放射性標(biāo)記技術(shù)在藥物研發(fā)中的作用

1、放射性標(biāo)記技術(shù)在藥物研發(fā)中的作用文章來源于本人 微信公眾號 DMPK全面地研究所有藥物相關(guān)物質(zhì)在體內(nèi)的變化規(guī)律，對于藥物安全性和有效性的評估至關(guān)重要。LC/MS技術(shù)常用于定量分析體內(nèi)外試驗(yàn)中母藥的PK特征,代謝物通常結(jié)合預(yù)期的代謝物結(jié)構(gòu)預(yù)測進(jìn)行分析。該方法存在一定的限制性，代謝物和母藥的質(zhì)譜響應(yīng)水平的差別可能造成相對定量的偏差；化學(xué)合成手段無法合成體內(nèi)某些代謝物的標(biāo)準(zhǔn)品；無法反應(yīng)多級代謝過程；漏掉與組織結(jié)合的相關(guān)物質(zhì)等。此時，放射性標(biāo)記技術(shù)顯得十分必要，代謝物的定量變得簡單直接，直接采用代謝物和母藥的比活度表示，同時可以找到與組織蛋白共價結(jié)合的母藥或代謝物。下文將就放射性標(biāo)記技術(shù)在藥物DMPK

2、研究中的方法和應(yīng)用進(jìn)行闡述。1放射性標(biāo)簽的選擇由于化合物分子中均含有C和H,常用的標(biāo)簽主要為 3H和14C兩種。這兩種放射性標(biāo)簽的半衰期相對于試驗(yàn)周期均較長，無需校正放射性天然衰減過程。笳標(biāo)優(yōu)勢：合成相對簡單快捷；可合成高比活性的標(biāo)記化合物用于低劑量高活性化合物的研究。笳標(biāo)劣勢：生物不穩(wěn)定性；同位素效應(yīng)影響化合物代謝特征；氧化代謝生成笊化水造成放射性標(biāo)記丟失。因此，除非14C標(biāo)記化合物的合成難度極大，開發(fā)階段大部分ADME研究用14C標(biāo)記，笳標(biāo)一般只限用于研究蛋白或受體結(jié)合性研究，或早期臨床前的探索性研究用笳標(biāo)后再用14C驗(yàn)證。通常14C標(biāo)記化合物的合成難度高于3H 。 14C通常需要根據(jù)初期

3、的代謝數(shù)據(jù)，選擇化合物化合物分子結(jié)構(gòu)的核心位置，防止代謝物放射性標(biāo)簽 的丟失。2放射性標(biāo)記技術(shù)在DMPK研究中的應(yīng)用 2.1共價蛋白結(jié)合/反應(yīng)性代謝物藥物的大多數(shù)代謝過程均產(chǎn)生水溶性代謝物，類似解毒過程。然而少部分藥物可代謝生成反應(yīng)性代謝物，其可能與功能酶、DNA等大分子共價結(jié)合(CPB),造成酶失活或嚴(yán)重的毒副作用，應(yīng)盡量在藥物發(fā)現(xiàn)階段避免選擇該類分子。藥物與蛋白發(fā)生共價結(jié)合后，常規(guī)方法無法檢測，放射性標(biāo)記法可解決該問題。將帶標(biāo)記的化合物在體外與肝微粒體或肝細(xì)胞孵育后，與蛋白共價結(jié)合的藥物濃度超過 50pmol/mg protein時即認(rèn)為發(fā)生了共價結(jié)合，該閾值可依據(jù)具體篩選需求進(jìn)行調(diào)整。C

4、PB的發(fā)生并不能在機(jī)制上證明反應(yīng)性代謝物的產(chǎn)生，將試驗(yàn)體系中引入谷胱甘肽、氟化物等成分捕獲代謝物，若CPB在捕獲作用下顯著降低，表明了反應(yīng)性代謝物的產(chǎn)生，再對該類代謝物進(jìn)行鑒定后對化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化具有重要的意義。體內(nèi)的物料平衡試驗(yàn) (mass balance )中亦可提示藥物或代謝物與蛋白發(fā)生共價結(jié)合的可能。當(dāng)血漿放射性的半衰期顯著長于藥物自身半衰期時，且回收率低于80%時，則有可能發(fā)生了代謝物與血漿蛋白的共價結(jié)合。該類方法同樣可以用于共價抑制劑藥物的研究。2.2 定量全身放射自顯影( QWBA )QWBA可用于研究化合物全身分布和各組織放射性標(biāo)記藥物的消除規(guī)律。其最大優(yōu)勢是無需進(jìn)行任何代謝物

