反義寡核苷酸對視網(wǎng)膜色素上皮細胞中端粒酶逆轉錄酶表達及細胞增殖的作用(1)

1、    反義寡核苷酸對視網(wǎng)膜色素上皮細胞中端粒酶逆轉錄酶表達及細胞增殖的作用(1)    】 目的：研究視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞中端粒酶逆轉錄酶(TERT)的表達及其反義寡核苷酸(ASODN)對其表達和細胞增生的抑制作用，為增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)探索基因治療新途徑. 方法：體外培養(yǎng)兔眼RPE細胞，在不同時間采用鏈霉親合素生物素化過氧化物酶復合物(SABC)免疫組織化學法檢測TERT的表達；不同濃度的TERT ASODN和正義寡核苷酸(SODN)分別作用于體外培養(yǎng)的RPE細胞，采用免疫組織化學方法檢測T

2、ERT的表達；四唑鹽比色法(MTT)檢測在不同濃度的TERT ASODN和SODN作用下RPE細胞生長活性及其生長抑制率. 結果：體外培養(yǎng)兔眼RPE細胞可表達TERT，在5，10 mol/L ASODN作用下，TERT的表達明顯受抑制；TERT ASODN能明顯抑制RPE細胞增生活性，并呈劑量依賴性. 結論：一定濃度TERT ASODN能序列特異性地抑制RPE細胞TERT表達和增生活性，有望進一步用于PVR的治療實驗研究.【關鍵詞】 視網(wǎng)膜色素上皮； 寡核苷酸類， 反義； 端粒酶逆轉錄酶【中圖號】 R322.910引言端粒（telomere）是染色體末端高度保守的重復核苷酸序列，隨著細胞的分裂

3、而逐漸縮短，細胞趨向衰亡. 端粒酶是維持染色體長度和功能的重物質，端粒酶的激活可使細胞持續(xù)增殖，避免衰老死亡. 在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinapathy,PVR）的病理過程中，視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE）細胞充當了極其重的角色. 因此抑制RPE細胞的增生成為防治PVR的重途徑. Dickson等1提到端粒酶失活，端粒不斷縮短可能是RPE細胞衰老的原因. 而增生細胞普遍存在端粒酶RNA結構，它可反向合成TTAGGG，加在DNA末端，從而使細胞的分裂不斷進行下去2. 而抑制端粒酶就能夠抑制細胞的這種分

4、裂作用，從而抑制細胞增生. Riches等3曾報道：用端粒酶處理可獲得永生的人視網(wǎng)膜色素上皮系（340RPET53）. 如何通過影響端粒酶活性抑制RPE細胞增生是目前研究的熱點.端粒酶逆轉錄酶（telomerasereverse transcriptase，TERT）作為端粒酶蛋白主組分，被稱為端粒酶活性作用的限速因子4. 端粒酶通常在除永生細胞系外的正常組織無活性表達，而TERT則可在正常組織中表達5. 鑒于TERT在細胞增生過程中的重作用，我們利用反義核苷酸技術，通過封閉TERT基因表達而抑制RPE細胞增生，探索PVR基因治療的新途徑.1材料和方法1.1兔眼RPE細胞的培養(yǎng)摘取健康灰色家兔

5、眼球，按常規(guī)酶消化法眼杯內收獲RPE細胞，加入含200 mL/L新生牛血清的改良Eagle培養(yǎng)液(Dubleccos modified Eagle medium, DMEM)，吹打制成細胞懸液；最后以細胞密度5×104/mL接種于培養(yǎng)瓶中，置37，飽和濕度、50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和傳代. 取第3代的培養(yǎng)細胞,用博士德公司試劑盒作角蛋白免疫組織化學檢測.1.2TERT免疫化學檢測RPE細胞取第5代的RPE細胞,以細胞數(shù)為5×104個/mL的密度接種于置有玻片的24孔板(500 L/孔). 37，50 mL/L CO2條件下，在含200 mL/L新生牛血清的培養(yǎng)液

6、培養(yǎng)24，48，72 h后，取出長有細胞的玻片用SABC法作TERT免疫組織化學檢測：一抗為TERT小鼠抗人(兔、鼠)單克隆抗體(Boster產品)，滴度1100，二抗為羊抗鼠生物素化二抗(1100).1.3制備寡核苷酸(oligodeoxyribonucletide,ODN)備用原液采用與以TERT mRNA翻譯啟始密碼子為起點的一段序列，與該序列互補的為ASODN，與該序列相同的為SODN,序列分別為：5GAGCGCGGGTCATTGTGCT3 (ASODN)，5AGCACAATGACCCGCGCTC3(SODN). 由上海百沃斯生物公司采用DNA生物合成儀合成，全硫代修飾，聚丙烯酰胺凝膠

