新生SD大鼠坐骨神經(jīng)Wallerian變性規(guī)律及其S-100蛋白表達(dá)和雪旺細(xì)胞增殖研究

1、新生SD大鼠坐骨神經(jīng)Wallerian變性規(guī)律及其S-100蛋白表達(dá)和雪旺細(xì)胞增殖研究    【摘要】  目的:了解新生SD大鼠周圍神經(jīng)Wallerian變性不同時(shí)間點(diǎn)S-100蛋白表達(dá)變化及對雪旺細(xì)胞增殖的影響。方法:10 d齡SD大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行結(jié)扎預(yù)變性，分別于術(shù)后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d，進(jìn)行雪旺細(xì)胞培養(yǎng)和S-100免疫組織化學(xué)染色觀察。結(jié)果:在損傷周圍神經(jīng)的近端發(fā)生可逆性變性，遠(yuǎn)端則發(fā)生永久性Wallerian變性。實(shí)驗(yàn)組雪旺細(xì)胞增殖速率與S-100蛋白陽性染色率均優(yōu)于對照組，7 d組增殖能力達(dá)到高峰，S-100蛋白陽

2、性染色率約51%56%，與對照組比較差異有顯著性。結(jié)論:新生SD大鼠周圍神經(jīng)受損后變性過程類似于經(jīng)典的 Wallerian變性，且能在變性中期獲得活力較強(qiáng)及倍增時(shí)間較短的雪旺細(xì)胞。 【關(guān)鍵詞】  雪旺細(xì)胞 Wallerian變性 人工神經(jīng) 組織工程     Abstract:  Objective: To study the S-100 expression change and the effect of reproductive activity on Schwann cells at different time points durin

3、g Wallerian degeneration of the peripheral nerve of the neonatal SD rats. Methods: The sciatic nerves of the 10-day rats were ligated and pre-degenerated and the experimental result was analyzed with the methods of Schwann cells culture and S-100 protein was post-operatively observed in 24 hours, th

4、e 3th day, 5th day, 7th day and 9th day, respectively. Results: The reversible degeneration could take place at the proximal extremity of the damaged peripheral nerve, but the permanent Wallerian degeneration took place at the distal extremity. The reproductive rate of Schwann cells and the positive

5、 staining rate in the experimental group were better than that of the control group. The reproductive ability in the 7th day group reached the peak and the positive rate of S-100 protein was about 51%56% in the 7th day. It had significant difference when compared to the control group. Conclusion: Th

6、e degenerative process of damaged peripheral nerve of the neonatal SD rats is similar to the process of the typical Wallerian degeneration. The stronger reproductive activity and the shorter doubling time of Schwann cells can be obtained during the middle stage of Wallerian degeneration.   

7、;  Key words:  Schwann cell; Wallerian degeneration; artificial nerve; tissue engineering     周圍神經(jīng)受到卡壓、斷裂等損傷后，在損傷遠(yuǎn)端將不可避免發(fā)生Wallerian變性，雪旺細(xì)胞呈階段性增殖，為神經(jīng)軸突再生修復(fù)提供神經(jīng)營養(yǎng)因子。筆者利用這一現(xiàn)象對成年大鼠周圍神經(jīng)作預(yù)變性，在其增殖期內(nèi)取材培養(yǎng)以獲取激活態(tài)雪旺細(xì)胞1；另有研究表明，新生動物來源性雪旺細(xì)胞比成年動物增殖活性高。     本實(shí)驗(yàn)對新生10 d齡SD大鼠坐骨神經(jīng)

8、進(jìn)行結(jié)扎預(yù)變性，參照成年大鼠經(jīng)典Wallerian變性規(guī)律，在變性后不同時(shí)間點(diǎn)取材，進(jìn)行雪旺細(xì)胞培養(yǎng)及坐骨神經(jīng)S-100蛋白免疫組織化學(xué)染色觀察，并與未預(yù)變性組對比，觀察并分析新生SD大鼠Wallerian變性的規(guī)律。     1  材料和方法     1.1  材料與試劑     1.1.1  實(shí)驗(yàn)動物：10 d齡SD大鼠，雌雄不限，體重2530 g（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供）。     1.1.2  實(shí)驗(yàn)用主要試劑與儀器：CO

