生物技術(shù)與生物分離

1、1 緒 論1.1生物技術(shù)與生物分離 生物技術(shù)（biotechnology）即有機體的操作和應(yīng)用有機體生產(chǎn)有用物質(zhì)、改善人類生存環(huán)境的技術(shù)。 1953年，Watson和Crick提出了脫氧核苷酸（DNA）的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，闡明了DNA是生物遺傳信息（基因）的攜帶者，開辟了現(xiàn)代分子生物學(xué)的新紀(jì)元，為生物技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展開辟了廣闊的空間。20世紀(jì)70年代，重組DNA（recombinant DNA,rDNA）技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)相繼建立，現(xiàn)代生物技術(shù)步入了嶄新的發(fā)展時期。1980年前后，世界主要發(fā)達(dá)國家先后實施生物技術(shù)發(fā)展計劃，生物技術(shù)迎來了日新月異的高速發(fā)展階段。進入21世紀(jì)，人類基因組研究取得巨

2、大成就，各染色體測序工作逐步完成，迎來了生物技術(shù)的后基因組時代，蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物基因組學(xué)、生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)研究蓬勃興起，為生物技術(shù)的發(fā)展注入了巨大的生機和活力。生物技術(shù)的主要目標(biāo)是生物物質(zhì)的高效生產(chǎn)，而分離純化是生物產(chǎn)品工程（bioproduct engineering）的重要環(huán)節(jié)。因此，生物分離（biopseparation）是生物技術(shù)的重要組成部分。在生物技術(shù)領(lǐng)域，一般將生物產(chǎn)品的生產(chǎn)過程稱為生物加工過程（bioprocess），包括優(yōu)良生物物種的選育、基因工程、細(xì)胞工程、生物反應(yīng)過程（酶反應(yīng)、微生物發(fā)酵、動植物細(xì)胞培養(yǎng)等）及目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化過程，后者又稱下游加工過程（downst

3、ream processing）。生物分離過程包括目標(biāo)產(chǎn)物的提?。╥solation）、濃縮（concentration）、純化（pruification）及成品化（product polishing）等過程。生物分離過程特性主要體現(xiàn)在生物產(chǎn)物的特殊性、復(fù)雜性和對生物產(chǎn)品要求的嚴(yán)格性上，其結(jié)果導(dǎo)致分離過程成本往往約占生產(chǎn)過程成本的大部分。例如，大多數(shù)工業(yè)酶（enzyme）的分離過程成本約占70%，而對純度要求更高的醫(yī)用酶如天冬酰胺酶（asparaginase）,分離過程成本高達(dá)生產(chǎn)過程的85%；基因重組蛋白質(zhì)藥物的分離過程成本一般占85%90%以上。與此相比，小分子生物產(chǎn)物的分離成本較低，如青

4、霉素的分離過程成本約占50%，而乙醇的分離過程成本僅占14%。因此，在生物大分子藥物的生產(chǎn)過程中，分離過程的質(zhì)量往往決定整個生物加工過程的成敗。開發(fā)高效的分離技術(shù)、設(shè)計合理的生物分離過程可大幅度降低生物加工過程成本，提高產(chǎn)品的市場競爭力，促進人類健康水平和生活質(zhì)量的提高以及社會經(jīng)濟的發(fā)展。圖1.1生物分離過程的一般流程（括號內(nèi)為各步驟的主要分離純化方法）1.2 生物物質(zhì)和生物分離 1.2.1生物物質(zhì) 生物物質(zhì)種類繁多，包括小分子化學(xué)物、生物大分子、超大分子、細(xì)胞和具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)與構(gòu)成成分的生物體組織，在大小、形態(tài)和性質(zhì)上具有廣泛的分布。生物物質(zhì)的來源包括自然界存在的各種生物資源，但現(xiàn)代生物技術(shù)主

