丙型肝炎病毒基因疫苗研究進(jìn)展.docxVIP

1、綜述丙型肝炎病毒基因疫苗研究進(jìn)展丁宛瓊關(guān)鍵詞丙型肝炎病毒；基因疫苗；免疫效應(yīng)；作用機(jī)制；安全性中圖分類號R512.33文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號1006-172X（2009）05-0295-05丙型肝炎病毒（HCV）是輸血后肝炎的主要病原體，HCV急性感染后約50%70%以上患者發(fā)展為慢性感染，其中部分患者可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。迄今為止，對HCv慢性感染尚無高效特異性治療方法，對IFN-a的治療應(yīng)答率只有15%25%。因此，尋求一種預(yù)防和治療HCV感染的方法迫在眉睫?；蛞呙缬址Q為核酸疫苗或DNA疫苗，它是由病原體抗原的編碼基因和作為真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)粒所組成。這種DNA既是載體又能在真核細(xì)胞

2、中表達(dá)抗原，刺激肌體產(chǎn)生特異而有效的免疫應(yīng)答,可有效預(yù)防病毒、細(xì)菌和寄生蟲等所引起的疾病。DNA疫苗由于具有可誘發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答、能制備抗多價疫苗、兼有預(yù)防和治療作用等優(yōu)點(diǎn),且與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗原具有天然構(gòu)象，免疫原性良好，容易制備和運(yùn)輸,所以自上世紀(jì)90年代初問世以來，已在多種疾病的防治研究中顯示出巨大的潛力”-6】。HCVDNA疫苗是近年發(fā)展起來的新型疫苗之一，它是將HCVRNA上的某一特定片段克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中再接種到體內(nèi)，使目的基因得以表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異的體液免疫和細(xì)胞免疫，以期達(dá)到預(yù)防和清除HCV感染的目的。本文就HCVDNA疫苗的類型、免疫效

3、果的影響因素、作用機(jī)制及安全性等方面的研究進(jìn)展作一綜述。1不同類型HCVDNA疫苗的構(gòu)建11HCV核心區(qū)DNA疫苗的構(gòu)建對來自不同基因型的HCV分析發(fā)現(xiàn)，其核心區(qū)（C區(qū)）基因片段高作者單位：四川省疾病預(yù)防控制中心門診部（四川成都610041）作者簡介：丁宛瓊，女，大學(xué)本科，副主任醫(yī)師，疾病控制與治療度保守，整個序列全長573核昔酸，編碼含191個氨基酸的核心蛋白。Tokushige等將全長C區(qū)片段克隆在包含有RSV啟動子和CMV增強(qiáng)子的表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建PHCV2-2質(zhì)粒，同時構(gòu)建一個包括HCV5,NCR和C區(qū)全部序列的pHCV4-2質(zhì)粒，用磷酸鈣沉淀法分別轉(zhuǎn)染HuH-7細(xì)胞、RD細(xì)胞和&

4、;細(xì)胞系。Westernblot分析發(fā)現(xiàn)，3個細(xì)胞系中均表達(dá)3個細(xì)胞系中均表達(dá)21kd的核心蛋白。且Phv2-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白表達(dá)量明顯高于pHCV4-2。單克隆抗體檢測HCV核心蛋白為非分泌蛋白。用構(gòu)建好的質(zhì)粒肌肉注射BALB/C小鼠，小鼠對HCVC區(qū)蛋白體液免疫反應(yīng)性較低，可能和C區(qū)蛋白非分泌有關(guān)。為了評價小鼠體內(nèi)CTL活性，Tokushige還建立了表達(dá)HCV核心蛋白的同基因SP2/0骨髓瘤細(xì)胞模型。和接種pHCV4-2質(zhì)粒的小鼠相比，pHCV2-2質(zhì)粒免疫的小鼠存活率明顯增加、腫瘤的重量也明顯降低，這表明PHCV2-2能引起較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。PHCV2-2質(zhì)粒比pHCV4-2質(zhì)粒的免

