穩(wěn)定同位素應(yīng)用

1、高精度穩(wěn)定同位素技術(shù)    同位素指質(zhì)子數(shù)相同而中子數(shù)不同的同種化學(xué)元素，最常用的穩(wěn)定同位素有碳-13 (13C)、氮-15(15N)、氫-2 (2H即氘) 和氧(18O)等。因為這些同位素比普通元素重1到2個原子量單位，所以也叫作重元素。穩(wěn)定同位素 (stable isotope) 就是天然同位素或非放射性同位素 (non-radioactive isotope)，即無輻射衰變，質(zhì)量保持永恒不變。穩(wěn)定同位素在自然界無處不在，包括所有化合物、水和大氣，所以也就自然地存在于動植物和人體內(nèi)。其物理化學(xué)性質(zhì)與普通元素相同，所以可用作示蹤劑來標(biāo)記化合物用于科學(xué)研究、臨床醫(yī)

2、學(xué)和藥物生產(chǎn)等幾乎所有自然領(lǐng)域。由于沒有輻射污染，穩(wěn)定同位素示蹤劑可以用于任何對象，包括孕婦、嬰兒和疾病患者，無論是口服還是注射，都絕對安全。     穩(wěn)定同位素技術(shù)的另一特點是其測試定量的高精度和超高精度，達(dá)到PPM級（即百萬分之一精度)，而且同時也測定了化合物的濃度，事半功倍，且降低了測試誤差?，F(xiàn)在，利用同位素技術(shù)人們可以同時測定多個不同的樣品，從而提高測定效率。這些高效率、高精度的特點是放射性同位素等技術(shù)所不可比擬的。     穩(wěn)定同位素技術(shù)的第三個特點是其示蹤能力的微觀性和靈活多變性。微觀性是指它可以用來標(biāo)記、追蹤化

3、合物分子內(nèi)部某個或多個特定原子，比如葡萄糖分子中各個原子在人體內(nèi)的不同代謝途徑, 哪些原子進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量，而哪些原子進(jìn)入脂肪代謝途徑參與脂肪合成。多變性是指通過對同位素標(biāo)記位點的合理選擇和巧妙設(shè)計來追蹤、定性定量測定化合物的不同代謝途徑或者生成過程。     由于以上特性，自上世紀(jì)中葉特別是70年代以來穩(wěn)定同位素技術(shù)在科技先行國家被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)、代謝、食品、農(nóng)業(yè)、生態(tài)和地質(zhì)等研究和生產(chǎn)領(lǐng)域。近年來在藥物研發(fā)生產(chǎn)以及新興的基因工程、蛋白質(zhì)組學(xué) (proteomics)、代謝組學(xué) (metabolomics) 和代謝工程 (meta

4、bolic engineering) 等前沿領(lǐng)域，穩(wěn)定同位素技術(shù)已成為一種應(yīng)用廣泛、獨特高效甚至必須的技術(shù)，顯著地提高了解決科學(xué)問題的能力和生產(chǎn)效率。最新近的例子是德國科學(xué)家用碳13氨基酸通過三代喂養(yǎng)成功地標(biāo)記了動物全身的所有蛋白質(zhì)而獲得了細(xì)胞代謝的重要發(fā)現(xiàn)。這一嶄新的技術(shù)堪比當(dāng)年的聚合酶連鎖反應(yīng)技術(shù) (PCR), 必將迅速得到廣泛的推廣和應(yīng)用，有力地推動生命科學(xué)的發(fā)展。穩(wěn)定同位素在自然界的無所不在意味著該技術(shù)應(yīng)用的普遍性，有大自然顯微鏡的獨特功能，將揭開越來越多的大自然和人體的奧秘。糖耐量試驗與血糖控制  Oral Glucose Tolerance Test and Blood

5、Glucose Control 口服葡萄糖耐受性試驗，即糖耐量試驗，是臨床上常用的一種簡便的預(yù)測、診斷糖尿病的方法。被測者飲用一劑普通葡萄糖后，在以后的2-3小時內(nèi)定時采血，測定血糖濃度的變化。糖尿病的嚴(yán)重程度和病癥的不同發(fā)展時期有著不同的、具有特征性的血糖濃度變化軌跡，例如血糖濃度峰值和下降曲線都可能有所不同。如上圖所示，糖耐量試驗中糖尿病人的血糖濃度升降曲線高于正常人，并且恢復(fù)到試驗前水平需要較長時間。但是，這種方法只能了解全身的糖代謝狀況，而不能提供內(nèi)臟器官的糖代謝情況，例如肝臟和肌肉等組織。在不同的糖尿病人，這些器官的糖代謝會有很大區(qū)別，有些人的糖尿病主要由肝臟的病變引起，有些則是肌肉