7、電泳純化后凍干粉保存. 臨用前再加入DMEM液，稀釋成2.5，5和10 mol/L使用.1.4檢測ODN作用下RPE細胞TERT表達取第5代的RPE細胞，以細胞數(shù)5×104/mL密度接種于置有玻片的24孔板(500 L/孔)，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸棄含血清培養(yǎng)液，每孔分別加入500 L的含有上述3種濃度的ASODN和SODN的DMEM液，及無ODN混合液的空白對照DMEM液. 在37, 50 mL/L CO2條件下孵育12 h后加入含200 mL/L新生牛血清的培養(yǎng)液500 L/孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取出長有細胞的玻片按前述SABC法作TERT免疫組織化學檢測. 結果采用盲法計數(shù)，細

8、胞核內呈棕黃染色為陽性標志. 每張培養(yǎng)玻片隨機選取四周及中央視野，在顯微鏡下計數(shù)陽性細胞率，其平均值即代表TERT陽性表達率.            【關鍵詞】視網(wǎng)膜色素上皮；,寡核苷酸類,反義；,端粒酶逆轉錄酶Effect of antisense oligonucleotides on telo         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬

9、原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯(lián)系我們。1.5RPE細胞活性檢測MTT試驗進行RPE細胞的活性檢測. 取第5代RPE細胞，以細胞數(shù)為1×105個/mL密度的細胞懸液接種96孔板，100 L/孔. 常規(guī)培養(yǎng)24 h后換以含上述3種濃度(每一濃度6個平行孔)的ASODN和SODN混合液DMEM液，100 L/孔，分別作為反義組和正義對照組，并各設空白對照. 在37, 50 mL/L CO2條件下孵育12 h后，每孔加入含200 mL/L新生牛血清的培養(yǎng)液100 L繼續(xù)培養(yǎng)12 h，然后每孔吸出上清液100 L再加5 g/L

10、MTT 20 L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，加入二甲亞砜150 L，振搖15 min，于酶標儀550 nm波長下測吸光度(A).統(tǒng)計學處理： 數(shù)據(jù)以x±s表示. 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，所用的統(tǒng)計分析方法為方差分析，多重比較采用LSDt檢驗.2結果2.1兔RPE細胞培養(yǎng)與免疫組織化學鑒定原代培養(yǎng)的RPE細胞多呈扁型或多角形，細胞漿內富含棕褐色顆粒，傳代后色素顆粒消失，細胞形態(tài)轉為梭形. 角蛋白陽性細胞細胞漿呈棕黃色著色，陽性率幾乎達100%.2.2RPE細胞TERT表達TERT免疫組織化學檢測顯示陽性表達細胞細胞核呈斑塊狀或點狀染色，其中部分染色較淡呈弱陽性表達（

11、圖1）.圖1兔RPE細胞TERT的陽性表達SABC ×400（略）2.3ASODN對RPE細胞TERT表達的抑制免疫組織化學檢測顯示5 mol/L和10 mol/L的ASODN對TERT的表達有明顯的抑制作用，其表達陽性率分別為(28.7±5.8)%，(26.3±6.2)%，而空白對照組TERT的表達陽性率為(37.6±4.6)%，與該對照組比較P<0.01，差異有統(tǒng)計學意義. SODN各濃度組作用下的陽性表達率與空白對照組相近，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05, 表1).    2.4ASODN對RP

12、E細胞增生活性的抑制作用ASODN 2.5， 5和10 mol/L濃度組與0 mol/L濃度組比較，細胞的A值差異有統(tǒng)計學意義. 這提示ASODN對RPE細胞的抑制作用可能具有劑量依賴性. SODN組各濃度與0 mol/L濃度組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(表2).表1ODN作用下RPE細胞的TERT表達（略）表2ODN作用下RPE細胞的增殖（略）3討論PVR的病理過程實質為RPE在炎性因子等刺激下，移行、增生并有表型轉化，分泌膠原，形成增生性的視網(wǎng)膜前膜及下膜. 膜的收縮表現(xiàn)為星形皺褶、彌漫性皺褶、環(huán)行或前部收縮，以及“餐巾環(huán)”、“晾衣桿”樣改變，造成牽拉性視網(wǎng)膜脫離6-7. 鑒于RPE細胞的異