5、鑒定，即可研究所有組織中藥物相關(guān)物質(zhì)的分布和消除規(guī)律，尤其是靶點(diǎn)組織和潛在毒性組織。QWBA可以亦可用于拓寬常規(guī)可研究組織的范圍，比如皮膚、眼部、髓鞘、胎兒等。此外，組織切片在溶劑清洗作用下大部分化合物會脫落，而共價結(jié)合的化合物會保留亦可用于輔助化合物安全性評估。臨床前動物QWBA研究除了發(fā)現(xiàn)化合物潛在的蓄積風(fēng)險，亦可根據(jù)組織消除速率輔助人體放射性試驗(yàn)中劑量的設(shè)置。2.3 Mass balance 研究物料平衡試驗(yàn)的目的為了揭示化合物吸收進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)的量，著重于找到化合物母藥和代謝物的排泄速率和途徑。該試驗(yàn)為藥物開發(fā)的常規(guī)研究，對于使用笳標(biāo)或14C無明確的要求。一般更傾向于使用14C。給藥方式

6、應(yīng)采用擬開發(fā)的給藥方式，一般于給藥后0, 6, 12, 24, 48h等時間點(diǎn)收集尿液，糞使樣品一般每 24h收集一次，具體截止試驗(yàn)需更具化合物的消除規(guī)律制定，滿足回收率和定量要求即可，一般認(rèn)為回收率大于95% ,或24小時間隔內(nèi)的回收量小于1%。當(dāng)發(fā)生較低的放射性回收率或較慢的消除速率時，則需要對母藥或代謝物共價結(jié)合作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。臨床前的放射性物料平衡研究的種屬，應(yīng)該參考代謝物研究結(jié)果、毒理研究種屬進(jìn)行選擇。該放射性研究一般在早期少數(shù)個體中進(jìn)行，若發(fā)現(xiàn)活性或反應(yīng)性代謝物，可適當(dāng)將該研究后置。Mass balance的樣品可利用放射性標(biāo)記的優(yōu)勢用于進(jìn)行代謝物鑒定，定量分析每種代謝物經(jīng)各個

7、途徑的排泄情況。2.4 代謝物安全性評價(MIST )臨床前安全性試驗(yàn)評價的基礎(chǔ)是毒理種屬的化合物種類和絕對量足夠覆蓋其在人體中的水平，詳細(xì)可參考代謝物安全性評價 (Metabolites in SafetyTesting , MIST)。其中母藥和代謝物的暴露水平則十分重要，一般采用LC/MS對臨床前毒理和臨床樣品進(jìn)行代謝物的定量分析，雖然該方法較方便，但離子化效率的差異可能對結(jié)果造成較大的偏差，造成代謝物水平的低估或高估。而放射性標(biāo)記法可以消除母藥和各代謝物之間相應(yīng)差別，每個代謝物的暴露水平可依據(jù)代謝物的放射性占總放射性的比例計算得到。2.5 微劑量研究在正式I期試驗(yàn)之前，進(jìn)行微劑量的ph

8、ase 0研究探索化合物的PK和ADME性質(zhì)，避免人體 PK性質(zhì)有明顯缺陷的化合物的無意義開發(fā)，亦可用于多個候選化合物的篩選，降低失敗率和研發(fā)成本。但是由于劑量較低，化合物的實(shí)際濃度較低， 可能由于生物分析方法的限制性可能無法完整地展現(xiàn)化合物PK特性，此時可以嘗試采用放射性標(biāo)記法。3放射性研究的限制性成本高，試驗(yàn)條件嚴(yán)苛；由于安全性的限制，無法獲得連續(xù)給藥后穩(wěn)態(tài)下的代謝物情況；放射性回收率變異性較大，影響數(shù)據(jù)分析。由上文可知，放射性標(biāo)記技術(shù)對藥物ADME的研究不可或缺，拓寬了母藥或代謝物的定量方法，發(fā)揮了提高組織適用性、降低定量限度、藥物分布圖像化等特征，對于共價結(jié)合機(jī)制的研究更是不可或缺。從

9、DMPK研究的整體角度看，可將放射性標(biāo)記技術(shù)的運(yùn)用適當(dāng)?shù)厍爸?，在臨床前的體外、QWBA和物料平衡試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)化合物的代謝和排泄特征，盡早理解化合物種屬差異以輔助化合物篩選或安全性評價。References:1 Guengerich, Peter F . Introduction:Use of Radioactive Compounds inDrug Discoveryand Development。.Chemical Research in Toxicology , 2012, 25(3):511-512.2 Elmore C S , Nilsson G N , Isin EM, et al. Use of Radiolabeled Compounds in DrugMetabolism and Pharmacokinetic StudiesJ. 2012, 25(3):532-542.Distribution, Metabolism, andCHEMICAL RESEARCH3 Pe