黃色須腹菌發(fā)酵動力學(xué)研究

1、黃色須腹菌發(fā)酵動力學(xué)研究馬仕波，葉建仁收稿日期：2013-06-23 修回日期：基金項(xiàng)目：國家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)No.201004061；國家“十二五”科技支撐項(xiàng)目(2012BAD19B0703)作者簡介：馬仕波(1988-)，男，碩士。*通訊作者（Corresponding Author）：葉建仁，男，教授，博士生導(dǎo)師(南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037)摘要：本文對黃色須腹菌發(fā)酵罐發(fā)酵動力學(xué)進(jìn)行了研究。通過分批發(fā)酵的方式，明確了發(fā)酵罐發(fā)酵過程中菌絲體比生長速率為0.158h-1，碳源用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)為-0.00035h-1，以及菌絲體生長動力學(xué)模型和基

2、質(zhì)消耗動力學(xué)模型。同時對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型進(jìn)行了驗(yàn)證比較，模型計(jì)算與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合良好，模型能很好地反應(yīng)黃色須腹菌菌絲體生長及基質(zhì)消耗過程。關(guān)鍵詞：黃色須腹菌，分批發(fā)酵，動力學(xué)中圖分類號：TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：AFermentation kinetics of Rhizopogon luteousMA Shi-bo, YE Jian-ren*(College of Forest Resources and Environment Nanjing Forestry University, Nanjing 210037)Abstract：It studied the fermentati

3、on kinetics of Rhizopogen luteous. The study suggested that the mycelium specific rate was 0.158h-1 , carbon source for the product accumulation rate constant was -0.00035h-1, and mycelium growth model and substrate consumption dynamics model was obtained in batches. Also we validated with the

4、experimental data. The results showed that the model and experimental data fit well and the two models could reflect the mycelium growth process and the process of dynamic substrate consumption well.Key words：Rhizopogon luteous；Batch fermentation；Dynamics黃色須腹菌是一株優(yōu)良的侵染松科樹種的外生菌根真菌 邵東華,楊喜平.張曉東等.淺黃根須腹菌侵

5、染油松形成外生菌根J.生態(tài)學(xué)雜志,2013,32(1):78-81，采用生物技術(shù)方法利用液體發(fā)酵培養(yǎng)黃色須腹菌菌絲體，并利用發(fā)酵菌絲液直接進(jìn)行田間應(yīng)用是目前最快捷的投入生產(chǎn)實(shí)踐的應(yīng)用方法。發(fā)酵動力學(xué)是研究各種環(huán)境因素與微生物代謝活動之間的相互作用隨時間的變化而變化的規(guī)律的學(xué)科 李敏. 褐環(huán)乳牛肝菌(Suillus luteus (L.：Fr)Gray)發(fā)酵生物學(xué)的研究D.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2007。在黃色須腹菌液體發(fā)酵罐發(fā)酵過程中，通過數(shù)學(xué)模型定量地描述發(fā)酵過程中的菌絲體生長狀況，建立其動力學(xué)模型能很好地達(dá)到對發(fā)酵過程有效的控制，從而提高菌絲的產(chǎn)率以及降低生產(chǎn)成本 熊小平,文湘華,徐康寧等. 白

6、腐真菌批式發(fā)酵動力學(xué)模型研究J. 環(huán)境科學(xué). 2008(02):2494-2499。1材料與方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株黃色須腹菌(Rhizopogen luteous)，由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2試劑葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素B1、氫氧化鈉、鹽酸、3，5-二硝基水楊酸、丙三醇、瓊脂、馬鈴薯、有機(jī)硅消泡劑。1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器搖床、恒溫培養(yǎng)箱、電子分析天平、pH計(jì)、Eppendorf離心機(jī)、超凈工作臺、立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋、粉碎機(jī)、恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱、上海國強(qiáng)自動攪拌新概念高級液體發(fā)酵罐。1.1.4培養(yǎng)基種子液培養(yǎng)基：馬鈴薯200g(去皮煮沸過濾取汁)，葡萄糖20

