SMP-QC0028微生物鑒定管理規(guī)程

1、、目的:微生物鑒定管理規(guī)程編寫/修訂人/日期年 月曰部門/姓名品質(zhì)部/A審核人/日期年 月曰部門/姓名品質(zhì)部/第二審核人/日期年 月曰部門/姓名品質(zhì)部/批準(zhǔn)人/日期年 月曰部門/姓名質(zhì)里負(fù)貝人/執(zhí)行日期2018年11月01日頒發(fā)部門品質(zhì)部分發(fā)部門各職能部門簽收/日期：規(guī)范菌種以及控制菌檢查中疑似菌的鑒定程序，以減少菌種污染和生長特性的改變，確保實(shí)驗(yàn)室安全和實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。二、范圍：適用于實(shí)驗(yàn)室所用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株和控制菌檢查中疑似菌的鑒定。三、職責(zé)：品質(zhì)部：確保使用的菌株是可靠的，準(zhǔn)確鑒別樣品中控制菌，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。四、內(nèi)容：1、試驗(yàn)菌株：大腸埃希菌(Escherichia coli ) CMC

2、C(B)44102金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ) CMCC(B)26003枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis ) CMCC(B)63501白色念珠菌(Candida albicans ) CMCC(F)98001黑曲霉(Aspergillus niger ) CMCC(F)98003銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa ) CMCC(B)10104沙門菌(Salmonella ) CMCC(B)500942、菌種確認(rèn)試驗(yàn)的主要內(nèi)容：2.1 菌種的純度確認(rèn)。2.1.1 試驗(yàn)內(nèi)容。菌落形態(tài)：在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測培養(yǎng)物稀釋涂布

3、或平板劃線，適宜培養(yǎng)后，同 一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤等是否相似；對于兩種或以上形態(tài)的 出發(fā)菌株，應(yīng)再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測是否重復(fù)出現(xiàn)相同特征。鏡檢特征：對數(shù)生長期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)呈現(xiàn)一致性；細(xì)胞形狀、大小、莢膜、芽胞等特征應(yīng)相似。2.1.2 菌種的特性確認(rèn)。生化試驗(yàn)：各種微生物具有各自的獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中所參與的物質(zhì)分解和合成代謝的產(chǎn)物也不同，這些代謝產(chǎn)物又具有不同的生化特征。根據(jù)此特征，利用生物化學(xué)方法來鑒定不同的微生物的試驗(yàn)即為微生物的生化試驗(yàn)。2.1.3 菌種的確定方法。用無菌接種環(huán)粘取培養(yǎng)物，在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上劃線分離單個(gè)菌

4、落，并在適宜條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落形態(tài)， 然后挑取單一純菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢， 觀察其染色特性及菌形。再做生化試驗(yàn)或使用菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定菌種。3、大腸埃希菌的確認(rèn)：3.1 菌落形態(tài)。3.1.1 取大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基或膽鹽乳糖中，經(jīng)35 c培養(yǎng)1824h后，形成菌膜，管底有粘液狀沉淀，培養(yǎng)物有糞臭味。第1頁共5頁3.1.2 取上述培養(yǎng)物接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上，35c培養(yǎng)1824h后，觀察結(jié)果。曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）平板上菌落形態(tài)呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈 深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍

5、凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，常有金屬光澤。麥康凱瓊脂平板上菌落形態(tài)呈鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平， 邊緣整齊，表面光滑，濕潤。3.2 革蘭染色、鏡檢。3.2.1 革蘭染色。以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取菌落形態(tài)（3.1.2、）的培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫，再通過火焰23次干燥使固定。滴加結(jié)晶紫染液，染色 1min,水洗干凈。滴加碘液，媒染1min,水洗，以濾紙吸干余水。滴加95%乙醇，脫色 2030s,至流出液無色，水洗。滴加沙黃染液，復(fù)染 1min,待干后，鏡檢。3.2.2 染色結(jié)果應(yīng)是：革蘭陽性菌呈藍(lán)紫色：革蘭陰性菌呈紅色。3.2.3 鏡檢結(jié)果應(yīng)是：

6、兩端鈍圓的短小直桿菌，單個(gè)或成對，革蘭陰性，無芽抱，多有鞭毛，以周身鞭毛運(yùn)動(dòng)或不運(yùn)動(dòng)，許多菌株有莢膜和微莢膜。3.3 生化試驗(yàn)。3.3.1 靛基質(zhì)試驗(yàn)（I）:取菌落形態(tài)（、）的培養(yǎng)物接種于蛋白月東水培養(yǎng)基中，35 C培養(yǎng)24-48h,沿管壁緩慢加入口引喋試劑，輕輕搖動(dòng)試管，于兩者接觸面出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。3.3.2 甲基紅試驗(yàn)（M）:取菌落形態(tài)（、）的培養(yǎng)物接種于葡萄糖蛋白月東水培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)24天后，于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液23滴（約1ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動(dòng)，立即觀察，呈現(xiàn)紅色為陽性，橘紅色為弱陽性，黃色為陰性。3.3.3 乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P）:取菌落形態(tài)（

