一株草甘膦降解菌分離鑒定及其降解特性研究

1、第3期一株草甘膦降解菌分離鑒定及其降解特性研究葉明,陳九山,姚曉慶(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,安徽合肥230009摘要:從長(zhǎng)期受草甘膦污染的土壤中篩選出10株草甘膦降解菌,其中A5菌株對(duì)草甘膦的降解率最高,經(jīng)鑒定該菌株屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter 。對(duì)A5菌株進(jìn)行降解特性研究,結(jié)表明,該菌株降解草甘膦最適條件為:草甘膦600mg/L ,葡萄糖10g/L ,NaCl 0.5g/L ,pH 6.5,32。在最適降解條件下,該菌株在72h 時(shí)對(duì)草甘膦的降解率達(dá)94.2%。關(guān)鍵詞:草甘膦;節(jié)桿菌屬;降解特性中圖分類號(hào):X172文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1003-6504(200903-0

2、039-03Isolation and Identification of a Gyphosate-degrading Strain andIts Degradation CharacteristicsYE Ming ,CHEN Jiu-shan ,YAO Xiao-qing(School of Biotechnology and Food Engineering ,Hefei University of Technology ,Hefei 230009,China Abstract :10gyphosate degradable strains were isolated from cont

3、aminated soil by gyphosate ,in which strain A5displayed the highest degradation.It was identified as Arthrobacter .Optimal conditions for gyphosate degradation of strain A5was gyphosate 600mg/L ,glucose 10g/L ,NaCl 0.5g/L ,pH 6.5and 32.Under the best degradation ,degradation rate of gyphosate in 72h

4、 was above 94.2%.Key words :gyphosate ;Arthrobacter ;degrading characteristics草甘膦是一種高效、低毒的有機(jī)磷類除草劑,化學(xué)名稱為N-膦酸甲基-甘氨酸,商品名為農(nóng)達(dá),但是長(zhǎng)期施用對(duì)非靶標(biāo)生物和環(huán)境均造成不可低估的破壞作用,尤其是對(duì)水生生物及土壤微生物等具有較強(qiáng)毒害作用1-2。多年來(lái),草甘膦使用之后的環(huán)境效應(yīng)及其修復(fù)技術(shù)越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注3-6。本研究從長(zhǎng)期施用草甘膦的土壤中分離出草甘膦高效降解菌,并對(duì)其降解特性進(jìn)行研究,以期為草甘膦的生物降解與污染土壤的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1土壤樣品合肥市七里塘鎮(zhèn)

5、和文昌村長(zhǎng)期施用草甘膦農(nóng)藥的污染土壤。1.2培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L :KH 2PO 40.5,K 2HPO 41.5,NaCl 0.5,MgSO 4·7H 2O 0.5,CaCl 20.04。1.3試劑市售10%草甘膦水劑(安徽錦邦化工股份有限公司生產(chǎn)。 1.4降解菌分離與純化將土壤樣品進(jìn)行風(fēng)干、去雜、磨細(xì)、混勻,用無(wú)菌水溶解,系列稀釋,分別涂布在含有800mg/L 草甘膦的基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上,30下培養(yǎng)3d ,挑取單菌落,反復(fù)劃線分離純化,接入斜面于冰箱4保存。1.5菌株鑒定依據(jù)常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)7方法進(jìn)行。1.6草甘膦含量測(cè)定依據(jù)文獻(xiàn)8所述方法進(jìn)行。1.7菌體生物量測(cè)定用721

6、分光光度計(jì)在600nm 波長(zhǎng)處的吸光度(OD表示。1.8優(yōu)勢(shì)菌最適生長(zhǎng)條件確定分別將優(yōu)勢(shì)菌置于不同的草甘膦濃度、pH 、溫度、不同葡萄糖濃度和不同NaCl 濃度等條件下進(jìn)行培養(yǎng),測(cè)定其生物量與草甘膦的降解率,3次重復(fù)。2結(jié)果與分析2.1菌株的篩選通過(guò)4次富集培養(yǎng),共分離篩選到10株能以草收稿日期:2008-01-03;修回2008-03-20基金項(xiàng)目:安徽省年度重點(diǎn)計(jì)劃項(xiàng)目資助(07020303053作者簡(jiǎn)介:葉明(1959-,男,教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事微生物資源與應(yīng)用研究,(電子信箱forevercredit 。Environmental Science &Technolo

