PCR檢測時(shí)對實(shí)驗(yàn)室DNA污染的清除

1、紫外線照射清除HBVDNA作用研究劉軍權(quán) 【摘要】 目的 觀察紫外線對PCR外源性HBVDNA污染的作用。方法 用紫外線對不同濃度的HBVDNA陽性血清標(biāo)本和HBV陽性參控品進(jìn)行固相和液相狀態(tài)紫外線照射。結(jié)果 三種干燥后的標(biāo)本隨著紫外線照射時(shí)間的延長，HBVDNA清除率明顯增加。HBV陽性參控品與相同HBVDNA拷貝數(shù)的血清標(biāo)本置紫外線照射后，每相同的照射時(shí)間HBVDNA下降率前者均顯著高于后者。血清標(biāo)本和HBV陽性參控品經(jīng)11萬倍稀釋、紫外線照射2小時(shí)后，前者HBVDNA下降33.3倍，后者下降6250倍。結(jié)論 紫外線消毒法對陽性血清標(biāo)本造成的實(shí)驗(yàn)室污染不能清除；陽性模板經(jīng)紫外線消照射后HB

2、VDNA含量明顯降低；紫外線照射對清除物體表面較低含量陽性HBVDNA模板或HBVDNA引起的氣溶膠可能有效?！疽υ~】 紫外線 消毒 聚合酶鏈反應(yīng) 乙型肝炎病毒Study on Cleared effect of Ultraviolet radiation in induced contamination of HBVDNALIU Junquan , ZHOU Zhonghai, YAN Weimin. Department of Central Laboratory, 97th hospital of PLA, Xuzhou 221004, P. R China【Abstract】Obje

3、ctive To observe the effects of Ultraviolet radiation on contamination of external HBVDNA. Methods HBVDNA positive serum samples and HBV positive control serum samples with different concentration were disinfected by Ultraviolet radiation in solid state and liquid state. Result The cleared rate of H

4、BVDNA in three kinds of dry samples increased markedly along with prolonged disinfectant time of Ultraviolet radiation. After HBV positive control samples and serum samples with same copies have been irradiated by Ultraviolet radiation, it showed that the cleared rate of HBVDNA of the former was rem

5、arkably higher than that of the latter. HBVDNA of serum samples reduced 33.3-fold and that of HBV positive control samples reduced 6250-fold after they were diluted to 1:10000 and disinfected 2 hours by Ultraviolet radiation. Conclusion The positive serum samples induced contamination in laboratory

6、could not been cleared away by Ultraviolet radiation; Been disinfected, the concentration of HBVDNA of positive serum samples reduced obviously; Ultraviolet radiation may have effects in clearing away the low concentration of HBVDNA of positive serum samples or aerosol induced by DNA on surface of o

7、bjects.【Key words】Ultraviolet radiation; disinfect; Polymerase chain reaction; Hepatitis B virus紫外線照射是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）測定的實(shí)驗(yàn)室常用消毒方法，對控制外源性DNA污染引起的假陽性較其他消毒方法更為有效。但是紫外線照射對不同的污染環(huán)境和污染物的消毒效果報(bào)導(dǎo)不一1-3。為了觀察紫外線對HBVDNA消除情況，我們用紫外線對不同濃度的HBVDNA陽性血清標(biāo)本和HBV陽性參控品進(jìn)行固相和液相狀態(tài)紫外線照射比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1 材料和方法1.1 材料 Roche lightcycler 熒光P

8、CR檢測儀（德國羅氏公司產(chǎn)品）；乙肝病毒核酸擴(kuò)增PCR熒光檢測試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限公司產(chǎn)品）；石英紫外線殺菌燈(30W，1米處輻射強(qiáng)度為105Wcm2由江蘇省啟東市熒光廠生產(chǎn))。1.2 方法1.2.1 污染標(biāo)本的制作 將高濃度（5107/ml copies）與低濃度（5103/ml copies）HBVDNA陽性血清標(biāo)本和HBV陽性參控品（5107/ml copies）按1111萬倍比例稀釋加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.1ml。將檢測標(biāo)本分為2組；A組：置4冰箱自然干燥后用紫外線消毒；B組：直接置紫外線燈下照射。1.2.2 紫外線照射時(shí)間的選擇 將A和B組標(biāo)本分別置于紫外線燈下照