7、g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO43g，VB10.05g，水1000mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯150g(去皮煮沸過濾取汁)，葡萄糖20g，MgSO4·7H2O1.2g，KH2PO42.5g，水1000mL。 1.2試驗(yàn)方法1.2.1制備種子液將保存的黃色須腹菌菌種無菌條件下接入PDA固體平板上，于28活化培養(yǎng)144h，待菌絲長滿平板，無菌操作下，用打孔器(d=7mm)在黃色須腹菌平板菌絲邊緣打取小菌餅6塊，用挑針轉(zhuǎn)接到裝有100mL液體種子液培養(yǎng)基的250mL三角瓶中恒溫?fù)u床(28，180r/min)培養(yǎng)144h，把長勢旺盛的菌絲體用滅菌的勻漿機(jī)打成勻漿，制得種子

8、液。1.2.2發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵溫度設(shè)定為28，罐壓0.05MPa，裝料系數(shù)0.5，消泡劑0.05%，接種量5%，初始溶氧量100%，通氣流量15L/M，初始轉(zhuǎn)速400rpm，初始pH值5.4，進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)。1.2.3取樣和在線監(jiān)測每12h取樣一次，每次取200mL發(fā)酵液離心(5000×g，20min)，倒出上清液，測定上清液總糖濃度，濾得菌絲體，80烘干至恒重，稱量。溶解氧、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量等參數(shù)由發(fā)酵之星自動在線監(jiān)測并記錄數(shù)據(jù)。1.2.4溶液配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1g/L)：準(zhǔn)確稱取 1.00 g 分析純的無水葡萄糖(100 下烘干至恒重)，溶解于 1000 mL 蒸餾水中

9、。3，5-二硝基水楊酸(DNS)溶液：稱取 6.5 g 3，5-二硝基水楊酸溶于少量蒸餾水中，溶解后移入 1000 mL 容量瓶中，加入 2 mol/L NaOH 溶液 325 mL，再加入丙三醇 45g丙三醇，搖勻，冷卻后定容至 1000 mL，然后盛于棕色瓶中，放置備用。1.2.5總糖的測定(DNS法)分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/mL) ，0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2與10 mL的具塞試管中，準(zhǔn)確加入DNS試劑1.5mL，再用蒸餾水補(bǔ)至3.5mL，沸水浴中加熱5min，流水冷卻，后定溶。在530nm 處測定吸光度，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 黃翊鵬,祁靜,鄭亞軍等. 3,

10、5-二硝基水楊酸法測定椰子納塔發(fā)酵液中總糖含量研究J. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2009(12):171-174、 單衛(wèi)華,張玲,時延增,梁瑞雪,尚立霞,胡慶文. 靈芝菌發(fā)酵液制劑中靈芝多糖及總糖含量測定J. 時珍國醫(yī)國藥. 2000(09):797-798。取5 mL發(fā)酵液5000×g離心20 min，取1 mL上清液于25 mL具塞試管，加入5 mL 的6 mol/L的鹽酸，并在沸水浴中加熱1530 min，以碘-碘化鉀溶液檢查其水解是否完全，不呈現(xiàn)藍(lán)色說明水解完全。冷卻后轉(zhuǎn)移至三角燒瓶，加入一滴酚酞試劑，以10% NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，過濾并定容至25 mL。吸取2mL待測液

11、與10 mL的具塞試管中，準(zhǔn)確加入DNS試劑1.5 mL，再用蒸餾水補(bǔ)至3.5 mL，沸水浴中加熱5 min，流水冷卻，后定溶。在530 nm 處測定吸光度。每次測三個重復(fù)，取其平均值。根據(jù)測出的吸光度值在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖值，按下式計(jì)算樣品中總糖的百分含量：總糖(mg/mL)=查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得還原糖濃度×稀釋倍數(shù)×0.9×100%1.2.6菌絲體生長的動力學(xué)方程本試驗(yàn)主要研究黃色須腹菌的菌絲生物量和發(fā)酵液中總糖含量隨時間的變化，以分批發(fā)酵試驗(yàn)為依據(jù)，獲取發(fā)酵液中菌絲體干重和總糖含量數(shù)據(jù)，進(jìn)行分批發(fā)酵過程動力學(xué)模型的初步研究。菌絲體生長動力模型采用 L

12、ogistic方程，基質(zhì)(底物)消耗模型采用與Luedeking-Piret相似的方程表示 陳堅(jiān),堵國成,張東旭.發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)M.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2009。菌絲體動力學(xué)模型方程如下：(1) 式中，k為菌體比生長速率(h-1)；X為菌體生物量(g/L)， Xm為最大菌絲生物量(g/L)；在初始條件下有t=0，X=X0，將上式積分得：(2) X(t)= X0ekt/1-( X0/Xm)(1- ekt)X0為發(fā)酵液的初始菌絲體生物量(g/L)，以上方程可以同時表達(dá)在對數(shù)期和穩(wěn)定期的菌絲體生長情況。將具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)代入(2)式，以lnX/(Xm-X)對t作圖便得到直線斜率k，截距為lnX0/

