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1、實驗十、血液轉(zhuǎn)氨酶(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)活力的測定(實驗:肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測定)(本實驗分2個實驗完成:一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 二、測酶活力和總結(jié)?;蚓妥龆涂梢裕灸康暮鸵蟆?、 了解轉(zhuǎn)氨酶在代謝過程中的重要作用及其在臨床診斷中的意義,2、 學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)氨酶活力測定的原理和方法。3、 熟悉分光光度計的使用?!驹怼可矬w內(nèi)廣泛存在的氨基移換酶也稱轉(zhuǎn)氨酶,能催化-氨基酸的-氨基與-酮基酸的-酮基互換,在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中間代謝過程中有重要作用。轉(zhuǎn)氨酶的最適pH接近7.4,它的種類甚多,其中以谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱谷草轉(zhuǎn)氨酶)和谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶)的活力最強。它們催
2、化的反應(yīng)如下。正常人血清中只含有少量轉(zhuǎn)氨酶。當(dāng)發(fā)生肝炎,心肌梗死等病患時,血清中轉(zhuǎn)氨酶活力常顯著增加,所以在臨床診斷上轉(zhuǎn)氨酶活力的測定有重要意義。測定轉(zhuǎn)氨酶活力的方法很多,本實驗采用分光光度法。谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用于丙氨酸-酮戊二酸后,生成的丙酮酸與2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙。丙酮酸2,4-二硝基苯腙加堿處理后呈棕色,其吸收光譜的峰為439530nm,因此在波長520nm處吸光度度增加的程度與反應(yīng)體系中丙酮酸與-酮戊二酸的摩爾比基本呈線性關(guān)系,故可藉可用分光光度法測定。從丙酮酸2,4-二硝基苯腙的生成量,可計算酶的活力。【試劑和器材】一、試劑1.試管及試管架2.吸管3.恒溫水
3、浴4.分光光度計5、移液管6、電子天平7、研缽8、容量瓶9、冰箱二、器材1、標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸溶液標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸(500g/ml):準(zhǔn)確稱取純化的丙酮酸鈉62.5mg,溶于pH7.4 0.1M 的PBS中,定容到100ml。現(xiàn)用現(xiàn)配。2、谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物:0.90g L-丙氨酸,29.2mg -酮戊二酸,先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。然后用1 M NaOH調(diào)節(jié)pH到7.4,再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml,貯存于冰箱中,可使用1周。3、0.1mol/L pH7.4 PBS:稱取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于蒸餾水中,定容到1000ml。4、0.02
4、% 2.4-二硝基苯肼溶液:稱取20mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/L HCl中。把錐形瓶放在暗處并不時搖動(或加熱溶解),待2,4-二硝基苯肼全部溶解后,用1mol/L HCl定容到100ml。濾入棕色玻璃瓶內(nèi)置 冰箱內(nèi)保存。5、0.4mol/L NaOH :稱取16g NaOH定容到1000ml。6、0.9%生理鹽水:稱取0.9gNaCl,定容到100ml。【操作方法】一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的給制:取6支試管,分別標(biāo)上0,1,2,3,4,5六個號。按下表所列的次序添加各試劑。2,4-硝基苯肼可與有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的-酮戊二酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng),生成-酮戊二酸苯腙。因
5、此,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時,須加入一定量的底物,(內(nèi)含-酮戊二酸)以抵消由-酮戊二酸產(chǎn)生的消光影響。先將試管置于37恒溫水浴中保溫10min以平衡內(nèi)外溫度。向各管內(nèi)加入0.5ml2,4-二硝基苯肼溶液后再保溫20min,最后,分別向各管內(nèi)加入0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml。在室溫下靜置30min,以0號管作空白,測定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩爾數(shù)為橫坐標(biāo),光吸收值為縱坐標(biāo),畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。(總圖如下)二、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測定(學(xué)生只做這個)1、樣品的制備(集體制備)將雞處死,取肝臟后用生理鹽水沖洗,濾紙吸干后,稱取0.5g 肝臟,剪成小塊,加入預(yù)冷(冰水或冰箱中)的pH7.4的PBS 4
6、.5ml,在冰水浴中制成10%的勻漿, 4000rpm冷凍離心10分鐘后保存在冰水中備用。(一組按10ml算:10ml*N)2、酶活力的測定:取6支試管,按下表操作: 測定管(A)標(biāo)準(zhǔn)管(S)對照管(B)空白管谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物(ml)0.50.5 37水浴5min肝勻漿(或血清)(ml)0.1丙酮酸0.1ml0.1水0.1ml 混勻后,37水浴準(zhǔn)確保溫30min2,4-二硝基苯肼(ml)0.50.50.50.5谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物(ml) 0.50.5 混勻后,37水浴準(zhǔn)確保溫20minNaOH(ml)5.05.05
7、.05.0混勻后,靜置10minA5203、計算:每毫升肝臟勻漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位: D=(A-B) ×500/S×2.5=(A-B) ×200/S D:每毫升肝臟勻漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位(U/ml) 式中 A:樣品管吸光度值 B:對照管吸光度值 S:標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值 500:標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸溶液 2.5濃度谷丙轉(zhuǎn)氨酶的換算單位系數(shù)【注意事項】1. 在測定SGPT時,應(yīng)事先將底物、血清在37水浴中保溫,然后在血清管中加入底物,準(zhǔn)確記時。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)值在20500U是準(zhǔn)確可靠的,超過500U時,需將樣品稀釋。3. 轉(zhuǎn)氨酶只能作用于L氨基酸,對D氨基酸無作用。實驗室多用D
8、L氨基酸(較L氨基酸價廉),若用L氨基酸,則用量減半。4. 溶血標(biāo)本不宜使用,因血細胞中轉(zhuǎn)氨酶活力較高,會影響測定效果。5. 血清樣品的測定需在顯色后30分鐘內(nèi)完成。6 酶在37下與底物作用30min后,以能產(chǎn)生2.5g的丙酮酸為一個活力單位。7 -酮戊二酸也能產(chǎn)生苯腙,但在520nm下遠較丙酮酸的低。8 -酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼對顯色有一定干擾,注意添加量瓊州學(xué)院實驗項目卡生命科學(xué) 系 生化 實驗室 開設(shè)日期_年_月_日實驗項目血液轉(zhuǎn)氨酶(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)活力的測定面向?qū)I(yè)課程性質(zhì)1、必修2、選修實驗類型1、還未開設(shè)的新實驗2、手段更新的實驗3、已開設(shè)過的實驗本實驗學(xué)時數(shù)4實驗分組概況所用主要儀器名 稱型號規(guī)格數(shù)量名 稱型號規(guī)格數(shù)量試管及試管架若干冰箱1移液管各規(guī)格若干恒溫水浴箱1分光光度計6所用主要藥品名 稱純度級別數(shù)量名 稱純度級別數(shù)量0.1mol/L磷酸緩沖液pH7.4磷酸氫二鉀30ml*N氯化鈉0.9%500ml磷酸二氫鉀2,4-二硝基苯肼0.02%20
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