9、射30、60、120分鐘后A組標(biāo)本用亞沸蒸餾水恢復(fù)原體積，收集于0.5ml尖低離心管中備用；B組吸取標(biāo)本，置于0.5ml尖低離心管中備用。1.2.3 乙肝病毒核酸擴(kuò)增PCR熒光檢測 按試劑盒說明書要求進(jìn)行 血清標(biāo)本先進(jìn)行DNA提取，然后加入核酸擴(kuò)增試劑（含PCR反應(yīng)液、Taq酶和UNG酶）中，HBV陽性參控品直接加入核酸擴(kuò)增試劑內(nèi)，用Roche lightcycler 熒光PCR檢測儀實(shí)時(shí)監(jiān)控檢測HBVDNA copiesml。2 結(jié)果2.1 A組經(jīng)紫外線照射后HBVDNA含量變化見表1 三種干燥后的標(biāo)本隨著紫外線照射時(shí)間的延長，HBVDNA的清除率明顯增加。HBV陽性參控品與相同HBVDNA

10、拷貝數(shù)的血清標(biāo)本置紫外線照射后，每相同的照射時(shí)間HBVDNA下降率前者均顯著高于后者。血清標(biāo)本經(jīng)紫外線照射2小時(shí)后HBVDNA 11100倍稀釋的標(biāo)本下降15.6倍，11001萬倍稀釋下降5.633.3倍；而HBV陽性參控品經(jīng)11100倍稀釋下降17.9108.7倍，1001萬倍稀釋下降108.76250倍。表1 A組經(jīng)紫外線消毒后HBVDNA含量變化濃度 血清標(biāo)本（5103/ml copies） 血清標(biāo)本（5107/ml copies） HBV陽性參控品（5107/ml copies）（稀釋倍數(shù)） 照射時(shí)間（分鐘） 照射時(shí)間（分鐘） 照射時(shí)間（分鐘）30 60 120 30 60 120 3

11、0 60 1201：1 4.6103 4.9103 5.3103 5.4107 4.9107 4.7107 2.5107 1.1107 2.81061：10 4.5102 4.0102 1.5102 3.1106 2.0106 3.0106 1.2106 9.5105 7.31041：100 4.010 3.510 110 2.1105 1.3105 7.7104 1.3105 3.4104 4.61021：1000 4.5 4.0 3 4.0104 3.5104 9.4103 1.5104 1.9103 8.01：10000 0 0 0 3.5103 8.5102 1.1102 1.7103

12、 4.1102 01：100000 0 0 0 2.0102 1102 1.510 9.010 1.010 02.2 B組經(jīng)紫外線照射后HBVDNA 三種標(biāo)本在液相狀態(tài)下，紫外線照射對HBVDNA降解作用較低，但HBV陽性參控品下降率仍顯著高于血清標(biāo)本，含量變化見表2。表2 B組經(jīng)紫外線消毒后HBVDNA含量變化濃度 血清標(biāo)本（5103/ml copies） 血清標(biāo)本（5107/ml copies） HBV陽性參控品（5107/ml copies）（稀釋倍數(shù)） 照射時(shí)間（分鐘） 照射時(shí)間（分鐘） 照射時(shí)間（分鐘）30 60 120 30 60 120 30 60 1201：1 6.1103 5

13、.1103 5.5103 4.3107 4.7107 4.3107 3.3107 5.0107 2.11061：10 4.3102 3.0102 3.6102 4.5106 5.6106 5.1106 4.5106 1.1106 1.91051：100 2.810 2.210 1.510 4.9105 5.1105 3.7105 2.1105 7.7104 1.11041：1000 6.0 4.0 0 5.6104 4.4104 2.5104 2.2104 9.7103 1.81031：10000 0 0 0 3.8103 2.1103 1.3103 9.5102 1.6102 7.9101：