6、等外圍組織的緣故，因而治療也應(yīng)有所不同。利用穩(wěn)定同位素示蹤劑技術(shù)可以同時測定肝臟的葡萄糖代謝狀況以及肌肉、脂肪組織的葡萄糖利用狀況，從而提高糖尿病診斷的特異性和可靠性，幫助醫(yī)生制定具有針對性的治療方案，提高療效。換句話說，穩(wěn)定同位素技術(shù)可以用來讓醫(yī)生根據(jù)每個病人的不同病變特點進(jìn)行個性化治療，達(dá)到提高療效的目的。     肥胖癥和超體重是二型糖尿病的高發(fā)群體，其發(fā)病機制往往因為不同器官的病變而有所區(qū)別。穩(wěn)定同位素技術(shù)可以用來對這些群體進(jìn)行定期檢測，及早發(fā)現(xiàn)不同器官的代謝變化，從而對糖尿病的發(fā)生起到預(yù)警和預(yù)防作用。能量消耗測定Energy Expe

7、nditure Determination 體重觀察控制Body Weight Monitoring and Control利用氘(2H)及重氧(18O) 雙標(biāo)記的重水可以用來測定人在自然生活狀態(tài)下的能量消耗，比如在各種正常工作狀態(tài)下、休息時或運動中，并且測試程序簡單。被試者喝入與體重成比例的小量雙標(biāo)記重水后，繼續(xù)正常生活狀態(tài)，只是定時采集幾次尿液、唾液或血液以供儀器測試，測試結(jié)果用來計算能量消耗。此外，還可以根據(jù)能量消耗及體重變化來推算出試驗期間的能量攝入量(即進(jìn)食量)。這些結(jié)果可用于對體重的觀察控制，以便及時制定相應(yīng)措施，比如什么時候應(yīng)該體育鍛煉，什么鍛煉項目合適，運動量應(yīng)該多大。該技術(shù)準(zhǔn)

8、確性高，適用于任何人，無副作用，無毒性，絕對安全。藥物研發(fā)生產(chǎn)和質(zhì)量控制  Drug Research and Development, Production and Quality Control 診斷性呼出氣體試驗概述診斷性呼出氣體試驗概述呼出氣體試驗是一種既方便又經(jīng)濟的臨床診斷方法。其原理是，人體內(nèi)胃腸道或其它器官的病變會造成其組織內(nèi)某些酶活性的變化， 從而對某些化合物的代謝發(fā)生變化。所以，可以用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的化合物作為示蹤劑注入或食入人體，其代謝產(chǎn)物因酶活性的變化而升高或降低。這些代謝產(chǎn)物隨呼出氣體排出體外，所以氣體中示蹤劑代謝產(chǎn)物的變化直接反映酶活性的變化。由于質(zhì)譜儀測定

9、精度高，所以診斷較其他方法更可靠?？诜蜃⑸涫聚檮θ梭w無任何危害，并且從呼出氣體采樣，完全無侵入性或組織創(chuàng)傷，既方便又安全。胃幽門沙氏桿菌感染 胃幽門沙氏桿菌感染的呼吸試驗又叫尿素呼氣試驗，因為所用口服穩(wěn)定示蹤劑是碳-13標(biāo)記的尿素。尿素是食物蛋白質(zhì)的正常代謝產(chǎn)物，是人體內(nèi)的一種自然化學(xué)成分。測試過程很簡單，口服尿素示蹤劑后收集呼出氣體用來測定二氧化碳中的碳-13豐度，就可做出診斷。測試結(jié)果準(zhǔn)確性高，不會誤診，只有活性期的細(xì)菌感染才會導(dǎo)致陽性反映，已經(jīng)治愈的或無活性的感染不會出現(xiàn)陽性反應(yīng)，所以也可以用來檢查沙氏桿菌感染的治療效果。該方法靈敏度高，可以測出低度的感染，而且很方便。胃排空及胃腸運

