實驗十 血液轉(zhuǎn)氨酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測定

1、實驗十、血液轉(zhuǎn)氨酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）活力的測定（實驗：肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測定）（本實驗分2個實驗完成：一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 二、測酶活力和總結(jié)?；蚓妥龆涂梢裕灸康暮鸵蟆?、 了解轉(zhuǎn)氨酶在代謝過程中的重要作用及其在臨床診斷中的意義，2、 學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)氨酶活力測定的原理和方法。3、 熟悉分光光度計的使用?！驹怼可矬w內(nèi)廣泛存在的氨基移換酶也稱轉(zhuǎn)氨酶，能催化-氨基酸的-氨基與-酮基酸的-酮基互換，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中間代謝過程中有重要作用。轉(zhuǎn)氨酶的最適pH接近7.4，它的種類甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱谷草轉(zhuǎn)氨酶）和谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶）的活力最強。它們催

2、化的反應(yīng)如下。正常人血清中只含有少量轉(zhuǎn)氨酶。當(dāng)發(fā)生肝炎，心肌梗死等病患時，血清中轉(zhuǎn)氨酶活力常顯著增加，所以在臨床診斷上轉(zhuǎn)氨酶活力的測定有重要意義。測定轉(zhuǎn)氨酶活力的方法很多，本實驗采用分光光度法。谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用于丙氨酸-酮戊二酸后，生成的丙酮酸與2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。丙酮酸2，4-二硝基苯腙加堿處理后呈棕色，其吸收光譜的峰為439530nm，因此在波長520nm處吸光度度增加的程度與反應(yīng)體系中丙酮酸與-酮戊二酸的摩爾比基本呈線性關(guān)系，故可藉可用分光光度法測定。從丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可計算酶的活力。【試劑和器材】一、試劑1.試管及試管架2.吸管3.恒溫水

3、浴4.分光光度計5、移液管6、電子天平7、研缽8、容量瓶9、冰箱二、器材1、標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸溶液標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸（500g/ml）：準(zhǔn)確稱取純化的丙酮酸鈉62.5mg，溶于pH7.4 0.1M 的PBS中，定容到100ml。現(xiàn)用現(xiàn)配。2、谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物：0.90g L-丙氨酸，29.2mg -酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。然后用1 M NaOH調(diào)節(jié)pH到7.4，再用pH7.4 0.1mol/L的PBS定容到100ml，貯存于冰箱中，可使用1周。3、0.1mol/L pH7.4 PBS：稱取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于蒸餾水中，定容到1000ml。4、0.02

4、% 2.4-二硝基苯肼溶液：稱取20mg 2.4-二硝基苯肼溶于少量的1mol/L HCl中。把錐形瓶放在暗處并不時搖動（或加熱溶解），待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，用1mol/L HCl定容到100ml。濾入棕色玻璃瓶內(nèi)置 冰箱內(nèi)保存。5、0.4mol/L NaOH ：稱取16g NaOH定容到1000ml。6、0.9%生理鹽水：稱取0.9gNaCl，定容到100ml。【操作方法】一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的給制：取6支試管，分別標(biāo)上0，1，2，3，4，5六個號。按下表所列的次序添加各試劑。2,4-硝基苯肼可與有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的-酮戊二酸與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)，生成-酮戊二酸苯腙。因

5、此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時，須加入一定量的底物，（內(nèi)含-酮戊二酸）以抵消由-酮戊二酸產(chǎn)生的消光影響。先將試管置于37恒溫水浴中保溫10min以平衡內(nèi)外溫度。向各管內(nèi)加入0.5ml2，4-二硝基苯肼溶液后再保溫20min，最后，分別向各管內(nèi)加入0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml。在室溫下靜置30min，以0號管作空白，測定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩爾數(shù)為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。（總圖如下）二、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測定（學(xué)生只做這個）1、樣品的制備（集體制備）將雞處死，取肝臟后用生理鹽水沖洗，濾紙吸干后，稱取0.5g 肝臟，剪成小塊，加入預(yù)冷（冰水或冰箱中）的pH7.4的PBS 4

6、.5ml，在冰水浴中制成10%的勻漿， 4000rpm冷凍離心10分鐘后保存在冰水中備用。（一組按10ml算：10ml*N）2、酶活力的測定：取6支試管，按下表操作： 測定管（A）標(biāo)準(zhǔn)管（S）對照管（B）空白管谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物（ml）0.50.5   37水浴5min肝勻漿（或血清）（ml）0.1丙酮酸0.1ml0.1水0.1ml 混勻后，37水浴準(zhǔn)確保溫30min2,4-二硝基苯肼（ml）0.50.50.50.5谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物（ml）  0.50.5 混勻后，37水浴準(zhǔn)確保溫20minNaOH（ml）5.05.05

7、.05.0混勻后，靜置10minA5203、計算：每毫升肝臟勻漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位： D=(A-B) ×500/S×2.5=(A-B) ×200/S D:每毫升肝臟勻漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位(U/ml) 式中 A:樣品管吸光度值 B:對照管吸光度值 S:標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值 500:標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸溶液 2.5濃度谷丙轉(zhuǎn)氨酶的換算單位系數(shù)【注意事項】1. 在測定SGPT時，應(yīng)事先將底物、血清在37水浴中保溫，然后在血清管中加入底物，準(zhǔn)確記時。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)值在20500U是準(zhǔn)確可靠的，超過500U時，需將樣品稀釋。3. 轉(zhuǎn)氨酶只能作用于L氨基酸，對D氨基酸無作用。實驗室多用D

8、L氨基酸（較L氨基酸價廉），若用L氨基酸，則用量減半。4. 溶血標(biāo)本不宜使用，因血細胞中轉(zhuǎn)氨酶活力較高，會影響測定效果。5. 血清樣品的測定需在顯色后30分鐘內(nèi)完成。6  酶在37下與底物作用30min后，以能產(chǎn)生2.5g的丙酮酸為一個活力單位。7  -酮戊二酸也能產(chǎn)生苯腙，但在520nm下遠較丙酮酸的低。8  -酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼對顯色有一定干擾，注意添加量瓊州學(xué)院實驗項目卡生命科學(xué) 系 生化 實驗室 開設(shè)日期_年_月_日實驗項目血液轉(zhuǎn)氨酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）活力的測定面向?qū)I(yè)課程性質(zhì)1、必修2、選修實驗類型1、還未開設(shè)的新實驗2、手段更新的實驗3、已開設(shè)過的實驗本實驗學(xué)時數(shù)4實驗分組概況所用主要儀器名 稱型號規(guī)格數(shù)量名 稱型號規(guī)格數(shù)量試管及試管架若干冰箱1移液管各規(guī)格若干恒溫水浴箱1分光光度計6所用主要藥品名 稱純度級別數(shù)量名 稱純度級別數(shù)量0.1mol/L磷酸緩沖液pH7.4磷酸氫二鉀30ml*N氯化鈉0.9%500ml磷酸二氫鉀2，4-二硝基苯肼0.02%20