9、2培養(yǎng)箱（Heraeus BB5060uv型），倒置顯微鏡（Nikon TS100型），高速臺式離心機(jī)（TDL-16G），型膠原酶（Gibaco），DMEM/F12培養(yǎng)液（Gibaco），胎牛血清（杭州四季青公司生產(chǎn)），50 ml培養(yǎng)瓶（丹麥NUNC公司生產(chǎn)）、胰蛋白酶（Sigma公司生產(chǎn)），多聚賴氨酸（Sigma生產(chǎn)），S-100免疫組化試劑盒（北京中山公司提供）。     1.2方法     1.2.1  實(shí)驗(yàn)動物選取及分組：隨機(jī)選取10 d齡SD大鼠80只，所有新生大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)預(yù)Wallerian變性作為實(shí)驗(yàn)組，左

10、側(cè)不予處理作為自身對照組。由8只母鼠喂養(yǎng)。分別于術(shù)后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d隨機(jī)選取16只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中8只進(jìn)行雪旺細(xì)胞培養(yǎng)，余下作免疫組織化學(xué)染色觀察。     1.2.2新生SD大鼠坐骨神經(jīng)Wallerian變性：所有新生SD大鼠術(shù)前均禁飲8 h，經(jīng)0.2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔麻醉后，在無菌條件下作右股后正中切口顯露股二頭肌和臀后血管束，游離右側(cè)坐骨神經(jīng)，在梨狀肌下緣3 mm處用5-0絲線結(jié)扎坐骨神經(jīng)，留2 mm線頭標(biāo)記，分層縫合切口；左側(cè)坐骨神經(jīng)不予處理。術(shù)后仍由母鼠喂養(yǎng)。術(shù)后未有新生鼠死亡，排除對照組切口感染1只，余79只納入

11、檢測、統(tǒng)計(jì)。     1.2.3  雪旺細(xì)胞培養(yǎng)：隨機(jī)選取術(shù)后24 h組、3 d組、5 d組、7 d組和9 d組新生SD大鼠各8只，經(jīng)引頸處死后，浸入0.3%碘伏5 min，切取40只鼠右側(cè)結(jié)扎線遠(yuǎn)側(cè)端1.2 cm長的坐骨神經(jīng)和左側(cè)同等長度坐骨神經(jīng)，并將實(shí)驗(yàn)組與對照組所有坐骨神經(jīng)集中培養(yǎng)。按雙酶消化培養(yǎng)法獲得原代雪旺細(xì)胞，將雪旺細(xì)胞稀釋成（2.53.0）×105/ml，接種1.5 ml于50 ml培養(yǎng)瓶，置于37 、含5% CO2溫箱培養(yǎng)24 h后，用含10-5mol/L的Ara-C的DMEM/F12混合培養(yǎng)液作用24 h，后改為正常DMEM/

12、F12血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。5 d后，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每周更換培養(yǎng)液2次。     1.2.4  繪制雪旺細(xì)胞的生長曲線：當(dāng)24 h組、3 d組、5 d組、7 d組和9 d組及對照組傳2代后的雪旺細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底時(shí)，在每天同一時(shí)間點(diǎn)，吸出培養(yǎng)基，勿棄之，用PBS溶液沖洗2次，勿劇烈震蕩。然后加入0.25%胰蛋白酶消化并于顯微鏡下觀察，待貼壁的細(xì)胞收縮、變圓后，但尚未脫落時(shí)移去消化液，把原培養(yǎng)液倒回，用毛細(xì)吸管充分反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液，鏡下觀察，所有細(xì)胞從培養(yǎng)板壁脫落，取細(xì)胞懸液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)算每ml的細(xì)胞數(shù)，繪制雪旺細(xì)胞生長