10、動用來測定胃排空和胃腸道運動的穩(wěn)定示蹤劑加在食物中服用，然后采集呼出氣體進(jìn)行儀器測試。測試結(jié)果用來診斷胃腸道運動機能是否有異常，方法經(jīng)濟、簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可以取代復(fù)雜昂貴的閃爍掃描儀方法。 消化功能病人根據(jù)醫(yī)囑口服某種穩(wěn)定示蹤劑，然后采集呼出氣體樣品用來進(jìn)行儀器測試，從而可以判斷病人是否對某種食物消化不良。病人也可在自己家里服用示蹤劑后收集呼出氣體樣品，然后將樣品寄送給醫(yī)生或?qū)嶒炇摇?#160;肝臟功能 利用穩(wěn)定同位素技術(shù)可以測定、診斷一些肝功能異?；虿∽儭Ｅc其它呼氣試驗一樣，口服穩(wěn)定示蹤劑后收集呼出氣體樣品，用儀器測定氣體中示蹤劑代謝產(chǎn)物的濃度，根據(jù)結(jié)果對病癥做出診斷。穩(wěn)定同

11、位素與營養(yǎng)健康    Stable Isotopes and Nutrition     幾十年來穩(wěn)定同位素技術(shù)被廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)、營養(yǎng)學(xué)和食品研究，從食物營養(yǎng)成分的消化吸收到體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，包括從碳水化合物、脂肪和氨基酸、蛋白質(zhì)和維生素到微量元素所有營養(yǎng)物質(zhì)。其非放射特性(即不衰變，無幅射污染)免除了由放射性而引起的對試驗者和受試者的生物輻射不安全因素，從而使直接研究孕婦與兒童成為現(xiàn)實。例如，用穩(wěn)定同位素作為示蹤劑可以研究母體飲食成分和習(xí)慣對嬰兒的代謝、營養(yǎng)物質(zhì)攝取量和生長發(fā)育的影響。普通人、體育工作者以及病人的營養(yǎng)代謝和能量需要

12、都可用穩(wěn)定同位素來進(jìn)行定量測定研究。在動物營養(yǎng)領(lǐng)域，則可以用來測定動物的生長發(fā)育和肉蛋產(chǎn)量。此技術(shù)已成為人體營養(yǎng)、臨床試驗和動物營養(yǎng)中不可缺少的基本手段。蛋白質(zhì)組學(xué) Proteomics         隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的興起，非放射性同位素技術(shù)在這些領(lǐng)域里的應(yīng)用發(fā)展很快。此技術(shù)可以用來同時分析測定多個不同的樣品，從而消除了個體間的分析差異，提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，而且加快了研究速度。 其工作原理是利用兩種以上不同的穩(wěn)定同位素標(biāo)記形式來標(biāo)記不同的樣品中的蛋白質(zhì)或肽，然后把這些樣品混合在一起進(jìn)行分析測試?，F(xiàn)在，

13、市場上已有好幾種由穩(wěn)定同位素標(biāo)記的試劑，做到可以同時測定8個樣品 （例如iTRAQ, iCAT, ICPL, SILAC 等）。 由于這些樣品的標(biāo)記不同，所以在測試中合而不混，互不干擾。下面舉一個例子。兩個樣品(人或細(xì)胞)，一個正常，另一個患癌癥。取樣后，兩個樣品分別由兩種不同的同位素標(biāo)記，進(jìn)行培養(yǎng)，然后混合，最后分析測定兩個樣品中的蛋白質(zhì)A的量差，如圖所示。        從以上檢測結(jié)果可以看出，正常和癌變兩個樣品中的同一蛋白質(zhì)A有量的顯著差異，即癌變樣品含有的蛋白質(zhì)A的量是正常樣品的兩倍。因為兩個樣品是合二而一來測定的，

14、所以它們之間沒有由測試引入的分析差異，因而此定量結(jié)果具有不偏性，準(zhǔn)確可靠。這一技術(shù)可以利用更多種不同的非放射性同位素來同時分析更多個不同的樣品，所以同時也大大地提高了工作效率，因而也就具有顯著的經(jīng)濟效益。畜牧獸醫(yī)-動物發(fā)育和肌肉生長 Animal Development and Production傳統(tǒng)上研究和測定家畜動物的蛋白質(zhì)合成和肌肉生長是利用原始的稱重法，簡便易行但比較粗放，結(jié)果誤差大。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，這種古老的辦法在很多情況下已不適用，而要求用更精確、更科學(xué)的方法來研究動物生產(chǎn)。最常用的方法是同位素示蹤法，包括放射性和非放射性兩種。前者由于放射性同位素的較早商業(yè)生產(chǎn)而及

