MTT測(cè)定惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性

1、    MTT測(cè)定惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性        摘要：目的探討3-(4.5)-雙甲基-2-噻唑-(2.5)-二苯基溴化四氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。方法采用改良的MTT法檢測(cè)了189例惡性腫瘤標(biāo)本對(duì)9種化療藥物的體外敏感性。結(jié)果51例胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，由高到低依次為絲裂霉素(MMC)，5-氟脲嘧啶(5-Fu)，順鉑(DDP)，阿霉素(ADM)，阿糖胞苷(Ara-C)，平陽霉素(PYM)，甲氨喋呤(MTX)，足葉乙甙(VP-1

2、6)，長(zhǎng)春新堿(VCR)；75例結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，由高到低依次為5-Fu，MMC，PYM，VP-16，MTX，VCR，DDP，Ara-C，ADM。43例肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，由高到低依次為DDP，MMC，5-Fu，ADM，MTX，Ara-C，VP-16，PYM，VCR；20例乳癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，由高到低依次為5-Fu，MMC，DDP，ADM，MTX，PYM，VCR，Ara-C，VP-16。結(jié)論MTT法快速、簡(jiǎn)便、敏感性高、可評(píng)價(jià)率高，適用于惡性腫瘤的藥敏試驗(yàn)，對(duì)臨床用藥有指導(dǎo)意義。關(guān)鍵詞：抗腫瘤藥，多劑聯(lián)用； 藥物敏感試驗(yàn)； MTT法中分類號(hào)：R979.19文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)

3、碼：B 抗癌藥物體外敏感性試驗(yàn)一直是臨床化療界矚目的問題?，F(xiàn)今已建立了多種腫瘤化療藥敏試驗(yàn)方法，但因成功率低和受試條件限制，都未能在臨床推廣應(yīng)用。由Mosman(1983)1建立的MTT顯色法是近年來用于驗(yàn)測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖影響的新指標(biāo)。MTT法具有簡(jiǎn)便、快速、有一定的特異性等優(yōu)點(diǎn)，作者采用MTT法對(duì)189例惡性腫瘤細(xì)胞的體外藥物敏感性進(jìn)行了初步的研究，報(bào)告如下。1材料與方法1.1藥品與試劑阿霉素(ADM，意大利愛寶大藥廠)，順鉑(DDP，山東齊魯制藥廠)，5-氟脲嘧啶(5-Fu，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)，甲胺喋呤(MTX，上海華聯(lián)制藥有限公司)，絲裂霉素(MMC，日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社

4、)，長(zhǎng)春新堿(VCR，中國(guó)民生藥廠)，平陽霉素(PYM，天津太河制藥有限公司)，阿糖胞苷(Ara-C，北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)藥廠)，足葉乙甙(Vp16，北京制藥工業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)藥廠)。MTT(美國(guó)Sigma公司)溶于無酚紅的D-hanks液中，過濾除菌，濃度5 mg/ml，避光冷藏；二甲亞砜(DMSO，北京化工廠)；0.2%膠原酶(型，SIGMA公司)；小牛血清(杭州四季青生物材料研究所)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)。1.2培養(yǎng)與檢測(cè)方法惡性腫瘤細(xì)胞取自本院手術(shù)標(biāo)本，共189例，包括胃癌51例，結(jié)直腸癌75例，肝癌43例，乳癌20例。標(biāo)本于無菌條件下快速送實(shí)驗(yàn)室，用D-Hanks液

5、反復(fù)沖洗3次，RPMI-1640培養(yǎng)液(內(nèi)含青、鏈霉素各200 U/ml)適量浸泡10 min，剪除脂肪、纖維及壞死組織，選取標(biāo)本邊緣生長(zhǎng)好，無壞死的癌組織小塊，再次用D-Hanks液清洗，剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm大??；對(duì)于纖維結(jié)締組織較多、質(zhì)硬的腫瘤加入適量膠原酶消化，37 1 h，并不斷搖動(dòng)(對(duì)于腫瘤組織質(zhì)地柔軟、含纖維結(jié)締組織較少的標(biāo)本則無需用膠原酶消化)，然后用吸管反復(fù)吹吸，吸取細(xì)胞懸液過濾，離心洗滌；100目及200目不銹鋼篩將標(biāo)本研磨過濾，不斷加1640液沖洗，收集濾液離心(1 000轉(zhuǎn)/min)10 min，再洗2次，使癌細(xì)胞純度>90%；并

6、用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活性。加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞濃度為105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中：實(shí)驗(yàn)組分別加入9種抗癌藥；對(duì)照組用培養(yǎng)液替代抗癌藥；空白組僅加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)液，每組設(shè)3-4孔，37 CO2孵箱培養(yǎng)，培養(yǎng)4872 h，向96孔板中各孔加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液，然后加入DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值(波長(zhǎng)=570 nm)。1.3評(píng)價(jià)指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)指標(biāo)為平均細(xì)胞抑制率(IR)，IR=(1-用藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100%，IR>50%為敏感，30%50%為中度敏感，<30%為耐藥。2結(jié)果2.1胃癌藥敏結(jié)果51例胃癌細(xì)

7、胞對(duì)9種藥物的敏感順序?yàn)椋篗MC，5-Fu，DDP，ADM，Ara-C，PYM，MTX，VP-16，VCR(表1)。表151例胃癌體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果受檢藥物受檢例數(shù)敏感例數(shù)中度敏感不敏感敏感率%MMC512125590.25-Fu512024786.3DDP5116251080.4ADM5115221472.5Ara-C518281570.6PYM518251864.7MTX515232354.9VP-1651123923.5VCR515469.8     2.2結(jié)直腸癌藥敏結(jié)果75例結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，由高到低依次為5-Fu，MMC，P