5、疫效果為好,可能與Phcv2-2在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的核心蛋白能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫活性有關(guān)。Major等構(gòu)建了表達(dá)HCVC區(qū)核蛋白前58個氨基酸的質(zhì)粒DNA-PC2N,免疫Balb/c小鼠（下同），在14同內(nèi)均未出現(xiàn)抗體反應(yīng)。而用該段基因與HBV的S基因，或與前S?基因構(gòu)建嵌合DNA質(zhì)粒，用同樣方法免疫小鼠，結(jié)果均產(chǎn)生抗體反應(yīng)，且可持續(xù)18周。Lagging等用編碼整個核殼蛋白（aal-191）基因構(gòu)建成DNA疫苗肌肉注射小鼠，均能引起血清抗體、脾細(xì)胞對合成肽C7-A10的增殖反應(yīng)，且能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的殺傷活性。Ceissler等口°】認(rèn)為，HCVC區(qū)核殼蛋白能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生廣泛的

6、體液和細(xì)胞免疫，這對清除HCV感染非常重要。在先前研究基礎(chǔ)上，用HCVC區(qū)和HBV的前&、前S2、S基因構(gòu)建了9種不同重組體，轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系，然后再免疫小鼠。結(jié)果顯示，HCVC區(qū)蛋白及不同嵌合蛋白均可在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)，并可激發(fā)和增強(qiáng)小鼠CD4+T和CDT對HBV和HCV融合蛋白反應(yīng)，免疫強(qiáng)度與CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的Th】樣細(xì)胞因子水乎有關(guān)"°】o1.2HCV包膜區(qū)DNA疫苗的構(gòu)建HCV包膜區(qū)(E區(qū))全長574-2427nt；分El區(qū)(574-1149nt)和E2(l150-2427nt),分別編碼El、E2糖蛋白,其在病毒結(jié)合靶細(xì)胞方面起重要作用。Rosa11通過

7、NOB(neutralizationofbinding)定量試驗證實，HCVE2上至少存在可編碼2種中和抗原從的基因片段，其一是位于E2區(qū)N端的高變區(qū)(highvaribleregion,HRV),另一片段獨(dú)立于HRV以外，編碼抗原能引起不同型HCV的交叉免疫反應(yīng)。Lee等用編碼192-364、384-719氨基酸殘基的E1區(qū)和E2片段分別和HSV-I編碼糖蛋白D的基因片段連接后克隆到pTV2質(zhì)粒中，構(gòu)建PTv2-SElt和pTV2-SE2t疫苗。脛前肌注射Buffalo小鼠，在小鼠體內(nèi)分別產(chǎn)生抗體和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，且pTV2-SE2t疫苗的免疫原性高于pTV2-SElt。為研究HCVE2片

8、段不同功能區(qū)的免疫原性，Nakano等將HCVE2片段分成五個功能區(qū)，即E2A(1150-1332m)、E2B(1333-1512nt)、E2C(1513-1668nt)、E2D(1669-1827nt)、E2E(18282022nt)、將其分別和編碼HBV表面抗原的基因片段融合，以CMV為啟動子構(gòu)建PS2E2A2E；五個DNA疫苗?；驑屍は伦⑸銪ALB/C小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCVE2區(qū)有三個限制性免疫原性功能區(qū)，它們分別是E2A(aa384-443),E2C(aa504-554)和E2E(aa609-674)。用構(gòu)建的重組體以不同方式免疫小鼠，結(jié)果顯示，用基因槍從皮內(nèi)注射(ie)比從肌肉注射(

9、i.m)產(chǎn)生抗體滴度高100倍，這可能與皮內(nèi)有更多的朗罕細(xì)胞，能更有效的將表達(dá)的抗原遞呈給免疫系統(tǒng)有關(guān)。此外，E2區(qū)抗體能與不同HCV亞型El、E2結(jié)合，顯示E2區(qū)的抗體可能有交叉中和作用。而Howard14在研究中指出在HCVE2區(qū)編碼的aa581-591和aa590-603是兩個能和HCV人抗體反應(yīng)的重要抗原表位。同年，Tedeschi15將E2(l432-2451nt)克隆入Pdr2質(zhì)粒，構(gòu)建pDR2疫苗,接種BALB/C小鼠也證實了小鼠能產(chǎn)生對HCV有重要中和作用的特異性抗體。Foomillier等商以HCV基因型E2區(qū)不同基因片段構(gòu)建了3種不同重組體，用im或i.m加ie等不同途徑免

