骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化         10-04-30 10:28:00     作者：韓成龍，姜超    編輯：studa20【摘要】  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，在不同環(huán)境下可誘導(dǎo)分化為多胚層來(lái)源的細(xì)胞，如：骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。椎間盤退變主要源于髓核細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的變化，髓核細(xì)胞為類軟骨細(xì)胞，隨著細(xì)胞生物工程技術(shù)和分子生物學(xué)的進(jìn)展，利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞載體可再生出組織工程化的髓核細(xì)胞，將其植入

2、椎間盤，從而阻止和逆轉(zhuǎn)椎間盤退變，為治療椎間盤退變提供一條新途徑。 【關(guān)鍵詞】  骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞; 椎間盤退變; 基因治療; 組織工程學(xué)Abstract:Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) have the ability of multi-directional differentiation. In different environments, it can be induced into various blastodermic layer cells, such as osteoblast, chondrocyte and

3、 so on. Intervertebral disc degeneration (IDD) is mainly the change of nucleus pulposus cells and extracellular matrix. Nucleus pulposus cell is a chondrocyte-like cell. With the progress of cell bioengineering and molecular biology, the tissue engineering nucleus pulposus cells can be regenerated b

4、y BMSCs combined with cell carrier. It can be implanted into intervertebral disc to prevent and reverse IDD. It will be a new way for treating IDD.Key words：bone marrow mesenchymal stem cells; intervertebral disc degeneration; gene therapy; tissue engineering腰椎間盤退變發(fā)病率很高，并且產(chǎn)生了巨大的社會(huì)影響，一旦開(kāi)始退變，則難以逆轉(zhuǎn)，近年來(lái)

5、對(duì)椎間盤退變的分子生物學(xué)發(fā)展機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，雖其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但由于細(xì)胞因子減少和炎癥因子增多，導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶活性增加，細(xì)胞外基質(zhì)降解加速，髓核進(jìn)行性脫水，椎間盤細(xì)胞生存的內(nèi)環(huán)境被破壞，出現(xiàn)了椎間盤退變，提出應(yīng)用基因治療和組織工程相結(jié)合的椎間盤再生治療。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)，在體外適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下可以向成軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化1，而髓核細(xì)胞為類軟骨細(xì)胞，利用組織工程學(xué)原理和方法將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與細(xì)胞載體復(fù)合植入椎間盤內(nèi)，渴望再新生工程化的髓核細(xì)胞，從而為椎間盤的退變和治療提供了一條新途徑。1 骨髓間充質(zhì)

6、干細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法1.1 BMSCs的分離方法目前BMSCs的分離方法主要有4種：即密度梯度離心法、貼壁篩選法、流式細(xì)胞儀和免疫磁珠法2：(1)密度梯度離心法：其機(jī)制是根據(jù)MSC與其他細(xì)胞的密度不同而將它分離出來(lái);雖然密度梯度離心法比貼壁篩選法復(fù)雜，但純度高;(2)貼壁篩選法：根據(jù)MSC在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)的特性，將該細(xì)胞與其他類型的細(xì)胞進(jìn)行分離;貼壁篩選法具有操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低廉，效果切實(shí)可靠的優(yōu)點(diǎn);(3)流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠法是根據(jù)細(xì)胞大小不同和細(xì)胞表面的一些特殊標(biāo)志，用特異性抗體結(jié)合磁性進(jìn)行細(xì)胞分選，但是這兩種方法對(duì)細(xì)胞活性有一定的影響，而且分離出來(lái)的細(xì)胞數(shù)目少，費(fèi)用昂貴，不利于大量

7、推廣使用。骨髓中BMSCs的含量很低，要利用BMSCs就必須實(shí)現(xiàn)BMSCs的體外分離培養(yǎng)和擴(kuò)增。因此，如何從貼壁的異質(zhì)細(xì)胞群中分離得到較為純化的BMSCs具有十分重要的意義。1.2 BMSCs的三維培養(yǎng)方法該培養(yǎng)方式中，支架材料不僅為細(xì)胞提供三維的結(jié)構(gòu)支架，使細(xì)胞間形成適宜的空間分布和細(xì)胞連接;通過(guò)多種成分的合成材料和天然材料加工成不同的結(jié)構(gòu)和形狀，用于BMSCs三維培養(yǎng)，構(gòu)建骨、軟骨等。(1)高密度細(xì)胞團(tuán)塊培養(yǎng)：細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞處于高密度環(huán)境，增強(qiáng)了細(xì)胞之間的連接，類似于軟骨組織發(fā)生過(guò)程中的前軟骨組織，因此有助于BMSCs向軟骨的分化和軟骨細(xì)胞表型的維持3。(2)微囊化培養(yǎng)：將細(xì)胞包裹于生物材