13、曲線,并統(tǒng)計(jì)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的所有觀察天數(shù)雪旺細(xì)胞總數(shù)。     1.2.5  S-100免疫組化染色觀察：與取材作雪旺細(xì)胞培養(yǎng)的同時(shí)，各組動物經(jīng)引頸處死后，將術(shù)后24 h組、3 d組、5 d組、7 d組和9 d組余下的新生SD大鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)及對照側(cè)坐骨神經(jīng)同時(shí)取出，置入10%甲醛溶液中，經(jīng)過常規(guī)石蠟切片過程，制成結(jié)扎線遠(yuǎn)側(cè)1 cm坐骨神經(jīng)的縱切片和橫切片，然后采用北京中山公司提供的美國ZYMED公司生產(chǎn)的SP-9003試劑盒對組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)HPIAS-1000 病理圖像分析系統(tǒng)在400倍鏡下每例取3個(gè)視野進(jìn)行自動盲測，計(jì)數(shù)每視野

14、陽性雪旺細(xì)胞數(shù)。     1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法  所有試驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次以上，計(jì)量資料以±s表示，所有的數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組與對照組之間采用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組的不同時(shí)間組間采用單因素方差分析。     2  結(jié)果     2.1  雪旺細(xì)胞觀察  經(jīng)雙酶消化法培養(yǎng)及Ara-C作用去除成纖維細(xì)胞，并傳代2次后，在倒置顯微鏡下對術(shù)后24 h組、3 d組、5 d組、7 d組和9 d組及對照組進(jìn)行雪旺細(xì)胞觀察。

15、結(jié)果發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組均比對照組雪旺細(xì)胞生長旺盛，增殖速率快于對照組，且細(xì)胞倍增時(shí)間短于對照組，尤以7 d組最明顯(見圖1，圖2)。雪旺細(xì)胞呈長梭形，胞體狹窄，胞核透光，核周邊緣有一明亮光暈，并伸出約45m的細(xì)長突起，狀如麥芒，為單極和雙極，少見三極，突起長度可達(dá)胞體橫徑510倍，繼續(xù)培養(yǎng)后，雪旺細(xì)胞的突起繼續(xù)增長，并按略呈“圓形”的規(guī)則形狀不斷生長、分裂和繁殖，細(xì)胞突起首尾相互融合、交聯(lián)，瓶壁上有少許生長不佳的成纖維細(xì)胞。每視野雪旺細(xì)胞的陽性率約為95%。x    【摘要】  目的:了解新生SD大鼠周圍神經(jīng)Wallerian變性不同時(shí)間點(diǎn)S-100

16、蛋白表達(dá)變化及對雪旺細(xì)胞增殖的影響。方法:10 d齡SD大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行結(jié)扎預(yù)變性，分別于術(shù)后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d，進(jìn)行雪旺細(xì)胞培養(yǎng)和S-100免疫組織化學(xué)染色觀察。結(jié)果:在損傷周圍神經(jīng)的近端發(fā)生可逆性變性，遠(yuǎn)端則發(fā)生永久性Wallerian變性。實(shí)驗(yàn)組雪旺細(xì)胞增殖速率與S-100蛋白陽性染色率均優(yōu)于對照組，7 d組增殖能力達(dá)到高峰，S-100蛋白陽性染色率約51%56%，與對照組比較差異有顯著性。結(jié)論:新生SD大鼠周圍神經(jīng)受損后變性過程類似于經(jīng)典的 Wallerian變性，且能在變性中期獲得活力較強(qiáng)及倍增時(shí)間較短的雪旺細(xì)胞。 【關(guān)鍵詞】  雪旺細(xì)胞 Waller

17、ian變性 人工神經(jīng) 組織工程     Research on the rule of the Wallerian degeneration of the sciatic nerve in the neonatal SD rats, its S-100 protein expression and the proliferation of Schwann cells  CHU Ting-gang*, GAO Wei-yang, HUANG Jing-long, et al. *Department of Orthopaedics, the Second