7、、）的培養(yǎng)物接種于葡萄糖蛋白 月東水培養(yǎng)基中，35c培養(yǎng)482h,于2ml培養(yǎng)液中加入6% a -蔡酚乙醇試液1ml,混勻， 再加40%氧化鉀試液0.4ml ,充分振搖，在4h （通常在20min ）內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽性， 無紅色反應(yīng)為陰性。3.3.4 枸檬酸鹽利用試驗(yàn)（C）:取菌落形態(tài)（、）的培養(yǎng)物接種于枸檬酸鹽培養(yǎng)基斜 面上，35c培養(yǎng)2-4天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生成，培養(yǎng)基中的澳麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色時(shí)為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變、無菌苔生長為陰性。3.3.5 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：取菌落形態(tài)（、）的培養(yǎng)物接種于乳糖發(fā)酵管， 培養(yǎng)24-48h , 觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色：指示劑

8、為澳麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大小都是產(chǎn)氣） 。4、金黃色葡萄球菌的確認(rèn)：4.1 菌落形態(tài)。4.1.1 取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35c培養(yǎng)1824h后，呈均勻渾濁生長，繁殖較多時(shí)易產(chǎn)生沉淀，沉淀易被搖散。4.1.2 取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板和卵黃氯化鈉瓊脂平板上培養(yǎng) 2472h觀察結(jié)果。甘露醇氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑 0.7-1mm。卵黃氯化鈉瓊脂平板上菌落形態(tài)金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1-2mm4.2 革蘭染色、鏡檢。第2頁共5頁4.2.1

9、 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法3.2.1 ）4.2.2 鏡檢結(jié)果：為革蘭陽性球菌，菌體呈球形或略呈橢圓形，菌體較小，菌體大小不一。無芽抱，一般不產(chǎn)生莢膜。排列呈不規(guī)則的葡萄狀，亦可呈單個(gè)、成雙或短鏈狀排列。4.3 生化試驗(yàn)。4.3.1 血漿凝固酶試驗(yàn)。試管法：取無菌試管（10m懷100mm 3支，各加入血漿和 0.9%無菌氯化鈉溶液（1:1） 0.5ml , 1支加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液 0.5ml作為陽性對照：1支加入無菌營養(yǎng)肉湯 0.5ml作為 陰性對照。兩管同時(shí)置37c水浴或恒溫培養(yǎng)箱，3h后開始檢查，以后每隔適當(dāng)時(shí)間觀察一次，直至24ho檢查時(shí)，輕輕將試管傾斜（動(dòng)作勿大），仔細(xì)觀察。陽性對照

10、管：血漿和無菌水混合液加金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，在3h后開始觀察直至24h。結(jié)果：血漿凝固。陰性對照管：血漿和無菌水混合液加稀釋液，在3h后開始觀察直至 24ho結(jié)果：血漿流動(dòng)自如。5、枯草芽抱桿菌的確認(rèn)：5.1 菌落形態(tài)。5.1.1 取枯草芽抱桿菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng) 35c培養(yǎng)1824h后，呈渾 濁生長。5.1.2 取上述培養(yǎng)物劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)2427h觀察結(jié)果：菌落為灰色、干燥、皺縮、無典型卷發(fā)狀。5.2 革蘭染色、鏡檢。5.2.1 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法3.2.1 ）。5.2.2 鏡檢結(jié)果：革蘭陽性芽抱桿菌芽抱為橢圓到柱狀，位於菌體中央或稍偏，芽抱

11、形成后菌體不膨大。6、白色念珠菌的確認(rèn)：6.1 菌落形態(tài)。6.1.1 取白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35c培養(yǎng)2448h后，呈渾濁生長。6.1.2 取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，經(jīng)3035c培養(yǎng)2448h（必要時(shí)延長至 72小時(shí)）。觀察結(jié)果：呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。6.1.3 取上述（6.1.2 ）培養(yǎng)物接種至白色念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，經(jīng)3035c培養(yǎng)2448h （必要時(shí)延長至72小時(shí)）。觀察結(jié)果：平板上為綠色或翠綠色的菌落生長。6.2 革蘭染色、鏡檢及芽管試驗(yàn)取上述（6.1.3 ）

12、培養(yǎng)物接種至1嫖山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 2448h。取培 養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗(yàn)。6.2.1 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法3.2.1 ）6.2.2 芽管試驗(yàn)：挑取1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物， 接種于加有一滴血清 的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)， 置3537c培養(yǎng)13h,置顯微鏡下觀察， 可見到由抱子長出短小芽管。6.2.3 鏡檢結(jié)果：革蘭陽性芽抱桿菌芽抱為厚膜抱子、菌絲、芽管。7、黑曲霉菌的確認(rèn)：7.1鏡檢：可見抱子，菌絲。8、銅綠假單胞菌的確認(rèn)：第3頁共5頁8.1 取銅綠假單胞菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng) 35 c培養(yǎng)1824h后，液面可 形成

