肌酸激酶同工酶——MB

1、a-L-巖藻糖昔底物測(cè)定AFU的活的評(píng)估元升生物科技技術(shù)研發(fā)部1概述a-L-巖藻糖甘酶(a-L-Fucosidase, AFU)的分類(lèi)名為a-L-巖藻糖甘酶水解酶 (EC3. 2. 1. 51),催化巖藻糖甘鍵水解，參與含巖藻糖的低聚糖、糖肽、糖蛋 白和糖脂的分解代謝。AFU合成于細(xì)胞內(nèi)，定位于溶酶體，是一種酸性水解酶， 它的本質(zhì)是糖蛋白。廣泛分布于人體肝、腎、胰、腦和胎盤(pán)等組織以及血清、尿液、唾液和淚液中。AFU在人體內(nèi)呈多形性，在等電聚焦電泳中AFU可分出5 9條區(qū)帶，血清中AFU除含有PI為4. 68和4. 84兩種主要成分以外，還可見(jiàn) 到5個(gè)次要成分。AFU具有3型同工酶，即AFU1、

2、AFU2和AFU3 ,是由1個(gè) 位于第一號(hào)染色體短臂(1p34)上基因位點(diǎn)的2個(gè)等位基因所表達(dá)，由于不同人 所表達(dá)的同工酶類(lèi)型不同，所以正常人群 AFU活性也有所不同，大約有10%左 右的正常人血漿AFU呈低活性。測(cè)定a-L-巖藻糖甘酶(a-L-Fucosidase,AFU)對(duì)診 斷原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)M有重要臨床意義。它是PHC的特 異性標(biāo)志物，可用于PHC的早期診斷.2原理底物CNP-AFU在血清樣本中a-L-巖藻糖甘酶酶作用下，生成產(chǎn)物 CPNP,而產(chǎn)物 CPNP的生成量與樣本中AFU的酶活性成正比，通過(guò)測(cè)定黃色產(chǎn)物在 405nm波長(zhǎng)

3、的生成速率，即可計(jì)算出樣本中AFU的活性。3實(shí)驗(yàn)方法3.1 樣本 瑞安市人民醫(yī)院臨床新鮮血清樣品。3.2 儀器和試劑CNP-AFU元升生物科技生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1213M05QH。進(jìn)口底物購(gòu)自美國(guó)sigm心司，批號(hào)1013c07QH;儀器為日立7080 全自動(dòng)生化分析儀、抗壞血酸、膽紅素、人胎盤(pán) a-L-巖藻糖甘酶均購(gòu)自sigm宓 司，血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海血液中心。3.3 試劑配制方法按常法配制，所用原料均為分析純。3.4 測(cè)定方法 HITACHI 7080自動(dòng)分析儀參數(shù)反應(yīng)類(lèi)型：Rate-A法；反應(yīng)溫度：37C；波長(zhǎng)：（主）340/（次）405nm；樣本：25口 試齊1250口 讀

4、點(diǎn)時(shí)間6-12點(diǎn)0.05, y=0.9813X-0.3746;r=0.9991表明本試劑與進(jìn)口 試劑高度相關(guān)。4.4 回收實(shí)驗(yàn)向250仙血清中加入50仙的生理鹽水作為基礎(chǔ)樣本，測(cè)得 AFU濃度為20U/L ,向同體積的血清標(biāo)本中分別加入 50仙濃度為25U/L和80U/L的AFU酶標(biāo)準(zhǔn)品， 使其終濃度分別為24.2U/L和33.3U/L的樣本，每一濃度作平行管，測(cè)得其回收率為 98.5% 102.4%.4.5 干擾試驗(yàn) 在高、低兩個(gè)濃度的混合血清樣本中分別加入不同濃度的膽紅素、血 紅蛋白、抗壞血酸（MtC）,然合對(duì)AFU進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明三酰甘油0 5.0mmol/L、 Hb 膽紅素0 500

5、pmdL、MtC 0 10g/L時(shí)經(jīng)配對(duì)差異比較，均無(wú)顯著干擾 （P0.05）。而常用抗凝劑中EDTA.K2、草酸鈉對(duì)檢測(cè)無(wú)顯著干擾，但肝素明顯干擾AFU 的檢測(cè)，使AFU結(jié)果出現(xiàn)假性偏高，其干擾機(jī)理尚不清楚。5結(jié)論本公司合成的CNP-AFU底物法用于檢測(cè)AFU活性較為理想，該底物在酸性條件 下，樣本中的AFU將含呈色基團(tuán)的底物CNP-AFU的1, 4位糖昔鍵水解，使反應(yīng) 在405nm處產(chǎn)生最大吸光度，通過(guò)測(cè)定吸光度的變化，即可計(jì)算出樣本中AFU的活性。我們對(duì)公司合成的該底物用于檢測(cè) AFU酶活進(jìn)行其主要指標(biāo)的評(píng)價(jià)，具結(jié) 果顯示批內(nèi) CV 2.2% ,批問(wèn) CV 2.4%。三酰甘油0 5.0mmol/L、Hb 膽紅素W 500pmOL、V讓C010g/L時(shí)對(duì)結(jié)果無(wú)顯著性干擾（P0.05）;經(jīng)與進(jìn)口底 物配制的試劑比對(duì)其結(jié)果高度相關(guān)，完全能滿(mǎn)足臨床檢測(cè)要求。附產(chǎn)品檢測(cè)圖（HPLC）:CHP-AFU 51DC-似34陛常MS1: Suo ES+If?MB4/274.4536792 453 多僅sea34 467,a111111 I 11O.OT- 2.004.006.D00.0010.00120014.001