5、要通過生物反應(yīng)過程生產(chǎn)各種有用生物物質(zhì)，如生物醫(yī)藥、疫苗、診斷試劑、精細(xì)生物化學(xué)品、大宗生物化學(xué)品、生物材料、生物能源（生物制氫、生物柴油）、人工器官、藥物輸送載體、功能食品和添加劑、飼料、化妝品等。常見的生物制品有抗生素、有機酸、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)（包括酶、抗體0、核苷酸、聚核苷酸、核酸、病毒、糖類脂類、生物堿、糖苷等，其中與人類健康直接相關(guān)的治療藥物和疫苗是生物分離工程研究的重要內(nèi)容?，F(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品的主體是蛋白質(zhì)藥物，包括細(xì)胞因子（如干擾素、生長因子、紅細(xì)胞生成素）、激素（如胰島素、生長激素）、抗體藥物（單克隆抗體）、抗體片段、基因工程抗體）、酶類藥物、溶血栓藥物、（如尿激酶、組織纖溶

6、酶原激活劑）等。在功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的推動下，蛋白質(zhì)藥物將獲得更大發(fā)展。近年來，基因工程疫苗、反義核酸藥物和核酸疫苗研究進展迅速，為治療和預(yù)防各種疑難疾病開辟了新的發(fā)展空間。同時，隨著2004年初第一個基因治療藥物獲得生產(chǎn)批文，基因治療也進入了新的發(fā)展時期。基因治療藥物的主體是目的基因的載體（vector）。基因治療載體包括?。┒据d體（如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒）和非病毒載體（如質(zhì)粒DNA），其相對分子質(zhì)量（或顆粒尺寸）均遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)（相對分子質(zhì)量106107數(shù)量級，尺寸301000nm）,可稱作超大生物分子，其大規(guī)模分離純化為生物分離純化為生物分離工程的發(fā)展帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)。1.2.

7、2生物分離過程生物分離的原料主要來源于生物反應(yīng)過程。生物反應(yīng)的產(chǎn)物一般是由細(xì)胞、游離的細(xì)胞外代謝產(chǎn)物、細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物、殘余底物及惰性組分組成的混合液。常見生物藥物和天然藥物（中藥）的分離制備過程已編輯成書或手冊可供參考。圖1.1是通過細(xì)胞（包括微生物和動植物細(xì)胞）培養(yǎng)生產(chǎn)生物物質(zhì)的分離過程的一般流程。首先，將細(xì)胞與培養(yǎng)液分離開來。若目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞內(nèi)（胞內(nèi)產(chǎn)物），需首先利用細(xì)胞破碎等方法將目標(biāo)產(chǎn)物釋放到液相中，除去細(xì)胞碎片后進行一系列粗分離和純化操作（路線1a）；若胞內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物是以包含體（inclusion bodies,IBs）形式存在的蛋白質(zhì)的，則需利用鹽酸胍等變性劑溶解包含體，然后進行

8、蛋白質(zhì)的體外折疊復(fù)性（in vitro refolding），獲得具有活性的目標(biāo)蛋白質(zhì)（路線1b），再進行后續(xù)的分離純化操作。若目標(biāo)產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物，即在細(xì)胞培養(yǎng)過程中已分泌到培養(yǎng)液中，則可在除去細(xì)胞后直接對上清液進行濃縮、分離和純化處理，得到一定純度的目標(biāo)產(chǎn)物溶液（路線2）。最后經(jīng)過脫鹽、濃縮、結(jié)晶和干燥處理，得到最終產(chǎn)品。從圖1.1可以看出，生物分離過程的設(shè)計應(yīng)首先考慮目標(biāo)產(chǎn)物存在的位置（胞內(nèi)或胞外）和存在形式（活性表達(dá)產(chǎn)物或包含體），應(yīng)用的分離純化技術(shù)則取決于產(chǎn)物分子的大小、疏水性、電荷形式、溶解度和穩(wěn)定性等。此外，生物加工過程的規(guī)模、目標(biāo)產(chǎn)物的商業(yè)價值和對純度的要求也是選擇分離純化技術(shù)的