10、疫小鼠，.抗體陽性率在60%100%之間,其中以i.m加i.e方法效果最好，i.e方法其次，主要是IgG*IgG2b,沒有測出IgG,顯示出Thl樣反應(yīng)，鼠脾細(xì)胞還可分泌IFN-7,但未檢出IL-4。隨著對HCVE區(qū)DNA疫苗研究的深入，提示其可能是未來HCVDNA疫苗研究的熱點(diǎn)之一。1.3 HCV結(jié)構(gòu)區(qū)DNA疫苗的構(gòu)建1997年Saito等口7】將編碼結(jié)構(gòu)區(qū)(c+El+E2)基因片段(3412449nt)克隆入含CMV啟動子的pRc載體中，構(gòu)建HCV結(jié)構(gòu)區(qū)DNA疫苗，通過真核細(xì)胞體外表達(dá)和免疫小鼠研究證實，不僅能在人類293、BALB/3T3、COS-1中表達(dá)C、El、E2蛋白，而且還能誘導(dǎo)

11、BALB/C小鼠產(chǎn)生抗體和特異性CTL的活性。In-chauspe等招刃用HCVC+E2序列構(gòu)建的質(zhì)粒DNA疫苗免疫小鼠能誘導(dǎo)特異性的CTL活性、抗-C和抗-E2抗體的免疫應(yīng)答和Thl為主的增殖反應(yīng)。Duenas-Carrere等事】用HCVC+E2序列構(gòu)建的質(zhì)粒plDKE2DNA疫苗免疫小鼠和猴也能誘導(dǎo)較強(qiáng)的特異性的CTL活性、抗-C和抗-E2抗體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。1.4 HCV非結(jié)構(gòu)區(qū)(NS區(qū))DNA疫苗的構(gòu)建1996年，Kurokohchi等勺證實在HCVNS3存在一個CTL表位，其最小單位由10肽組成，推測其可作為HCVDNA疫苗構(gòu)建的有效組分。但近來對HCVNS區(qū)疫苗構(gòu)建的報道研究較少

12、，可能與NS區(qū)編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白抗原性及誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)較弱有關(guān)。2HCVDNA免疫效應(yīng)的影響因素2.1細(xì)胞因子細(xì)胞因子可通過不同的作用環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)和增強(qiáng)HCVDNA疫苗的免疫效應(yīng)而發(fā)揮佐劑作用。Ceissler等口?！堪l(fā)現(xiàn)單獨(dú)用編碼HCVC區(qū)基因構(gòu)建的PHCV2-2疫苗免疫動物時，雖然機(jī)體產(chǎn)生有效的CTL反應(yīng)，但體液應(yīng)答和Th細(xì)胞的增殖作用較弱。當(dāng)用編碼GM-CSF、IL-2的質(zhì)粒和PHCV2-2聯(lián)合免疫時，抗HCV核心蛋白的血清轉(zhuǎn)化率從單獨(dú)pH-CV2-2免疫時的40%提高至80%0進(jìn)一步研究指出，聯(lián)合接種IL-2和GM-CSF質(zhì)粒能增進(jìn)小鼠既CD"炎性細(xì)胞的增殖和CD“

13、抗HCV核心蛋白CTL的活性；而僅聯(lián)合接種IL-4質(zhì)粒，能促使Th細(xì)胞向ThO亞型的分化，且能抑制HCV核心蛋白特異性CTL活性。'Lee等用編碼HCVE1或E2蛋白的基因和編碼GM-CSF基因融合或非融合表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，融合表達(dá)DNA疫苗的免疫效果比兩個獨(dú)立表達(dá)的DNA疫苗免疫效果好，這可能與融合表達(dá)后GM-CSF的生物學(xué)活性改變有關(guān)。2.2核昔酸的序列HCVDNA疫苗的構(gòu)建大都臺有氨基糖貳類抗生素（如氨苯青霉素）抗性基因，這主要是因為氨苯青霉素抗性基因中存在著免疫刺激元件（ISS）O研究發(fā)現(xiàn)，ISS實際上是段含有CpG兩側(cè)分別為2個瞟吟和2個嗟呢的特定核昔酸序列，如5