14、100000 0 0 0 3.510 2.410 1.110 3.010 1.510 7.03 討論P(yáng)CR測定出現(xiàn)假陽性結(jié)果通常是由外源性DNA污染所致，病人標(biāo)本中的病毒顆粒、陽性對照均是造成實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)重污染的主要因素。紫外線可以降解DNA或使DNA發(fā)生突變、失活和破壞DNA結(jié)構(gòu)、阻斷DNA的復(fù)制。所以經(jīng)紫外線照射后DNA難以擴(kuò)增。紫外線照射方便易行，消毒面廣，對室內(nèi)儀器設(shè)備影響較小。因此被廣泛應(yīng)用于各實(shí)驗(yàn)室消毒。但是紫外線消毒效果受燈管的輻射強(qiáng)度、照射時(shí)間、微生物的種類、有機(jī)物的含量、溫度和濕度的影響1,4。為了解紫外線消毒狀況和有效范圍，選擇正確的消毒方法和時(shí)間，以減少實(shí)驗(yàn)室PCR檢測外源性

15、DNA污染，我們將HBVDNA陽性標(biāo)本進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，HBVDNA陽性血清標(biāo)本和HBV陽性參控品經(jīng)低溫干燥后，用紫外線照射2小時(shí)，HBVDNA高拷貝數(shù)的血清標(biāo)本下降比例高于低拷貝數(shù)的血清標(biāo)本，同樣拷貝數(shù)的HBV陽性參控品顯著高于血清標(biāo)本；各種標(biāo)本隨著稀釋倍數(shù)的增加，經(jīng)紫外線照射后HBVDNA的下降比例明顯增加，說明標(biāo)本中有機(jī)物如蛋白質(zhì)等含量的高低直接影響到紫外線的照射效果。HBVDNA陽性血清標(biāo)本和HBV陽性參控品在液相狀態(tài)，經(jīng)紫外線照射2小時(shí)后HBVDNA下降比例不明顯。這一結(jié)果表明，紫外線對HBVDNA陽性的液態(tài)標(biāo)本照射無實(shí)際價(jià)值。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫外線對陽性血清標(biāo)本造成的實(shí)驗(yàn)

16、室污染不能清除；陽性模板經(jīng)紫外線消照射后可以降低其含量，對清除物體表面較低含量陽性DNA模板或DNA引起的氣溶膠可能有效。因此，在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)，必須嚴(yán)格按PCR實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程試驗(yàn)，在操作中應(yīng)盡量減少各種標(biāo)本外溢和濺出，以免引起實(shí)驗(yàn)室污染，每次實(shí)驗(yàn)完畢需認(rèn)真清洗實(shí)驗(yàn)操作臺和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。在進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)環(huán)境應(yīng)用紫外線照射2小時(shí)以上。一旦造成實(shí)驗(yàn)室DNA污染，將直接或可能是不可逆轉(zhuǎn)地影響今后的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)結(jié)果。參考文獻(xiàn)1 劉懷田，李榮芬。紫外線表面消毒應(yīng)用研究的進(jìn)展。中國消毒學(xué)雜志，1994；11（1）：37-382 王占科，祝仲珍。紫外線照射消除PCR技術(shù)外源性DNA污染。人民軍醫(yī)，

17、1997；5：2862973 宋維漢，蘇學(xué)今，張新秀，等。三種物理方法對乙型肝炎病毒消毒效果的觀察。白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998；1：1051074 居喜娟，薛廣波，卞雪蓮，等。紫外線空氣消毒器除菌效果的研究。中國消毒學(xué)雜志,1994；11（4）：233-236 防止PCR外源性HBV-DNA污染的實(shí)驗(yàn)研究 摘要 目的 選擇一種消除實(shí)驗(yàn)室DNA污染的最佳消毒方法。方法 用壓力蒸汽消毒、紫外線消毒、84消毒液、過氧乙酸消毒液、次氯酸鈉溶液和2戊二醛消毒液，按常規(guī)方法對高濃度（5107copies/ml ）與低濃度（5103copies/ml ）HBVDNA陽性血清標(biāo)本和HBV陽性參控品進(jìn)行消毒處