8、料制成的選擇性半透膜中即可形成微囊。微囊為細(xì)胞提供了微生態(tài)環(huán)境，氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、電解質(zhì)、分泌產(chǎn)物等小分子物質(zhì)可以自由地通過(guò)，進(jìn)行物質(zhì)交換。利用藻酸鹽微球包被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行軟骨細(xì)胞方向的定向誘導(dǎo)逐漸開(kāi)展4。(3)微載體培養(yǎng)：微載體是由葡聚糖、明膠、膠原等材料制成的直徑介于40120 m的微珠，將其懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞即可在其表面貼附、伸展和增殖。Sikavitsas5采用動(dòng)態(tài)和靜態(tài)的三維培養(yǎng)體系比較，發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)三維可降解材料上老鼠的BMSCs，在增殖分化和三維細(xì)胞培養(yǎng)體系能夠有效地種植功能細(xì)胞、保持旺盛的細(xì)胞活性、最大程度地發(fā)揮細(xì)胞的功能，為BMSCs的體外培養(yǎng)提供了一種全新模式。1.3

9、低氧狀態(tài)下的培養(yǎng) Risbud等6模擬椎間盤低氧環(huán)境，對(duì)BMSC向髓核樣細(xì)胞分化進(jìn)行了研究。作者在藻酸鹽支架中三維培養(yǎng)大鼠BMSC，培養(yǎng)液中添加TGF-進(jìn)行誘導(dǎo)，分別在低氧(2%O2)和正常環(huán)境下培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞儀、半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western blot等方法來(lái)檢測(cè)。結(jié)果表明在低氧條件下，分化后的干細(xì)胞在基因水平和蛋白水平都表達(dá)了髓核細(xì)胞在椎間盤內(nèi)的低氧反應(yīng)產(chǎn)物以及髓核細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)，表達(dá)的量高于在正常氧含量環(huán)境中分化的干細(xì)胞;他認(rèn)為在低氧條件下,BMSC可以向具有髓核樣細(xì)胞分子表型的細(xì)胞分化。1.4 極低密度傳代培養(yǎng) Javazon等7對(duì)極低密度下人與鼠MSC的培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)比研究

10、，結(jié)果表明：后者對(duì)極低密度傳代培養(yǎng)更敏感。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為高密度傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，通常的解釋是培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸抑制，但是否由于培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中分泌的某種物質(zhì)導(dǎo)致這一結(jié)果，尚在進(jìn)一步的探索之中。1.5 微重力培養(yǎng) 運(yùn)用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀(rotating cell culture system,RCCS)模擬微重力的培養(yǎng)環(huán)境，組織細(xì)胞處于穩(wěn)定的流體懸浮狀態(tài)，流體動(dòng)力抵消了重力沉降現(xiàn)象，細(xì)胞生長(zhǎng)受到持續(xù)低剪切力刺激，且不斷改變方向的重力向量可能直接影響基因表達(dá)，或者間接促進(jìn)細(xì)胞的自分泌/旁分泌，有利于細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，從而提高細(xì)胞分化質(zhì)量8。2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化髓核細(xì)胞2.1

11、 BMSC轉(zhuǎn)化髓核的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究趙梓汝等9將在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor beta，TGF-1)干預(yù)下兔BMSCs與透明質(zhì)酸鈉植入兔退變椎間盤的模型中，分別于2、4、6、8周用間苯三酚分光光度法測(cè)定蛋白聚糖含量的變化;免疫組化法測(cè)定型膠原的含量變化。結(jié)果原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)顯示兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有活躍的增殖倍增能力，并且8周內(nèi)蛋白聚糖和型膠原的含量實(shí)驗(yàn)組比模型組增高明顯，從而延緩椎間盤退變。II型膠原能誘導(dǎo)并維持間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，還能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1相互作用增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力10，其他生長(zhǎng)因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、4、7(BMPs-2

12、、4、7)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，對(duì)椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)合成的直接或間接促進(jìn)作用也相繼得到證實(shí)11，Sakai等12將BMSCs在家兔退變椎間盤模型制成2周后，分別移植入L2、3、L4及L4、5椎間盤,24周后檢查正常椎間盤。模擬手術(shù)椎間盤和移植后椎間盤的X線片椎間盤高度MRI T2信號(hào)的改變，組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和基質(zhì)關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)。結(jié)果顯示移植BMSCs組椎間盤的高度為正常對(duì)照組的81%，免疫組織化學(xué)和基因表達(dá)分析有蛋白聚糖積聚，認(rèn)為BMSCs移植對(duì)退變家兔椎間盤的再生有效，對(duì)于退變的椎間盤疾病是一個(gè)有價(jià)值的治療方法。2.2 BMSC轉(zhuǎn)化髓核的體外實(shí)驗(yàn)研究體外實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的最常見(jiàn)方法是使用細(xì)胞因子刺激。Steck等13采用三維培養(yǎng)BMSC，用TGF-1刺激，成功誘導(dǎo)BMSC向軟骨樣細(xì)胞分化。使用cDNA-array技術(shù)檢測(cè)相關(guān)的45個(gè)基因發(fā)現(xiàn)，將分化后的干細(xì)胞基因表達(dá)特征與軟骨細(xì)胞和椎間盤細(xì)胞比