14、9;-GACG-TC-3'、5-AGCGCT-3'、5'-AACGTT-3'。已證明ISS能誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFN-Y、Thl分化增殖、APC±協(xié)同刺激因子的表達(dá)和在不同細(xì)胞因子環(huán)境下B細(xì)胞獨(dú)特性的轉(zhuǎn)換】oSato等叫發(fā)現(xiàn)，用卡那霉素抗性基因構(gòu)建的DNA疫苗免疫原性較弱。上述結(jié)果表明，質(zhì)粒DNA±的不同抗性基因在DNA免疫中也發(fā)揮了佐劑作用。2.3免疫途徑和免疫方式免疫接種時，由于免疫途徑和免疫方式不同，可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不同類型、不同強(qiáng)度的免疫應(yīng)答。Nakano等方用編碼HCVE2蛋白基因構(gòu)建PCIE2t疫苗，用基因槍分別皮內(nèi)和服內(nèi)注射BALB

15、/C小鼠，結(jié)果皮內(nèi)注射抗體效價是肌內(nèi)注射的100倍，且有較高的血清轉(zhuǎn)換率，這可能與表皮內(nèi)含有大量的Langerhans細(xì)胞，其在抗原遞呈和免疫應(yīng)答中起重要的作用有關(guān)。Feltquate1251的研究表明，不同的免疫方式會影響免疫應(yīng)答的類型。用編碼同一抗原的基因疫苗以DNA鹽水注射和基因槍2種方式免疫接種，結(jié)果鹽水注射DNA疫苗顯示以誘生Thl為主的增殖反應(yīng)，產(chǎn)生抗體為IgG2&型；而基因槍接種以誘生Th2為主的增殖反應(yīng)，抗體主要為IgGl型。2.4其他因素有學(xué)者報道，構(gòu)建不同編碼基因融合DNA疫苗能增強(qiáng)疫苗的免疫效果。Inchauspe在編碼HCV核心蛋白1-58位氨基酸的DNA序列3

16、,端串聯(lián)HBsAg基因構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒，其表達(dá)產(chǎn)物為分泌型融合蛋白，誘生抗體應(yīng)答效力明顯提高】。此外，在構(gòu)建疫苗時，不同的啟動子類型、免疫不同遺傳背景的小鼠，都可影響免疫效果。3HCVDNA疫苗的作用機(jī)制31不同免疫方式免疫機(jī)制的探討目前，DNA疫苗接種方式主要有2種，一是鹽水注射，另一是基因槍接種，其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型亦不同。鹽水注射DNA疫苗時：皮膚或肌肉的細(xì)胞外組織間隙中存在大量的DNA質(zhì)粒，由于質(zhì)粒中多含有未甲基化的CpG回文結(jié)構(gòu),可誘導(dǎo)NK細(xì)胞、T細(xì)胞增殖產(chǎn)生Thl型細(xì)胞因子，如IL-12、IFN-Y等勺；組織細(xì)胞中的APC細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）攝人少量DNA質(zhì)粒，可以激活核因子NF-kB

17、誘導(dǎo)IL-2、IL-12等細(xì)胞因子的表達(dá)組織細(xì)胞（如角質(zhì)細(xì)胞、肌細(xì)胞）中攝人的DNA質(zhì)粒在其細(xì)胞漿中表達(dá)，并經(jīng)其內(nèi)蛋白酶體降解后和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的MHC-I類分子結(jié)合，遞呈至CD+8T細(xì)胞，同時間接激活Thl亞群,誘生Thl型細(xì)胞因子和抗體12產(chǎn)生宛29】。而基因槍接種時，由于能將外源基因直接注人靶細(xì)胞內(nèi)，質(zhì)粒在靶細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（EB）內(nèi)膜上大量表達(dá)形成自噬體，后者和細(xì)胞漿中的胞內(nèi)體（endosome）或溶酶體（lysosome）融合，通過MHC-H類途徑激活CD”T細(xì)胞，誘導(dǎo)IL-4、IL10等細(xì)胞因子和IgGl、IgE的產(chǎn)生。Chen等通過構(gòu)建pCMV980質(zhì)粒（含編碼HCV1-980aa的基