8、YM，VP-16，MTX，VCR，DDP，Ara-C，ADM(表2)。2.3肝癌藥敏結(jié)果43例肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，由高到低依次為DDP，MMC，5-Fu，ADM，MTX，Ara-C，VP-16，PYM，VCR(表3)。2.4乳腺癌藥敏結(jié)果20例乳癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，由高到低依次為5-Fu，MMC，DDP，ADM，MTX，PYM，VCR，Ara-C，VP-16(表4)。 表275例結(jié)直腸癌體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果受檢藥物受檢例數(shù)敏感例數(shù)中度敏感不敏感敏感率%5-Fu753732692.0MMC753434790.6PYM7524351678.7VP-167513402270.7MTX

9、759353158.7VCR758343356.0DDP758313652.0Ara-C7596612.0ADM754715.3     表343例肝癌體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果受檢藥物受檢例數(shù)敏感例數(shù)中度敏感不敏感敏感率%DDP431622588.4MMC431620783.75-Fu431321979.1ADM4310211272.1MTX439201467.4Ara-C435211760.5VP-164393420.9PYM4363713.9VCR433406.9     表420例乳癌體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果受檢

10、藥物受檢例數(shù)敏感例數(shù)中度敏感不敏感敏感率%5-Fu20117290MMC2088480DDP2078575ADM2059670MTX2039860PYM20281050VCR20171240Ara-C2031715VP-16201195     3討論 化療方案?jìng)€(gè)體化一直是惡性腫瘤治療的一個(gè)難題。為此，人們已建立了多種腫瘤化療藥敏測(cè)試方法，但都難以作為常規(guī)試驗(yàn)在臨床上推廣應(yīng)用。Mosman設(shè)計(jì)的MTT顯色法，因其快速、簡(jiǎn)便、結(jié)果重復(fù)性好及半自動(dòng)操作，在抗癌藥物篩選領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)關(guān)于MTT測(cè)定多是用于血液系統(tǒng)腫瘤及“純”腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞系，而新鮮

11、腫瘤組織，尤其是實(shí)體腫瘤組織的藥敏報(bào)導(dǎo)則較少24。本研究將手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織用機(jī)械分離及消化分離兩種方法結(jié)合應(yīng)用，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)后得到近乎“純”的腫瘤細(xì)胞，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致57，說明MTT法可以用于實(shí)體瘤的體外藥敏試驗(yàn)。消化系統(tǒng)腫瘤組織標(biāo)本常伴有污染，部分腫瘤類型質(zhì)地堅(jiān)硬，且常有明顯的纖維結(jié)締組織增生，因此其MTT法藥敏試驗(yàn)的成功率不及血液系統(tǒng)腫瘤。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)取材是防止污染的關(guān)鍵：標(biāo)本應(yīng)在切除后即浸泡在抗生素溶液中，并于術(shù)后2 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室；清除腫瘤表面粘膜組織；取腫瘤邊緣生長(zhǎng)好，無壞死的組織，仔細(xì)清除脂肪及纖維；選取的標(biāo)本須反復(fù)清洗；在分離腫瘤細(xì)胞時(shí)用機(jī)械分離及消化分離兩種方

12、法結(jié)合應(yīng)用。臨床上，惡性腫瘤普遍存在耐藥性，這使得許多惡性腫瘤的化療效果不滿意。本實(shí)驗(yàn)所用的9種抗癌藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率有很大的差異，不同個(gè)體的腫瘤細(xì)胞，既使組織來源相同，對(duì)同一種抗癌藥物的反應(yīng)各異，而同一病人對(duì)不同的抗癌藥反應(yīng)亦不相同，這可能與惡性腫瘤存在著先天性或獲得性的耐藥性及多重耐藥性有關(guān)。通過體外藥敏試驗(yàn)，在患者化療用藥前，測(cè)出其腫瘤細(xì)胞對(duì)各種藥物的敏感程度，施行化療方案?jìng)€(gè)案化，對(duì)提高化療效果，減少盲目用藥，具有一定的指導(dǎo)作用。因此建議在無條件進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的情況時(shí)，可根據(jù)本實(shí)驗(yàn)所顯示的結(jié)果篩選化療藥物：胃癌首選MMC，次為5-Fu，DDP，ADM；結(jié)直腸癌首選5-Fu，次為MMC，

13、PYM，MTX；肝癌首選DDP，次為MMC，5-Fu，ADM；乳癌首選5-Fu，次為MMC。作者簡(jiǎn)介：曾慶華(1964-)，女，湖南長(zhǎng)沙人，湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院實(shí)驗(yàn)師，主要從事外科實(shí)驗(yàn)室工作。曾慶華(湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院 普外科， 湖南 長(zhǎng)沙 410008)呂新生(湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院 普外科， 湖南 長(zhǎng)沙 410008)湯輝煥(湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院 普外科， 湖南 長(zhǎng)沙 410008)參考文獻(xiàn)：1Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to prolif

14、eration and cytotoxicity assaysJ. Immunol Methods, 1983,65(1-2):55-63.2Alley MC, Scudiero DA, Monks A, et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assayJ. Cancer Res, 1988,48(3):589-601.3Campling BG, Pym J, Galbraith PR, et al. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cellsJ. Leukaemia Res, 1988,12(10):823-831.4Sargent JM, Taylor CG. Appraisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid leukacmiaJ. Br Cancer, 1989,