13、常增生在PVR病變中起主作用，抑制RPE細胞中端粒酶的活性成為防治PVR的一個方向. 端粒酶是端粒的核酸聚合酶，主由端粒酶RNA組分(TR),端粒酶逆轉錄酶（TERT）和端粒酶相關蛋白（TEP1）3個亞單位組成. 其中TERT是端粒酶的催化亞基，是決定端粒酶活性的限速因子. TERT可在端粒酶活性陰性的細胞異位表達，從而使端粒酶活性重現(xiàn)，使細胞壽命延長. 本實驗證實，RPE細胞可表達TERT，其陽性表達率與細胞的增生活性呈正相關，提示TERT可能是PVR的發(fā)病機制之一. 與Oh等在心肌細胞、Minamino等在大鼠肺血管平滑肌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)端粒酶活性顯著增高相附，均提示TERT與細胞增殖密切

14、相關8-9.反義核苷酸技術是指按照堿基互補配對原則，選擇與特定互補鏈(靶基因)特異性結合，干擾基因的復制、轉錄、剪切或翻譯，從而阻礙某種蛋白合成的一類核酸研究新技術. 目前，作為基因治療的一種方法，正在將反義核苷酸作為一種潛在的藥物進行疾病的治療. 在細胞和組織內有各種核酸酶，能降解寡核苷酸，采取合適的修飾方法可以避免寡核苷酸的降解. 我們采用硫代修飾的ASODN(SASODN)，即核苷酸片段骨架磷上的羥基被巰基取代. SASODN具有良好的溶解性、雜交性和穩(wěn)定性，并能誘導激活大量核糖核酸酶H而被廣泛應用，促進對RNA的降解；無論在細胞內外，SASODN均具有很強的抗核酸酶活性10. 本研究顯

15、示ASODN可顯著抑制TERT在RPE細胞中的表達，而SODN則對TERT表達沒有明顯作用. 我們采用MTT比色法檢測了ODN對細胞增生的影響，統(tǒng)計學分析顯示ASODN對RPE細胞的體外增生有不同程度的抑制，并呈濃度依賴性，而SODN則無顯著性影響，從而顯示出ASODN序列特異性抑制基因表達及細胞增生的作用. 同時，在不同濃度ASODN的作用下，TERT的陽性表達率與RPE細胞的生長抑制有明顯相關，提示TERT可能是RPE細胞增生的機制之一. ASODN對TERT的抑制作用為臨床上治療PVR提供了新思路，但其具體機制尚需進一步探討.【參考文獻】1 Dickson MA, Hahn WC, In

16、o Y. Human keratinocytes that express HTRET and also bypass a P16（INK4a）enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differetiantion characteristicsJ. Mol Cell Biol,2000,20(1):1436-1447.2 Engelhardt M, Martens UM. The implication of telomerase activity and te

17、lomere stability for replicative aging and cellular immortalityJ. Oncol Rep,1998,5(1):1043-1052.3 Reches A, Peddie C, Rendell S. Neoplastic transformation and cytogenetic changes after Gamma irradiation of human epithelial cells expressing telomeraseJ. Radiat Res,2001,155:222-228.4 Cao Y, Li H, Mu F

18、T, et al. Telomerase activation causes vascular smooth muscle cell proliferation in genetic hypertensionJ. FASEB J, 2002,16(1):96-98.5 Kolquist KA, Ellisen LW, Counter CM, et al. Expression of TERT in early premalignant lesions and subset of cells in normal tissuesJ. Nat Genet, 1998,19(2):182-188.6

19、Jerdan JA, Pepose JS, Michels RG, et al. Proliferative vitreoretinopathy membranes: an immunohistochemical studyJ. Ophthalmology,1989,96(6):801-810.7 Wu WC, Kao YH, Tseng HY. The cell cycle distribution of cultured human retinal pigmented epithelial cells under exposure of antiproliferative drugsJ. J Ocul Pharmacol Ther, 2003,19(1):83-90.8 Oh H, Taffet GE, Youker KA, et al. Telomerase reverse transcriptase promotes cardiac muscle cell proliferation, hypertrophy, and survivalJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001,98(18): 10308-10313.