18、因片段）體外轉(zhuǎn)染EB病毒轉(zhuǎn)化的B-LCLs（BLymphoblastiodCellLines）證實,B-LCLs表達(dá)的內(nèi)源性抗原是以MHC-II類途徑誘導(dǎo)CDMT細(xì)胞的活化，且活化過程需要B7/BB1的參與。3.2免疫位點(diǎn)處參與免疫應(yīng)答各細(xì)胞功能的探討研究發(fā)現(xiàn)，在DNA疫苗的接種位點(diǎn)，不同的細(xì)胞行使不同的功能。KIinman等】把接種位點(diǎn)細(xì)胞分為二類：一類是可快速遷移的細(xì)胞（如一些髓源性的APC細(xì)胞），另一類是不可遷移的組織細(xì)胞。它們在免疫應(yīng)答時：可快速移動的細(xì)胞（如DC細(xì)胞）在初次應(yīng)答中起重要作用，Condon32也證實免疫接種位點(diǎn)處被轉(zhuǎn)染的DC細(xì)胞在24h內(nèi)可從皮膚移至引流區(qū)淋巴結(jié)；機(jī)體免

19、疫應(yīng)答的強(qiáng)弱和非遷移的表達(dá)抗原的組織細(xì)胞關(guān)系密切；可遷移細(xì)胞負(fù)責(zé)機(jī)體的免疫記憶。4HCVDNA疫苗的安全性及前景目前，從國內(nèi)外學(xué)者在HCVDNA疫苗的構(gòu)建、免疫效應(yīng)及安全性方面做的大量研究來看，雖未發(fā)現(xiàn)因使用DNA疫苗而引發(fā)腫瘤和自身免疫功能紊亂的報道，但也有若干問題值得關(guān)注：HCVDNA疫苗引起的機(jī)體免疫應(yīng)答能否起到預(yù)防和清除HCV感染作用；鑒于細(xì)胞免疫應(yīng)答可介導(dǎo)組織病理性損傷，HCVDNA疫苗誘發(fā)的CTL反應(yīng)能否引起肝臟的病理學(xué)變化;.由于免疫對抗作用的限制，尚不能構(gòu)建來自多個不同HCV基因型的融合DNA疫苗；HCVDNA疫苗能否引起機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受；由于目前的研究大多僅局限于小鼠，其作用

20、機(jī)制和靈長類動物之間還有很大的差異等等5問題與對策綜上所述，HCVEl.E2蛋白疫苗免疫黑猩猩后，在抗體達(dá)到高峰時，可預(yù)防同源性HCV感染，但能否預(yù)防異源性HCV感染以及當(dāng)抗體滴度下降時是否還能預(yù)防同源性感染這些問題尚待研究?？笶2抗體，特別是抗HVR1抗體（NOB）具有中和HCV對靶細(xì)胞的結(jié)合作用，預(yù)示著有中和同源性HCV感染作用，但這一中和抗體具有高度特異性，對突變的HCV及HCV準(zhǔn)種株沒有中和作用，而且蛋白類疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能維持多久，也不甚清楚瑚。以E2區(qū)為靶抗原的DNA疫苗構(gòu)建物可有效地誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的能力較弱；以C區(qū)為靶抗原的DNA疫苗誘導(dǎo)CTL反應(yīng)的能力較強(qiáng)，激發(fā)

21、抗體反應(yīng)能力卻不如還E2靶抗原。C區(qū)基因與HBV包膜區(qū)基因結(jié)合疫苗，以及與表達(dá)Thl樣細(xì)胞因子（IL-2、IFN-7等）基因結(jié)合構(gòu)建的嵌合DNA疫苗免疫小鼠，既可產(chǎn)生高滴度的抗體反應(yīng)，又可誘導(dǎo)明顯的脾細(xì)胞對HCV抗原增殖反應(yīng)和CTL殺傷活性1項，但這些研究結(jié)果有些還不能得出滿意的解釋。HCV疫苗研究在現(xiàn)有基礎(chǔ)上要有新的突破，至少應(yīng)解決或著重研究以下幾個問題： 確定合理的HCV靶抗原。C區(qū)基因高度保守，在不同基因型和亞型HCV株之間，大約有95%的氨基酸序列具有同源性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉免疫防護(hù)作用。HVR1蛋白可誘導(dǎo)高滴度中和抗體，兩者結(jié)合能否作為較理想的靶抗原四？是否需要與HBV包膜基因或Thl