9、重要因素。例如，色譜技術(shù)分離精度很高，多應(yīng)用于價格較昂貴的生物技術(shù)藥物和生理活性物質(zhì)（如荷爾蒙、抗體、細(xì)胞因子等蛋白質(zhì)藥物，疫苗，質(zhì)粒DNA和病毒等基因治療載體）的分離純化，但因其生產(chǎn)規(guī)模有限，不適用于低價格產(chǎn)物的大規(guī)模分離過程。由于生物技術(shù)藥物是生物技術(shù)產(chǎn)品的核心部分，因此，色譜室生物分離過程的核心技術(shù)。1.3 生物分離過程的特點生物物質(zhì)，尤其是生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸和病毒類基因治療載體等）具有生理活性及藥理作用，在分離純化過程中必須根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的特點，在保持其生物活性和功能的前提下進行分離純化操作。因此，生物分離具有不同于一般分離過程的顯著特點。1）生物物質(zhì)的生物活性大多是在生物體內(nèi)的溫

10、和條件下維持并發(fā)揮作用的，當(dāng)遇到高溫、pH值的改變以及化學(xué)藥物存在等周圍環(huán)境的急劇變化時極不穩(wěn)定，容易發(fā)生活性降低甚至喪失（變性失活）。同時，原料液中常存在降解目的產(chǎn)物的雜質(zhì)（例如，可水解蛋白質(zhì)的蛋白酶）。因此，必須設(shè)計合理的分離過程和操作條件，實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的快速分離純化，獲得高活性目標(biāo)產(chǎn)物。2）用作醫(yī)藥、食品和化妝品和生物產(chǎn)物與人類生命息息相關(guān)。因此，要求分離純化過程必須除去原料液中含有的熱源（pyrogen）及具有免疫原性的異體蛋白質(zhì)等有害人類健康的物質(zhì)，并且防止這些物質(zhì)在分離操作過程中從外界混入。3）原料液中常存在與目標(biāo)分子在結(jié)構(gòu)、構(gòu)成成分等理化性質(zhì)上極其相似的分子及異構(gòu)體，形成用常法難

11、以分離的混合物，因此，一般需要利用具有高度選擇性的分子識別技術(shù)或高效液相色譜技術(shù)純化目標(biāo)產(chǎn)物。同時，生物產(chǎn)物的原料構(gòu)成成分復(fù)雜，需要采用多種分離技術(shù)和多個分離步驟完成一個目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化任務(wù)（如圖1.1所示）。由于每一步分離操作的回收率都不能達(dá)到100%（一般為70%90%），而整個分離過程的總回收率為 YT= Yi （1.1） 式中，Yi 為第i步操作的回收率；YT為總回收率。所以，多步操作使產(chǎn)品的最終回收率很低，過程成本顯著增大。從式（1.1）可以看出，為了提高最終產(chǎn)品的回收率，一是提高每步操作的回收率，二是減少操作步驟。為了實現(xiàn)這些目的，必須優(yōu)化分離過程和各個分離操作，并努力開發(fā)和應(yīng)用

12、新型高效的分離純化技術(shù)。 4）原料液中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度一般很低，有時甚至是極微量的，因此，往往需要從龐大體積的原料液中分離純化目標(biāo)產(chǎn)物，即需要對原料液進行高度濃縮。這也是造成生物分離成本高的原因之一。根據(jù)熱力學(xué)第二定律，混合過程熵增大，是自發(fā)過程。所以，兩種互溶的物質(zhì)相互混合時，不需要外界能量。但是，要使混合的物質(zhì)得到分離，必須補充使熵減小所需的能量。在恒溫條件下使混合物中的各組分分離為純物質(zhì)所需的最小功Wmin與吉布斯自由能變化G相等，即 Wmin=G=xiRTlnixi （1.2）式中，i為組分?jǐn)?shù)；x為摩爾分?jǐn)?shù)；為活度系數(shù)；R為氣體常數(shù)；T為熱力學(xué)溫度。在稀溶液中，溶劑的摩爾分?jǐn)?shù)近似為1，故