18、Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou, 325027     Abstract:  Objective: To study the S-100 expression change and the effect of reproductive activity on Schwann cells at different time points during Wallerian degeneration of the peripheral nerve of the neonatal S

19、D rats. Methods: The sciatic nerves of the 10-day rats were ligated and pre-degenerated and the experimental result was analyzed with the methods of Schwann cells culture and S-100 protein was post-operatively observed in 24 hours, the 3th day, 5th day, 7th day and 9th day, respectively. Results: Th

20、e reversible degeneration could take place at the proximal extremity of the damaged peripheral nerve, but the permanent Wallerian degeneration took place at the distal extremity. The reproductive rate of Schwann cells and the positive staining rate in the experimental group were better than that of

21、the control group. The reproductive ability in the 7th day group reached the peak and the positive rate of S-100 protein was about 51%56% in the 7th day. It had significant difference when compared to the control group. Conclusion: The degenerative process of damaged peripheral nerve of the neonatal

22、 SD rats is similar to the process of the typical Wallerian degeneration. The stronger reproductive activity and the shorter doubling time of Schwann cells can be obtained during the middle stage of Wallerian degeneration.     Key words:  Schwann cell; Wallerian degeneration; art

23、ificial nerve; tissue engineering     周圍神經(jīng)受到卡壓、斷裂等損傷后，在損傷遠(yuǎn)端將不可避免發(fā)生Wallerian變性，雪旺細(xì)胞呈階段性增殖，為神經(jīng)軸突再生修復(fù)提供神經(jīng)營養(yǎng)因子。筆者利用這一現(xiàn)象對成年大鼠周圍神經(jīng)作預(yù)變性，在其增殖期內(nèi)取材培養(yǎng)以獲取激活態(tài)雪旺細(xì)胞1；另有研究表明，新生動物來源性雪旺細(xì)胞比成年動物增殖活性高。     本實(shí)驗(yàn)對新生10 d齡SD大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行結(jié)扎預(yù)變性，參照成年大鼠經(jīng)典Wallerian變性規(guī)律，在變性后不同時(shí)間點(diǎn)取材，進(jìn)行雪旺細(xì)胞培養(yǎng)及坐骨神經(jīng)S-100蛋白免疫組織

24、化學(xué)染色觀察，并與未預(yù)變性組對比，觀察并分析新生SD大鼠Wallerian變性的規(guī)律。     1  材料和方法     1.1  材料與試劑     1.1.1  實(shí)驗(yàn)動物：10 d齡SD大鼠，雌雄不限，體重2530 g（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供）。     1.1.2  實(shí)驗(yàn)用主要試劑與儀器：CO2培養(yǎng)箱（Heraeus BB5060uv型），倒置顯微鏡（Nikon TS100型），高速臺式離心機(jī)（TDL-16G），型膠原酶（

25、Gibaco），DMEM/F12培養(yǎng)液（Gibaco），胎牛血清（杭州四季青公司生產(chǎn)），50 ml培養(yǎng)瓶（丹麥NUNC公司生產(chǎn)）、胰蛋白酶（Sigma公司生產(chǎn)），多聚賴氨酸（Sigma生產(chǎn)），S-100免疫組化試劑盒（北京中山公司提供）。     1.2方法     1.2.1  實(shí)驗(yàn)動物選取及分組：隨機(jī)選取10 d齡SD大鼠80只，所有新生大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)預(yù)Wallerian變性作為實(shí)驗(yàn)組，左側(cè)不予處理作為自身對照組。由8只母鼠喂養(yǎng)。分別于術(shù)后24 h、3 d、5 d、7 d和9 d隨機(jī)選取16只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中8只進(jìn)行雪旺細(xì)胞培養(yǎng)，余下作免疫組織化學(xué)染色觀察。     1.2.2新生SD大鼠坐骨神經(jīng)Wallerian變性：所有新生SD大鼠術(shù)前均禁飲8