22、樣細(xì)胞因子基因組合構(gòu)建嵌合DNA疫苗？與HBV前S1、前S2或S結(jié)合形成的DNA疫苗免疫小鼠可產(chǎn)生高效應(yīng)的免疫反應(yīng)，一種疫苗可起到2種防護(hù)作用。但使用HBV膜蛋白基因，可能會加重人們一直擔(dān)心的DNA與宿主基因整合問題；細(xì)胞因子水平可調(diào)節(jié)局部質(zhì)粒DNA表達(dá)蛋白對宿主的免疫原性，增強(qiáng)DNA疫苗效應(yīng)，但長期表達(dá)細(xì)胞因子，是否會導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受？ HCV疫苗是以蛋白類疫苗為主，還是以DNA疫苗為主，或兩者兼而有之？以蛋白類為主的HCV疫苗誘導(dǎo)的中和抗體能持續(xù)多長時間？能否對異源性HCV感染起到防護(hù)作用？能否誘導(dǎo)CTL反應(yīng)對慢性HCV感染起到治療作用？以DNA為主的疫苗，雖然能起到預(yù)防和治療作用，但DN

23、A疫苗的機(jī)制以及最令人擔(dān)心的安全性問題能否得到解決，DNA疫苗在體內(nèi)長期表達(dá)蛋白會對機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生何種影響？ 除了黑猩猩外，是否還有其他較理想的臨床前試驗動物模型？上述問題應(yīng)認(rèn)真研究和解決，Lohmann等俄成功地在人肝癌細(xì)胞進(jìn)行了HCVRNA的復(fù)制試驗，這對體外進(jìn)一步研究HCV生物學(xué)特性、抗病毒藥物以及病毒疫苗提供了良好的方法?？傊?，在HCVDNA疫苗研制方面還有大量的理論和實驗工作要做，隨著研究的不斷探人，我們更應(yīng)持細(xì)心、樂觀的態(tài)度去研究HCVDNA疫苗的各個環(huán)節(jié)，以保證其研究工作的有效進(jìn)展。5參考文獻(xiàn)汪毅，姚鵬.丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)組及其抗原表位的研究進(jìn)展J.國外醫(yī)學(xué)病毒學(xué)分冊.2000

24、.7(1)：32-34.1 崔福德.藥劑學(xué)M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1999.2 VinodL,JefferyB,StevenG,etal.ADNAcontrolled-releasecoatingforgenetransfer：transfectioninskeletalandcardiacmuscleJ.Pham,1998,87(11):1347-1350.3 ColinWP,PaulL,BeverleyJ,etal.Polycation-DNAcomplexesforgenedelivery:Acomparisonofthebiopharma-ceuticalpropertiesofca

25、tionicpolypeptidesandcationiclipidsJ.ControlledRelease,1998,53：289-299.4 ChooQL,KdaoG,WeinerAJ,etal.IsolationofcDNAclonederivedfromablood一vomenon一A,non一BviralhepatitisgenomeJ.Science,1989,244(4902):359.5 WolffJA,MaloneRW,WilliamsP,etal.DirectgenetransferintomousemuscleinvivoJ.Science,1990,247：1465-1

26、468.6 TokushigeK,WakitaT,PachukC,etal.ExpressionandImmuneResponsetoHepatitisCVirusCoreDNA-BasedVaccineConstructsJ.Hepatology51996,24：14-20.7 MajorME,VitvitskiL,MinkMA,etaZ.DNA-basedimmunizationwithchimericvectorsfortheinductionofimmuneresponsesagainstthehepatitisCvirusnucleocapsidJ.JVirol,1995,69：57

27、98-5805.8 LaggingLM,MeyerK,HoftD,etal.ImmuneresponsetoplasmidDNAencodingthehepatitisCviruscoreproteinJ.JVirol,1995,69：5859-5863.9 GeisslerM,GescinA,TokushigeK,etal.EnhancementofceDularandhumoralimmuneresponsetohepatistisCvimscoreproteinusingDNA-basedvaccinesaugmentedwithcytokine-expressingplasmidJ.J

28、Immunol,1997,158：1231-1237.10 RosaD,CampagnoliS,MureltoC,etaZ.AquantitativetesttoestimaticneutralizingantibodiestotheHepatitisCVirus：Cytofluorimetricassessmentofenvelopeglycoprotein2BindingtotargetcellsJ.ProcNatlAcadSciUSA,1996,93：1759-1763.11 LeeSW,ChoJH,SungYC.OptimalInductionofHepatitisCVirusEnve