13、i=1。所以，得到純組分i所需最小功為 Wmin,i=xiRTlnxi （1.3）從式（1.3）可以看出，純化1mol組分i需要RTlnxi的功，即得到單位質(zhì)量物質(zhì)i需要的能耗與ln（1/xi）成正比。所以，原料中目標(biāo)產(chǎn)物濃度越低，所需能耗越高，分離過程成本越大。圖1.2為每千克生物產(chǎn)品售價（P）與原料液中目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量濃度（c）的雙對數(shù)坐標(biāo)圖，從圖可知。P和c的關(guān)系可近似表示為 cP=k（常數(shù)） （1.4）或 P=k/c （1.5）即產(chǎn)品的售價與其在原料液中的質(zhì)量濃度成反比，反映了原料質(zhì)量濃度對生產(chǎn)過程成本的顯著影響。 圖 發(fā)酵液的濃度和產(chǎn)品價格之間的關(guān)系圖1.2 原料液中目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量濃度與產(chǎn)

14、品售價的關(guān)系1.4 生物分離技術(shù)和原理物質(zhì)（包括原子、離子、分子、分子復(fù)合物、分子聚集體和顆粒，本書中一般統(tǒng)稱溶質(zhì)）分離的本質(zhì)是有效識別混合物中不同溶質(zhì)間物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的差別，利用能夠識別這些差別的分離介質(zhì)和（或）擴大這些差別的分離設(shè)備實現(xiàn)溶質(zhì)間的分離或目標(biāo)組分的純化。性質(zhì)不同的溶質(zhì)在分離操作中具有不同的傳遞速率和（或）平衡狀態(tài)，從而可實現(xiàn)彼此分離。這些性質(zhì)包括以下幾個方面。1.4.1物理性質(zhì) （1）力學(xué)性質(zhì) 包括溶質(zhì)密度、尺寸和形狀。利用這些力學(xué)性質(zhì)的差別，可進行顆粒（如細(xì)胞）的重力沉降、分子或顆粒的離心分離和膜分離（篩分）。 （2）熱力學(xué)性質(zhì) 即溶質(zhì)的溶解度（液固相平衡）、揮發(fā)度（

15、氣液相平衡）、表面活性及相間分配平衡行為等性質(zhì)。利用這些性質(zhì)的分離方法種類最多，如蒸餾、蒸發(fā)、吸收、萃取、結(jié)晶（沉淀）、泡沫分離、吸附和離子交換等。 （3）傳質(zhì)性質(zhì) 包括黏度、分子擴散系數(shù)和熱擴散現(xiàn)象等。利用傳質(zhì)速度的差別也可進行分離，但直接應(yīng)用較少，而傳質(zhì)現(xiàn)象在分離過程中發(fā)揮重要作用。因此，除熱力學(xué)外，傳遞過程理論也是生物分離工程的基礎(chǔ)。 （4）電磁性質(zhì) 即溶質(zhì)的荷電特性、電荷分布、等電點和磁性等。電泳、電色譜、電滲析、離子交換、磁性分離等方法利用溶質(zhì)（或分離介質(zhì)）的這類性質(zhì)。1.4.3 生物學(xué)性質(zhì) 化學(xué)性質(zhì)包括化學(xué)熱力學(xué)（化學(xué)平衡）、反應(yīng)動力學(xué)（反應(yīng)速率）和光化學(xué)特性（激光激發(fā)作用）等?；?/p>

16、學(xué)吸附和化學(xué)吸收是利用化學(xué)反應(yīng)進行分離得典型例證；利用激光激發(fā)的離子化作用可進行同位素分離。1.4.3 生物學(xué)性質(zhì) 生物學(xué)性質(zhì)的應(yīng)用是生物分離所獨有的。利用生物分子（或生物分子的聚集體、細(xì)胞）間的分子識別作用，可進行生物分子（如細(xì)胞、病毒、蛋白質(zhì)、核酸、寡聚核苷酸）的親和分離，親和色譜是親和分離的典型代表。另外，利用酶反應(yīng)（包括微生物反應(yīng)）的立體選擇性，而對手性分子進行選擇性修飾（如脂化、水解、氨解等），增大手性分子間理化性質(zhì)的差別，為利用常規(guī)方法（如色譜）分離手性分子創(chuàng)造條件。 利用目標(biāo)產(chǎn)物與其它雜質(zhì)之間的性質(zhì)差異所進行的分離過程，可以是單一因素單獨作用的結(jié)果，但更多的情況是兩種以上因素共同