15、早得到了應(yīng)用，但是由于其放射污染而造成對人體、動物及環(huán)境的污染等諸多限制，放射性同位素的應(yīng)用越來越不受歡迎而呈現(xiàn)下降趨勢。從上世紀(jì)中期以來開始流行的非放射性（穩(wěn)定）同位素技術(shù)由于其安全可靠而受到人們的青睞。通常用于測定肌肉生長的穩(wěn)定示蹤劑包括由碳13、氮15或氘標(biāo)記的氨基酸，將其通過飼喂、靜脈注射或腹膜腔注射，然后定期采集肌肉樣品來測定該示蹤劑在肌肉中的豐度（即進(jìn)入肌肉的示蹤劑的量），從而計算得到肌肉蛋白的合成速率或增長率。由于質(zhì)譜儀測定的高精度甚至超高精度，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠。而且可以同時測定任何組織，比如在同一次試驗中可以測定不同部位的骨骼肌、心肌、肝臟等各個組織器官的蛋白質(zhì)合成。試驗也可以是

16、存活試驗，只需要在被測試動物肌肉組織采集極小量的樣品（毫克級）即足夠供儀器測試所用。隨著穩(wěn)定同位素技術(shù)的不斷發(fā)展提高，示蹤劑投放以及樣品的測定越來越先進(jìn)、簡便和可靠。比如可以用經(jīng)濟易用的重水（D2O 或 2H2O) 作為示蹤劑。因為蛋白質(zhì)合成時需要結(jié)合水分子，所以重水中的氘原子便進(jìn)入新合成的蛋白質(zhì)。通過對肌肉蛋白質(zhì)中氘的豐度和體液中氘的豐度的比較，就可以計算得到該組織的蛋白質(zhì)合成速率或肌肉增長率。另外，示蹤劑的投放途徑可以根據(jù)情況和需要改變，抑或是靜脈恒速灌流，或者是一次性腹膜腔內(nèi)大劑量注射（也叫洪水式投放），都可以通過利用相應(yīng)的數(shù)學(xué)處理來得到正確的結(jié)果。下圖是一組仔豬試驗結(jié)果，通過腹膜腔注射

17、一大劑量氘標(biāo)記的苯丙氨酸后其血漿豐度隨時間的變化曲線。從途中可以看到，15分鐘以后血漿苯丙氨酸示蹤劑豐度進(jìn)入平臺期，所以在此期間可以采集組織樣品，測試組織蛋白中氘苯丙氨酸的豐度，從而計算得到該蛋白質(zhì)的合成速度：       蛋白質(zhì)合成速率, % = 組織蛋白質(zhì)中氘-苯丙氨酸豐度  ÷ 血漿氘-苯丙氨酸豐度 x 100% 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)-肥料利用率    Fertilizer Unitilzation Efficiency   利用同位素示蹤技術(shù)測定作物的肥料利用

18、率：將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肥料施用于作物的土壤里，可利用同位素稀釋原理來定量測定作物體內(nèi)來自肥料中的各種營養(yǎng)成分，從而得知作物對肥料養(yǎng)分的吸收利用率。此方法直接簡單，與通過比較施肥和不施肥條件下養(yǎng)分吸收差值法來測定肥料養(yǎng)分利用率相比，穩(wěn)定同位素示蹤法更接近自然條件下的植物生長發(fā)育狀況，從而可以在正常的生產(chǎn)和施肥條件下進(jìn)行，真實地反映植物對肥料的利用情況。 同位素稀釋原理: 利用同位素示蹤法測定作物肥料利用率的基本技術(shù)是同位素稀釋法，其原理如下。同位素標(biāo)記的某肥料養(yǎng)分（示蹤劑）與天然的、未標(biāo)記的同種養(yǎng)分（被示蹤劑，亦即被測養(yǎng)分）在土壤和植物中的代謝行為相同，植物對其吸收利用也相同。應(yīng)用時，示蹤劑和被