7、gy第32卷第3期2009年3月Mar.2009第32卷 甘膦為唯一碳氮源的菌株,編號(hào)為A1A10,分別測(cè)定其降解率,其結(jié)果見表1。 由表1可以看出,菌株A5對(duì)草甘膦的降解率明顯高于其它菌株,對(duì)草甘膦的降解率達(dá)到82.4%,故選擇A5菌株為出發(fā)菌株。2.2A5菌株的鑒定通過(guò)常規(guī)細(xì)菌學(xué)鑒定,A5菌株的生理生化反應(yīng)結(jié)果為:氧化酶陰性,接觸酶陽(yáng)性,MR 為陰性,硝酸鹽還原陽(yáng)性,VP 反應(yīng)為陰性,吲哚反應(yīng)為陰性,淀粉水解陽(yáng)性,不水解明膠,賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性,鳥氨酸脫羧酶陽(yáng)性,苯丙氨酸脫氨酶為陰性,對(duì)照常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè),初步鑒定A5菌株為節(jié)桿菌屬(Arthrobacter 。2.3A5菌株最適生長(zhǎng)條件

8、的確定以草甘膦為唯一碳氮源,分別將A5菌株置于不同草甘膦濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,30培養(yǎng)72h 時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度及草甘膦降解率,結(jié)果見圖1。 由圖1可以看出草甘膦濃度在200600mg/L 時(shí),隨著草甘膦濃度的增加,A5菌株生物量也同步增加,草甘膦降解率也隨之升高,當(dāng)草甘膦的濃度達(dá)到600mg/L 時(shí),其降解率最高。但當(dāng)草甘膦濃度在600900mg/L 時(shí),隨著草甘膦濃度的增加,分別調(diào)整基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH 為5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,將A5菌株接種于600mg/L 草甘膦的培養(yǎng)基中置于30培養(yǎng)72h 時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光度及菌株對(duì)草甘膦的降解率,結(jié)果見圖2。由圖2可知

9、,當(dāng)pH 在5.56.5時(shí),隨著發(fā)酵液pH當(dāng)pH 在6.58.5時(shí),將A5菌株置于草甘膦濃度為600mg/L ,pH 值為6.5的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別于26,28,30,32,34,36和38條件下培養(yǎng)72h 時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光度及菌株對(duì)草甘膦的降解率,結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出在2632時(shí),隨著溫度的升高,A5菌株生物量逐漸增加,草甘膦降解率也隨之升高,當(dāng)溫度升到32時(shí),草甘膦降解率達(dá)到最大。但在3238時(shí),隨著溫度的升高,A5菌株生物量逐漸減少,草甘膦的降解率隨之降低。由此可知,A5菌株降解草甘膦的最適溫度為32。葡萄糖作為微生物最重要的碳源之一,我們?cè)噲D通過(guò)添加葡萄糖來(lái)提高菌株生物量,從

10、而提高草甘膦的降解率,所以將A5菌株置于草甘膦濃度為600mg/L ,pH 值為6.5,溫度為32,調(diào)節(jié)葡萄糖濃度分別為0,5,10,15,20g/L ,72h 時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光度及菌株對(duì)草甘膦的降解能力,結(jié)果如圖4。表1草甘膦降解菌的降解率Table 1The degradation efficiency of gyphosate strains82.4A1042.6第3期由圖4可以看出,當(dāng)葡萄糖濃度在010g/L時(shí),隨著葡萄糖濃度的升高,A5菌株生物量逐漸增加,當(dāng)葡萄糖濃度為10g/L時(shí),草甘膦降解率最高達(dá)到92.3%。但當(dāng)葡萄糖濃度在1020g/L時(shí),隨著葡萄糖濃度的升高,菌株生物量逐