29、lopespecificimmunitybyBicstronicPlasmidDNAInoculationwithGranulocyte-macrophageColony-StimulatingFactorJGene.JVirol,1998,72：8430-8436.12 NakanoI,MaertensG,MajorME,etal.ImmunizationwithPlasmidDNAencodingHepatitisCVirusEnvelopeE2antigenicDomainsInducesantibodieswhoseimmunereactivityislinkedtotheinject

30、ionmodeJ.JVirol,1997,71:7101«7109.13 HowardCR,GrayL,D'MelloF,etal.NucleicacidvaccineagainstHepatitisvirusesJ.Dev一Biol-Stand,1998,92：157-162.14 FoumillierA,NakanoI,VitvitskiL,etal.ModulationofimmuneresponsetohepatitisCvirusenvelopeE2proteinfollowinginjectionofplasmidDNAusingsingleofcombinedd

31、eliveryroutesJ.Hepatol,1998,28：237-244.15 LiuJ,ZhuL,ZhangX,etal.Expression,purification,immunologicalcharacterizationandapplicationofeE-scherichiacoli-derivedhepatitisCvirusE2proteinsJ.BiotechnologyandAppliedBiochemistry,2001,34(2)：109-119.16 SaioT,ShermanGJ,KurokehchiK,etal.PlasmidDNA-basedimmuniza

32、tionforhepatitisCvimsstructuralprotein:ImmuneresponsesinmiceJ.Gastroenterology,1997,112：132M330.17 InchauspeG,MajorME,NakanoL,etal.DNAvaccinationfortheinductionofimmuneresponsesagainsthepatitisCvirusproteinJ.Vaccine,1997,15:853-856.18 InchauspeG,MajorME,NakanoL,etal.Responsesa-gainsthepatitisCviruss

33、tructuralproteinfollowinggeneticimmunizationJ.Dev-Biol-Stand,1998,92；163-168.19 DuenasC,Santiago,VinaA,etal.ImmunizationwithaDNAvaccineencodingthehepahtisCvirusstructuralantigenselicitsaspecificimmuneresponseagainstthecapsidandenvelopedproteininrabbitsandMacacairus(crab-eatingmacaquemonkeys)J.Biotec

34、hnologyandAppliedBiochemistry,2004,39(2)：249-255.21DuenasC,Santiago,AlvarezL,etal.EnhancementoftheimmuneresponsegeneratedagainsthepatitisCvirusenvelopeproteinafterDNAvaccinationwithpolyprotein_encodingplasmidsJ.BiotechnologyandAppliedBiochemistry,2002,35(3)：205-212.22 KurokohchiK,AkatsukaT,Pendleton

35、CD,etal.Useofrecombinantproteintoidentifyamotif-negativehumancytotoxicT一cellepitopepresentedbyHLA-A2intheHepatitisCvirusNS3regionJ.JVirol1996,70：232-240.23 DansHL,WeerantaR,WaldschmidtTJ,etal.CpGDNAisapotentenhancerofspecificimmunityinmiceimmunizedwithrecombinantHepatitisBsurfaceantigenJ.JImmunol,19

36、98,160：870-876.24 SatoY,RomanM,RazE,etal.ImmunostimulatoryDNAsequencesforeffectiveintradermalgeneimmunizationJ.Science,1996,273:352-354.25 FeltquateDM,HeaneyS,WebsterRG,etal.DifferentThelpercelltypesandantibodyisotypesgeneratedbysalineandgenegunDNAimmunizationJ.JImmunoly1997,158：2278-2284,InchaupeG,

37、VitritskiL,MajorME.PlasmidDNAexpressingasecretedoranonsecretedfbnnofHepatitisCVirusnu-cleocapid:ComparativestudiedofantibodyandThelperresponsesfollowinggeneticimmunizationJ.DNACellBiol,1997,16：185495.27StaceyKJ.MacrophagesingestandardactivatedbybacterialDNAJ.JImmunol,1996,157：2112-2116.28 HsuSC,Scha

38、deckES,DelmadA,etal.LinkageofafusionpeptidetoaCTLepitopefromthenucleoproteinofmeaslesvirusenablesincorporationintoISCOMSandinductionofCTLresponsesfollowingintranasalimmunization.Vaccine,1996,14：1159.29 HiceCE,QiuH,ChendPD,etal,CpmparisionofadjuvantformulationforcytotoxicTcellsinstructionusingsyntheticpeptidesJ.Vaccine,1996,14：142.30 ChenM,ShiraiM,