再生，纖毛細(xì)胞在60-96h開始恢復(fù)纖毛,120h后全部恢復(fù)。黏膜上皮細(xì)胞隨時(shí)間變化的情況同上述報(bào)道是相似的。有報(bào)道稱:錐雞通過,霧接種新城疫BI菌株能引起雛雞氣管病理組織學(xué)變化'I；受到應(yīng)激的禽類更容易受到病毒的影響，氣管黏膜的損傷更嚴(yán)重，更容易受到支原體的感染。試驗(yàn)中，纖毛細(xì)胞脫纖毛現(xiàn)象是接種rLaSola-HA(GD)后的主要反應(yīng)，氣管黏膜上皮細(xì)胞的最早反應(yīng)是

22、杯狀細(xì)胞的破碎和增生，氣管呈卡他性炎癥，黏液成分大皇出現(xiàn);黏膜下層淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，黏膜上皮細(xì)胞形成空泡狀，黏膜表面扭曲.表層由數(shù)層不成熟的細(xì)胞組成；腺體腔狹窄，甚至閉塞。新城疫病毒B1菌株接種后能發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤，這不是由于病毒感染產(chǎn)生的病理反應(yīng)，而可能是免疫反應(yīng)的表現(xiàn)。淋巴細(xì)胞浸潤說明有病毒刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。氣霧接種的錐雞氣管黏膜浸潤的淋巴細(xì)胞、氣管腺體細(xì)胞、黏膜表面細(xì)胞都是產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞。有試驗(yàn)已經(jīng)證明氣管黏膜是產(chǎn)生lg(；、IgA特別是IgA的主要場所，氣管黏膜損傷可能是黏膜纖毛防御機(jī)制的表現(xiàn),黏液成分的增多可能對外來入侵的病毒和細(xì)菌起到稀釋作用。纖毛細(xì)胞的脫纖

23、毛現(xiàn)象大大降低r黏膜對外來病毒和細(xì)菌的抵抗能力,有利于弱毒疫苗進(jìn)入體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，所以在接種后的兒天里纖毛細(xì)胞的纖毛減少。接種后第10天，在纖毛上能發(fā)現(xiàn)34Jim的球形粒子，可能是淋巴細(xì)胞的前身，也可能是機(jī)體免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。免疫組化結(jié)果表明，rLaSola-HA(CD)出現(xiàn)在固有膜的淋巴細(xì)胞、腺體細(xì)胞胞漿中，這說明其在氣管內(nèi)能明顯夏制。病毒的復(fù)制在胞漿內(nèi)進(jìn)行,接種后第1天就能檢測到病毒說明病毒的復(fù)制能力較強(qiáng)。5結(jié)論作為預(yù)防新城疫和傳染性法氏囊病的重組二聯(lián)活病毒疫苗rLaSota-HA(GD),接種后第1天免疫組化染色rlqSota-HA(GD)出現(xiàn)在固有膜的淋巴細(xì)胞、腺體細(xì)胞胞漿中，這是導(dǎo)

24、致機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)的前提條件。氣管黏膜損傷表現(xiàn)為纖毛細(xì)胞脫纖毛，杯狀細(xì)胞破碎、增生，黏液增多，淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，腺體腔閉塞，這是機(jī)體防御機(jī)制和免疫機(jī)制的表現(xiàn)。參考文獻(xiàn)：1PEETERSBPH.DELEEUW0S,KOCHG.etal.RescueofNewcastledimviscvirusfromclonedcDNA:evidencethatcleavabili-tyofthe(unionproteinisamajordeterminantforvirulenceJ.JournalofVirology,1999,73；5001-5009.2 ENGEL-HERBERTAJ,OKT

25、RUDWB,JENSP,ctal.CharacterizationofarecombinantNewcastlediseasevirusexpressingthegreenfluorewenlproteinJ.JournalofVirologicaJMethods,2002,108：19-28.3 KRISHNAMUHTHYS,HLANGZ,SAMALSK.Recovejyofavirulentstraind-NewrasllediseasevirusfromclonedcDNA:expres*sionofaforeigngeneresultsingrowthretardalionandattenuationJ,ViroJt>gy,2000,278；J68-182