17、發(fā)揮作用。在生物分離過程中，為達(dá)到要求的產(chǎn)品純度，往往需要利用基于不同分離機理的多種分離技術(shù)，實施多步分離操作的串聯(lián)（圖1.1 ）。 表1.1列出了生物分離過程中常用的分離技術(shù)及其分離原理和分離產(chǎn)物。從分離操作的角度，一般可將分離技術(shù)分為兩大類，意識給予相間分配平衡差異的平衡分離法，二是外力作用下產(chǎn)生的溶質(zhì)移動速度差別的差速分離法。表1.1 主要生物分離技術(shù)和分離機理分離技術(shù)分離原理生物分離產(chǎn)物舉例離心離心過濾離心力、篩分菌體、細(xì)胞碎片離心沉降離心力菌體、細(xì)胞、血球、細(xì)胞碎片超離心離心力蛋白質(zhì)、核酸、糖類泡沫分離泡沫分離氣液平衡、表面活性蛋白質(zhì)、細(xì)胞、細(xì)胞碎片膜分離微濾壓差、篩分菌體、細(xì)胞超濾

18、壓差、篩分蛋白質(zhì)、多糖、抗生素反滲透壓差、篩分水、鹽、糖、氨基酸透析濃差、篩分尿素、鹽、蛋白質(zhì)電滲析電荷、篩分氨基酸、有機酸、鹽、水滲透汽化氣液相平衡、篩分乙醇萃取有機溶劑萃取液液平衡有機酸、抗生素、核酸雙水相萃取液液平衡氨基酸、有機酸、抗生素液膜萃取液液平衡、載體輸送、化學(xué)反應(yīng)氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸反膠團萃取液液平衡香料、脂質(zhì)、生物堿超臨界流體萃取相平衡脫鹽、分子分級色譜凝膠過濾色譜濃差、篩分淄醇類、維生素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)反相色譜分配平衡蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素、核酸、有機酸離子交換色譜靜電作用、濃差（pH值、離子強度）蛋白質(zhì)、核酸親和色譜生物親和作用蛋白質(zhì)、核酸疏水性色譜疏水作用、濃差（離子強度

19、）蛋白質(zhì)、核酸色譜聚焦靜電作用、濃差（pH值）蛋白質(zhì)電泳凝膠電泳篩分、電荷蛋白質(zhì)、核酸等電點聚焦篩分、電荷、濃差（pH值）蛋白質(zhì)、氨基酸等速電泳篩分、電荷、濃差（pH值）蛋白質(zhì)、氨基酸二維電泳篩分、電荷、濃差（pH值）蛋白質(zhì)電色譜/色譜電泳電泳、電滲、色譜蛋白質(zhì)、核酸、糖、手性拆分結(jié)晶/沉淀溶液結(jié)晶液固平衡（溶解度）氨基酸、有機酸、抗生素、蛋白質(zhì)鹽析沉淀液固平衡、疏水作用蛋白質(zhì)、核酸等電點沉淀液固平衡、靜電作用、疏水作用氨基酸、蛋白質(zhì)有機溶劑沉淀液固平衡、靜電作用蛋白質(zhì)、核酸（1）平衡分離 平衡分離法根據(jù)溶質(zhì)在兩相（如氣液、氣固、液液、液固、氣固）間分配平衡的差異實現(xiàn)分離。溶質(zhì)達(dá)到分配平衡的推