11、漸減少,草甘膦降解率也隨之降低。由此可知,A5菌株降解草甘膦的最適葡萄糖濃度為10g/L。將A5菌株置于草甘膦濃度為600mg/L,pH值為6.5,溫度為32,葡萄糖濃度為10g/L,然后分別加入NaCl濃度為0,0.2,0.5,0.8,1.0g/L,72h時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光度及菌株對(duì)草甘膦的降解率,結(jié)果見圖5。由圖5可以看出,當(dāng)NaCl濃度在00.5g/L時(shí),隨著NaCl濃度的升高,菌株的生物量逐漸增加,草甘膦降解率隨之升高,當(dāng)NaCl濃度為0.5g/L時(shí),草甘膦降解率最高達(dá)到94.2%。但當(dāng)NaCl濃度在0.51.0g/L 時(shí),隨著NaCl濃度的升高,菌株生物量逐漸增加,草甘膦降解率也隨之

12、降低。由此可知,A5菌株降解草甘膦的最適NaCl濃度為0.5g/L。3小結(jié)(1從土壤中篩選得到1株降解草甘膦能力較強(qiáng)菌株A5,被初步鑒定為節(jié)桿菌屬(Arthrobacter。(2菌株A5降解草甘膦的最佳條件為草甘膦600mg/L,葡萄糖10g/L,NaCl0.5g/L,pH6.5,32。(3本研究分離得到的節(jié)桿菌屬(Arthrobacter中的A5菌株,在72h時(shí)對(duì)草甘膦的降解率達(dá)94.2%,與石成春等9分離得到的曲霉B12菌株對(duì)草苷膦的降解率基本接近。因此,該菌株可作為草甘膦農(nóng)藥的環(huán)境毒理與生物降解的研究材料,具有潛在的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1Alejandro P V,Gildal M,Lui

13、s H E,et al.Cloning andsequencing of the genes involved in glyphosate utilization by Pseudomonas pseudomalleiJ.Applied and Environmen-tal Microbiology,1995,61(2:538-543.2Suna Y C,Yan L,Hai Z G,et al.Reconstitution of theenzyme A roA and its glyphosate to lerance by fragment complementationJ.FEBS Let

14、ters,2006,580:1521-1527. 3Araujo A S F,Monteiro R T R,Abarkeli R B.Effect ofglyphosate on the microbial activity of two Brazilian soils J.Chemosphere,2003,52:799-804.4Stephan Brosillon,Dominique Wolbert,Marguerite Lemasle,et al.Chlorination kinetics of glyphosate and its by-products modeling approac

15、hJ.Water Research,2006,40:2113-2124.5Busse Man D,Ratclif Alice W,Shestak Carol J,et a1.Glyphosate toxicity and the efects of long-term vegetation control on soil microbial communitiesJ.Soil Biology and Biochemistry,2001,33:1777-1789.6S A E Kools,M van Roovert,C A M van Gestel,et al.Glyphosate degrad

16、ation as a soil health indicator for heavy metal polluted soilsJ.Soil Biology and Biochemistry,2005, 37:1303-1307.7東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)M.北京:科學(xué)出版社,2001:354-385.Dong Xiu-zhu,Cai Miao-ying.Identifying Familiar Bacteri-aM.Beijing:Science Press,2001:354-385.(in Chinese 8董文庚,陳學(xué)誠(chéng),郎志敏,等.吸光光度法測(cè)定廢水中草甘膦J.理化檢驗(yàn)化學(xué)分冊(cè),1997,33(8:347-348.Dong Wen-geng,Chen Xue-cheng,Lang Zhi-min,et al.The determination of glyphosate in wastewater by spec-trophotometryJ.Physical Testing and Chemical Analysis Part B:Chemical Analysis,1997,33(8:347-348.(in C