18、理，然后用PCR檢測技術(shù)檢測HBVDNA濃度的變化。結(jié)果 HBVDNA陽性血清標(biāo)本經(jīng)84消毒液消毒后不能檢出HBVDNA；過氧乙酸、次氯酸鈉和戊二醛消毒液及紫外線照射消毒法消毒后HBVDNA含量減少；壓力蒸汽消毒法對血清標(biāo)本中的HBVDNA無作用。結(jié)論 84消毒液能完全清除陽性血清標(biāo)本中的HBV-DNA；高壓蒸汽、過氧乙酸、次氯酸鈉和2戊二醛及紫外線照射消毒法不能完全清除陽性血清標(biāo)本中的HBVDNA。要害詞：乙型肝炎病毒；消毒；方法；聚合酶鏈反應(yīng)中圖分類號： 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： 文章編號：The Study on the Prevention of External HBV-DNA Contamin

19、ationLIU Jun-quan, CHENG Fu-xing, ZHOU Zhong-hai, ZHANG Yu-xi( Department of Central Laboratory, 97 th hospital of PLA, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China)Abstract: OBJECTIVE To select an optima antisepis to avoid DNA contamination during polymerase chain reaction experiments. METHODS Hepatitis

20、virus B(HBV)DNA from serum samples and control samples were antisepsised by six methods, including pressche steam; ultraviolet radiation,84-disinfector, peroxide acetic acid, hypochlirite mareium and 2% glutara ldehyde disinfector. RESULTS HBV-DNA couldnt be detected after being dealed with 84-disin

21、fector, while pressure steam antisipsis had no effects on decreasing DNA contamination. Other four methods had lower efficiency. CONCLUSIONS 84-disinfector is able to clear all the HBV-DNA of positive serum samples, while other five methods are not able to.Key words: Hepatitis B virus; disinfect; me

22、thods; Polymerase chain reaction檢測乙肝病毒（HBV-DNA）在我國常被用來間接評價(jià)消毒劑殺病毒的效果。用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測HBV-DNA具有操作簡便、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但也常因微量污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。近年來，人們采用了許多方法消毒處理不同的污染環(huán)境和污染物1-4，但消毒效果報(bào)導(dǎo)不一。為選擇一種消除實(shí)驗(yàn)室DNA污染的最佳消毒方法，我們選用六種傳統(tǒng)的消毒法進(jìn)行對比研究。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1 材料和方法1.1 材料Roche lightcycler 熒光PCR檢測儀（德國羅氏公司產(chǎn)品）；乙肝病毒核酸擴(kuò)增PCR熒光檢測試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限

23、公司產(chǎn)品）；石英紫外線殺菌燈(30W，1米處輻射強(qiáng)度為105Wcm2由江蘇省啟東市熒光廠生產(chǎn))；XMG12脈動(dòng)真空蒸汽滅菌器（連云港千嬰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；84消毒液（南京江南消毒劑廠產(chǎn)品）；過氧乙酸（江蘇雙氧水廠產(chǎn)品）；戊二醛消毒劑（Merck產(chǎn)品）；次氯酸鈉（上海試劑一廠綜合經(jīng)營公司產(chǎn)品）；甘氨酸和硫代硫酸鈉（中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司）。1.2 方法1.2.1 乙肝病毒核酸擴(kuò)增PCR熒光檢測 按試劑盒說明書要求進(jìn)行 取標(biāo)本0.1ml先進(jìn)行DNA提取，然后加入核酸擴(kuò)增試劑（含PCR反應(yīng)液、Taq酶和UNG酶）中，HBV陽性參控品直接加入核酸擴(kuò)增試劑內(nèi)，用Roche lightcycler 熒

24、光PCR檢測儀實(shí)時(shí)監(jiān)控檢測HBVDNA。1.2.2 中和劑的選擇 84消毒液、過氧乙酸和次氯酸鈉用2.0%硫代硫酸鈉；戊二醛用1甘氨酸。1.2.3 紫外線消毒法 將高濃度（5107copies/ml ）與低濃度（5103copies/ml ）HBVDNA陽性血清標(biāo)本和HBV陽性參控品（5107copies/ml ）按1111萬倍比例稀釋加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔0.1ml；置4冰箱自然干燥后，將標(biāo)本分別置于紫外線燈下照射30、60、120分鐘；用亞沸蒸餾水恢復(fù)原體積，收集于0.5ml尖低離心管中及時(shí)進(jìn)行PCR測定。1.2.4 壓力蒸汽消毒法 將濃度為5107copies/ml 的陽性血清標(biāo)本