13、(Xm-X0)，計(jì)算后便能得到X0。1.2.7底物消耗的動力學(xué)方程 在發(fā)酵過程中底物消耗主要用于菌體生長及代謝。故此底物消耗速率方程采用Luedeking-Piret方程：(3)式中YX/S為生成菌絲體的干重與完全消耗于菌絲體生長的基質(zhì)質(zhì)量之比，m為細(xì)胞維持系數(shù)(h-1)，S為發(fā)酵液中的總糖量(mg)。積分后可以得到：(4) S(t)=S0+X0-X(t)+(Xm/k)ln1-(X0/Xm)(1-ekt)式中S0為發(fā)酵液初始總糖量(mg)，X0為發(fā)酵液的初始菌絲體生物量(g/L)，Xm為最大菌絲體生物量(g/L)，k為菌體比生長速率(h-1)，代表碳源用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)(h-1)。按照公式

14、(4)對發(fā)酵過程中可溶性糖的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，可得到方程的參數(shù)。2結(jié)果與分析2.1發(fā)酵系統(tǒng)中菌絲生物量和pH的變化菌絲體基本參數(shù)動態(tài)變化試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)體系中前 24h 菌絲生物量增加不明顯，菌絲體生長處于延滯期；然后迅速進(jìn)入指數(shù)生長期，到 120h 時，可增加至 17.5g/L；此后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌絲體生物量保持穩(wěn)定，在 132h216h 期間，菌體生物量始終保持在 17.6g/L左右，其中在 192h 時菌體生物量達(dá)到最大，此時為 17.8g/L；216h 后，菌絲生物量開始有所下降，進(jìn)入衰亡期，菌絲出現(xiàn)自溶現(xiàn)象(圖1)。圖1發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中pH值和菌絲生物量變化Fig.1 The

15、pH and mycelium biomass of fermentation在發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液pH變化范圍為3.06.0左右。培養(yǎng)基自然pH為5.96。在36h內(nèi)，pH沒有明顯的變化，36h108h之間pH大幅度下降到接近3.0左右，108h192h之間基本維持在接近3.0的水平左右，192h之后開始緩慢地上升至接近4.0左右。這說明在整個發(fā)酵過程中，黃色須腹菌菌絲不斷生長代謝時會產(chǎn)生影響pH值變化的酸性物質(zhì)，使得發(fā)酵前期pH值大幅度下降，而發(fā)酵中期，也就是菌絲生長的穩(wěn)定期時，菌絲代謝也變得比較穩(wěn)定，pH值處于一個相對來說比較平穩(wěn)的狀態(tài)，而發(fā)酵后期菌絲開始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象時，pH值又

16、開始緩慢地升高。2.2動力學(xué)模型求解2.2.1菌絲體生長動力學(xué)模型發(fā)酵系統(tǒng)中菌絲體的生長受菌濃及底物濃度等對其的影響，菌絲體的生長是需要的最終產(chǎn)物，據(jù)發(fā)酵系統(tǒng)中的菌絲體生物量試驗(yàn)值(如圖2)對菌絲生長動力學(xué)方程參數(shù)進(jìn)行求解，參數(shù)估計(jì)值見表1，方差分析見表2：圖2 發(fā)酵過程中的菌絲生物量試驗(yàn)值Fig.2 Experimental data of mycelium growth in fermentation表1參數(shù)估計(jì)值及置信區(qū)間Tab.1 Parameter estimate and approximate 95% confidence limits參數(shù)類型估計(jì)值標(biāo)準(zhǔn)誤置信區(qū)間下限上限k0.1

17、580.01670.1450.167Xm17.960.762316.6719.33表2非線性回歸及方差分析Tab.2 non-linear regression and ANOVA變異來源自由度平方和均方F值Sig.組內(nèi)196.2520.32911399.320.000組間21204.2602.1總計(jì)211210.4k的估計(jì)值為0.158，95%的置信區(qū)間為(0.145，0.167)，Xm的估計(jì)值為17.96，95%的置信區(qū)間為(16.67，19.33)，將各參數(shù)代入公式(2)中，求得菌絲體生長動力學(xué)模型為：(5) X(t)= e0.158t/4.94432+0.05568 e0.158t)即