13、菌膜，細(xì)菌在深層發(fā)育不良，呈微渾濁或透明狀，菌液上層為藍(lán)綠色。8.1.1 取上述培養(yǎng)物接種于澳化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824h后，觀察結(jié)果：呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤，灰白色，周圍時(shí)有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散。 8.2革蘭染色、鏡檢。1.1.1 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法3.2.1）。1.1.2 鏡檢結(jié)果：銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽抱桿菌。單個(gè)，成對或成短鏈排列。8.3 氧化酶試驗(yàn)。取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸N,N-二甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。 若斜面培養(yǎng)

14、物為非革蘭陰性無芽泡桿菌或氧化酶試驗(yàn)陰性，均判供試品未檢出銅綠假單抱菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠儂菌素試驗(yàn)。8.4 綠儂菌素（Pyocyanin）試驗(yàn)。取斜面培養(yǎng)物接種于 PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng) 24小時(shí)，加三氯甲烷 35ml至培養(yǎng)管 中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸試液約1ml,振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠儂菌素試驗(yàn)陽性， 否則為陰性。同時(shí)用未接種的 PDF瓊脂培養(yǎng)基斜面同法做陰性對照，陰性對照試驗(yàn)應(yīng)呈陰性。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽性及綠儂菌素試驗(yàn)陽性，判斷供試品檢出銅綠假單胞菌。上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧

15、化酶試驗(yàn)陽性及綠儂菌素試驗(yàn)陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。9、沙門菌的確認(rèn)：9.1 取沙門菌新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆臍液體培養(yǎng)基中，經(jīng)35c培養(yǎng)1824h后，呈均勻渾濁生長。9.1.1 取上述培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035 C培養(yǎng)1848小時(shí)。觀察結(jié)果：菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。9.1.2 革蘭染色、鏡檢。9.2 革蘭染色（見大腸埃希菌檢查法3.2.1 ）9.2.1 鏡檢結(jié)果：沙門氏菌為革蘭陰性桿菌，無芽抱，兩端鈍圓。除個(gè)別菌外，都具有鞭 毛，能運(yùn)動(dòng)。9.3 生化試驗(yàn)。9.3.1 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基。用接種針挑選疑似菌落

16、于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng) 1824小時(shí)。結(jié)果判斷： 斜面紅色、底層黑色并顯示黃色； 斜面紅色，底層為黃色；斜面黃色、底層黃色或黑色。9.3.2 靛基質(zhì)試驗(yàn)。將TSI或TSA斜面培養(yǎng)物作生化試驗(yàn)。9.3.2.1 用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白陳水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h,沿管壁滴加24滴靛基質(zhì)試液后，輕搖試管，液面醇層出現(xiàn)玫瑰紅色為陽性。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。9.3.3 尿素酶試驗(yàn)。用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物， 劃線接種于月尿瓊脂斜面， 培養(yǎng)24h,斜面變?yōu)榧t色為陽性反應(yīng)。第4頁共5頁沙門菌屬為陰性反應(yīng)。9.3.4 賴氨酸脫竣酶試驗(yàn)（陽性）用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種于

17、賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基中，同時(shí)接種一支不含賴氨酸脫竣酶培養(yǎng)基的同樣培養(yǎng)基中作為對照，培養(yǎng) 24h48h,觀察結(jié)果：對照管黃色產(chǎn)酸，試驗(yàn)管呈紫色為陽性反應(yīng)；對照管黃色，試驗(yàn)管黃色為陰性反應(yīng)；沙門菌應(yīng)為陽性反應(yīng)。9.3.5 氧化鉀試驗(yàn)。將培養(yǎng)物先接種至肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 1824h,用接種環(huán)沾取1環(huán)培養(yǎng)液，接種至氧化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取1環(huán)培養(yǎng)液接種至不含氧化鉀的同種對照培養(yǎng)基內(nèi)作對照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng) 2448h,觀察結(jié)果：對照管內(nèi)有菌生長（混濁），試驗(yàn)管內(nèi)也有菌生長為陽性反應(yīng)；對照管有菌生長（混濁），而試驗(yàn)管無菌生長（清亮）為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。9.3.6 動(dòng)力檢查。用接種環(huán)沾取培養(yǎng)物，穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 24h,觀察結(jié)果：有動(dòng)力的細(xì)菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基內(nèi)生長使培養(yǎng)基呈混濁現(xiàn)象；無動(dòng)力的細(xì)菌只能沿穿刺線生長，不擴(kuò)散，培養(yǎng)基可見清晰透明狀；無動(dòng)力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保