19、示蹤劑按一定比例混合后施用于土壤里（該比例即肥料中被測養(yǎng)分同位素豐度）。當(dāng)示蹤劑被植物吸收后，被植物內(nèi)原有的被測養(yǎng)分稀釋，因而植物體內(nèi)該養(yǎng)分的示蹤劑豐度（即該養(yǎng)分中所含示蹤劑的濃度）比肥料中該養(yǎng)分示蹤劑的豐度要低，因而形成一豐度差，用豐度比來表示。 此豐度比即是該肥料養(yǎng)分在植物內(nèi)被稀釋的倍數(shù)，即稀釋度，其倒數(shù)就是植物體內(nèi)新吸收來的肥料養(yǎng)分的度量，由分?jǐn)?shù)（例如 0.1）或百分?jǐn)?shù)（例如10%）來表示。 此例數(shù)的含義是，植物體內(nèi)該養(yǎng)分中有10%是從肥料中吸收而來。生態(tài)環(huán)境-鳥類遷徙Bird Migration        

20、60; 動物、鳥類的出生地段、繁殖基地和活動區(qū)域的植被非放射性同位素組成及濃度就像無形的標(biāo)簽一樣把每一個息者準(zhǔn)確地進(jìn)行了標(biāo)記。由于體內(nèi)脂類和蛋白質(zhì)合成都需要氫原子，所以它們的毛發(fā)和羽毛中的重氫含量反映了棲息地的重氫含量。無論它們走到哪里，只要對它們的毛發(fā)、羽毛重氫(即氘)進(jìn)行測試比較，就可以知道它們的原產(chǎn)地或棲息地，還可以推斷出它們的遷徙途徑。比如美麗的北美洲鳴鳥 (見圖) 秋季開始向南遷徙，于冬季到達(dá)中美洲過冬。鳥類學(xué)家通過對它們遷徙途中脫落的羽毛氘含量測定后得知，在北美洲最北端繁殖棲息的鳴鳥最早在秋季開始南遷，于冬季最早到達(dá)中美洲南端，即所謂的蛙跳式遷徙理論，而這些知識除了用同位

21、素術(shù)是不可能得到的。微生物的利用                                Exploiting Microorganisms 1利用穩(wěn)定同位素技術(shù)研究微生物的底物特異性：將混合微生物種群（如反芻動物瘤胃微生物）與碳13標(biāo)記的某一底物（如纖維素）一起培養(yǎng)后，測

22、定各微生物種群的繁殖率。繁殖的快慢由對該底物的依賴性和利用能力所決定。所以，繁殖最快的種群對該底物的依賴性和利用能力最高，反之亦然。這樣，通過逐個地培養(yǎng)各種底物就可以測定微生物種群對底物利用的特異性和依賴性。當(dāng)然，僅此目的無須用標(biāo)記物，用普通底物即可達(dá)到目的，但是有誤判的可能。因為有些種群的繁殖并不是直接利用該底物，而是通過間接地利用別的種群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物來生長繁殖，于是出現(xiàn)誤判。所以標(biāo)記物在此的目的是追蹤該底物的代謝途徑，以免誤判。通過比較微生物體內(nèi)的產(chǎn)物和培養(yǎng)液中底物的碳13豐度，就可以斷定該種群是直接還是間接地利用該底物。同時，這樣的比較還可以測定該種群利用該底物產(chǎn)生其代謝產(chǎn)物的定量關(guān)系

23、。 2提高秸稈飼料的利用率：反芻動物營養(yǎng)學(xué)中一個從未解決的難題是如何提高植物纖維素的消化利用，因為植物纖維素與木質(zhì)素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上互相交織形成木質(zhì)纖維素（lignocellulose)而阻止了微生物對纖維素的降解，所以植物秸稈的利用率很低。其中一個重要原因是人們還不詳細(xì)了解瘤胃微生物生態(tài)和代謝途徑，比如那些微生物種群可以利用木質(zhì)纖維素。將標(biāo)記的纖維素，木質(zhì)素或木質(zhì)纖維素與瘤胃微生物一起培養(yǎng)，然后測定微生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，這樣就可以知道那些種群有能力利用木質(zhì)纖維素，那些只能利用纖維素。對瘤胃微生物代謝生態(tài)的詳細(xì)了解將為基因工程提供理論和實驗依據(jù)，以便采取相應(yīng)措施提高秸稈飼料的利用率。 3甲烷工廠：甲烷是大氣污染的一個重要成分，而反芻動物在其中的貢獻(xiàn)不可忽視，因為其瘤胃內(nèi)某些微生物種群產(chǎn)生大量甲烷，然后進(jìn)入大氣。利用穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)可以測定那些種群利用什么物質(zhì)，以什么速率產(chǎn)生甲烷。4利用秸稈釀酒：有些微生物可以利用植物纖維通過發(fā)酵來生成酒精，如果能夠