18、黃色須腹菌菌絲體比生長速率為0.158h-1；最大菌絲生物量為17.96g/L。2.2.2基質(zhì)消耗動力學(xué)模型在黃色須腹菌發(fā)酵過程中，以葡萄糖為限制性基質(zhì)，其消耗主要用于菌絲體生長及菌絲體細(xì)胞的維持，按照發(fā)酵系統(tǒng)中的總糖量試驗(yàn)值(如圖1-3)對基質(zhì)消耗動力學(xué)方程參數(shù)進(jìn)行求解，參數(shù)估計(jì)值見表3，方差分析見表4：圖3 發(fā)酵過程中總糖量的試驗(yàn)值Fig.3 Experimental data of total sugar in fermentation表3參數(shù)估計(jì)值及置信區(qū)間Tab.3 Parameter estimate and approximate 95% confidence limits參數(shù)類

19、型估計(jì)值標(biāo)準(zhǔn)誤置信區(qū)間下限上限0.57940.08960.45360.6785-0.000350.1311-0.002470.00134表4非線性回歸及方差分析Tab.4 Non-linear regression and ANOVA變異來源自由度平方和均方F值Sig.組內(nèi)18204.211.3445319.3260.000組間27011.53505.75總計(jì)207215.7的估計(jì)值為0.5794，95%的置信區(qū)間為(0.4536，0.6785)，的估計(jì)值為-0.00035，95%的置信區(qū)間為(-0.00247，0.00134)，將各參數(shù)代入公式(4)中，求得基質(zhì)消耗動力學(xué)模型為：(6) S(

20、t)=29.61- 0.5794e0.158t/4.9443+0.05568e0.158t)-0.0399×ln0.9889+0.01114e0.158t)即碳源用于積累生產(chǎn)菌絲的得率常數(shù)為-0.00035。2.2.3模型驗(yàn)證將得到的發(fā)酵動力學(xué)模型的擬合值與試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩個模型分別能較好地反應(yīng)菌絲體生長和基質(zhì)消耗的動態(tài)過程，經(jīng)兩個方程計(jì)算的菌絲生物量及總糖量模型值能準(zhǔn)確地預(yù)測菌絲生物量及總糖量試驗(yàn)值，能很好地調(diào)控發(fā)酵過程中各參數(shù)，以達(dá)到最佳發(fā)酵狀態(tài)，結(jié)果如圖4和圖5所示。圖4菌絲體生長模型值與試驗(yàn)值的比較Fig.4 Comparison of experimental da

21、ta with calculated data on mycelium growth圖5基質(zhì)消耗動力學(xué)模型值與試驗(yàn)值的比較Fig.5 Comparison of kinetics model curve of substrate con-sumption and experimental values結(jié)果顯示：兩曲線擬合度均較好，菌體生長和底物消耗模型的擬合度分別為0.996、0.987。因此該方程能夠作為黃色須腹菌菌體生長優(yōu)化控制的參考依據(jù)，在發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期后期，由于生長環(huán)境惡劣菌體少量自溶，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)值與擬合值在發(fā)酵后期有一定的偏差。經(jīng)過模型公式計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)實(shí)測值比較，最大誤差為18.34%，平均誤差為8.75%。菌體在前期生長時，底物消耗速度較快；隨著進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體對底物的消耗速度也接近平緩。3結(jié)論通過對黃色須腹菌液體發(fā)酵過程的分析，應(yīng)用相關(guān)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理計(jì)算 代志凱,印遇龍,阮征. 微生物發(fā)酵動力學(xué)模型及其參數(shù)擬合的軟件實(shí)現(xiàn)J. 計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué). 2011(04):437-441，得到了菌絲體生長動力學(xué)模型和底物消耗動力學(xué)模型及其參數(shù)，且模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)能較好地?cái)M合。說明黃色須腹菌液體發(fā)酵過程的兩個動力學(xué)模型在一定程度上揭示了黃色須腹菌發(fā)酵代謝的基本特征，可以用來預(yù)測發(fā)酵液中菌絲體生物量，判斷發(fā)酵過程的正常與否。從而對發(fā)酵操作參數(shù)提出要求，以