25、置試管中，放入高壓滅菌器內(nèi)進(jìn)行123,20min和135,10min加熱消毒后及時(shí)進(jìn)行PCR測定。1.2.5 四種化學(xué)消毒劑對標(biāo)本的消毒處理 吸取濃度為5107copies/ml 的陽性血清標(biāo)本20微升，分別加入經(jīng)120稀釋的84消毒液、1：100稀釋過氧乙酸消毒液、含氯量為2000mg/L的次氯酸鈉溶液和2戊二醛消毒液各80微升于塑料尖底離心管中；在20環(huán)境下，標(biāo)本在84和過氧乙酸消毒液中作用2h，戊二醛和次氯酸鈉消毒劑中作用30min，立即加入相應(yīng)的中和劑中和，然后及時(shí)進(jìn)行PCR測定。1.2.6 對照試驗(yàn) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)4種化學(xué)消毒劑作用相應(yīng)時(shí)間和加入中和劑后，再分別每管加入陽性血清標(biāo)本

26、（5107copies/ml) 20微升，混勻后及時(shí)進(jìn)行PCR測定。2 結(jié) 果2.1 經(jīng)紫外線照射后HBV-DNA含量見表1 三種標(biāo)本隨著紫外線照射時(shí)間的延長，HBV-DNA的清除率明顯增加。HBV陽性參控品與相同HBV-DNA拷貝數(shù)的血清標(biāo)本置紫外線照射后，每相同的照射時(shí)間HBV-DNA下降率前者均顯著高于后者。血清標(biāo)本經(jīng)紫外線照射2小時(shí)后，11100倍稀釋的標(biāo)本，HBV-DNA下降15.6倍；11001萬倍稀釋，HBV-DNA下降5.633.3倍；而HBV陽性參控品經(jīng)11100倍稀釋時(shí)，下降17.9108.7倍，11001萬倍稀釋下降108.76250倍。表1 經(jīng)紫外線消毒后HBV-DNA

27、含量變化濃度 血清標(biāo)本（5103copies/ml ） 血清標(biāo)本（5107copies/ml ） HBV陽性參控品（5107copies/ml）（稀釋倍數(shù)） 照射時(shí)間（分鐘） 照射時(shí)間（分鐘） 照射時(shí)間（分鐘）30 60 120 30* 60* 120* 30 60 1201：1 4.6103 4.9103 5.3103 5.4107 4.9107 4.7107* 2.5107 1.1107 2.81061：10 4.5102 4.0102 1.5102 3.1106 2.0106 3.0106* 1.2106 9.5105 7.31041：100 4.010 3.510 110 2.1105

28、 1.3105 7.7104* 1.3105 3.4104 4.61021：1000 4.5 4.0 3 4.0104 3.5104 9.4103* 1.5104 1.9103 8.01：10000 0 0 0 3.5103 8.5102 1.1102* 1.7103 4.1102 01：100000 0 0 0 2.0102 1102 1.510* 9.010 1.010 0注：*與相應(yīng)照射時(shí)間的HBV陽性參控品結(jié)果比較， p0.05；* 與相同稀釋倍數(shù)的HBV陽性參控品結(jié)果比較，p0.01.2.2 五種消毒法對HBVDNA陽性血清標(biāo)本的影響標(biāo)本經(jīng)不同消毒方法處理后，84消毒液能完全清除HB

29、VDNA陽性血清標(biāo)本中的病毒顆粒，使HBVDNA不能檢出；過氧乙酸消毒液、次氯酸鈉消毒液和戊二醛消毒液及紫外線照射消毒可以減低DNA含量；壓力蒸汽消毒法對HBVDNA無作用，結(jié)果見表2。表2 HBVDNA陽性血清標(biāo)消毒前后DNA含量變化 (copies/ml)消毒方法 消毒前 消毒后 對照試驗(yàn) HBV-DNA減少倍數(shù)壓力蒸汽消毒 123、20min 5107 3.3107 1.5壓力蒸汽消毒 135、10min 5107 9.1107 1.884消毒液 5106 0 3.1106 5106過氧乙酸消毒液 5106 7.3105 2.7106 6.8戊二醛消毒液 5106 2.5106 2.5105 2.0次氯酸鈉消毒液 5106 1.710