20、動力僅取決于系統(tǒng)的熱力學(xué)性質(zhì)，即溶質(zhì)偏離平衡的濃度差（化學(xué)勢差）。顯然，溶質(zhì)達(dá)到相間分配平衡的過程為擴散傳質(zhì)過程，因此，平衡分離又稱為擴散分離。蒸餾、蒸發(fā)、吸收、萃取、結(jié)晶（沉淀）、泡沫分離、吸附和離子交換（色譜）等均為典型的平衡分離過程。（2）差速分離 差速分離是利用外力（如壓力、重力、離心力、電場力、磁力）驅(qū)動溶質(zhì)遷移產(chǎn)生的速度差進行分離的方法。傳統(tǒng)的過濾、重力沉降和離心沉降等非均相物系的機械分離方法根據(jù)溶質(zhì)大小、形狀和密度差進行分離，也屬差速分離的范疇。其他典型的差速分離法包括超濾、反滲析、電滲析、電泳和磁泳等。 在有些情況下，兩種分離原理共同發(fā)揮作用，促進分離效率的提高。例如色譜和電泳

21、相結(jié)合的色譜電泳（chromatographic electrophoresis）和電色譜（electrochromatography）過程既利用色譜的平衡分離原理，又利用電泳或（和）電滲的電場驅(qū)動作用強化分離。因此，分離技術(shù)豐富多彩，并不局限于上述簡單的分類。不同分離原理的組合可派生新型高效的分離方法，是生物分離工程研究的重要內(nèi)容。 大多數(shù)分離物系中溶質(zhì)間性質(zhì)差別較小，既分離因子較小，單級分離效率很低，故一般需要才用多級分離技術(shù)。上述各種平衡分離技術(shù)多采用多級分離操作，有些差速分離過程（如膜分離）亦可采用多級分離效率。 對于特定的目標(biāo)產(chǎn)物，要根據(jù)其自身的性質(zhì)以及與其共存雜質(zhì)的特性，選擇合適的

22、分離方法和不同分離方法的組合，一獲得最佳分離效果，實現(xiàn)高純度、高收率和低成本的分離目標(biāo)。1.5 生物分離效率 生物分離工程的目標(biāo)是實現(xiàn)生物產(chǎn)品的高效率分離純化。分離效率可從不同的角度來評價，意識分離方法和設(shè)備，二是分離過程和產(chǎn)品。1.5.1 分離方法和設(shè)備 對于特定的分離方法或分離設(shè)備（如離心、膜分離、萃取、色譜等），其評價指標(biāo)包括分離容量（capacit）、分離速度（speed）和分辨率（resolution）。分離容量指單位體積的分離設(shè)備（或分離介質(zhì)）處理料液或目標(biāo)產(chǎn)物的體積或質(zhì)量；分離速度指單批次分離所需的時間，或連續(xù)分離過程的進料速度，批次時間越短，分離速度越快；分辨率指目標(biāo)產(chǎn)品的純化

23、效果或雜質(zhì)的去除能力。具體的分離方法和設(shè)備應(yīng)滿足高容量、高速度和高分辨率的分離純化新技術(shù)、新介質(zhì)、新設(shè)備。1.5.2 分離過程和產(chǎn)品對于具體目標(biāo)產(chǎn)品的分離純化，在利用已有的分離技術(shù)或新開發(fā)建立的分離技術(shù)時，需評價具體分離過程對目標(biāo)產(chǎn)品的濃縮程度、分離純化程度和回收率。產(chǎn)品的濃縮程度用濃縮率（concentratiion factor）表達(dá)，是一個以濃縮為目的的分離過程的最重要指標(biāo)。圖1.3表示一個連續(xù)穩(wěn)態(tài)的分離過程，其中F表示流速，c表示濃度；下標(biāo)T和X分別表示目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)，C、P和W分別表示原料、產(chǎn)品和廢料。此時，濃縮率m為mT=cTP/cTC (1.6a)mX=cXP/cXC （1.6b）圖1.3 分離過程示意圖 產(chǎn)品產(chǎn)物的分離純化程度用分離因子（separation factor）表達(dá)。分離因子又稱為分離系數(shù)，其定義為 = （cTP/cTC）/( cXP/cXC)= mT/ mX (1.7) 另外，平衡分離過程（如蒸餾、萃取等）的分離因子常用平衡后兩項中的溶質(zhì)濃度之比表示。若圖1.3所示的產(chǎn)品和廢料處于相平衡狀態(tài)，則 = （cTP/cTW）/( cXP/cXW)