第5章蛋白質(zhì)的分離純化

1、第第5 5章章 蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時也有等電點。在等電點時( (IsoelectricIsoelectric point point pIpI) )，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場中不移動。場中不移動。在不同的在不同的pHpH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動；粒子帶負(fù)電

2、荷，在電場中向正極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶在等電點偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動。這種現(xiàn)正電荷，在電場中向負(fù)極移動。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳象稱為蛋白質(zhì)電泳( (ElectrophoresisElectrophoresis) )。電泳電泳蛋白質(zhì)在等蛋白質(zhì)在等電點電點pHpH條件條件下，不發(fā)生下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白可以將蛋白質(zhì)進行分離質(zhì)進行分離純化。純化。由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型

3、性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運動等。運動等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。分子雜質(zhì)除去。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)性質(zhì)在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來。沉淀出來。在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱脑跍睾蜅l件下，通過改變?nèi)芤旱膒HpH或

4、電或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質(zhì)的基本方可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。劑沉淀法等。在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)

5、構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水?？赡茉僦匦氯芙庥谒?。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。蛋白質(zhì)的性質(zhì)與它們的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象

6、稱為并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性( (denaturation)。蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等。激烈的攪拌以及強酸和強堿等。大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酸、酪氨酸和

7、色氨酸。這三種氨基酸的在這三種氨基酸的在280280nm nm 附近有最大吸附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280280nm nm 附近附近顯示強的吸收。顯示強的吸收。利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進行定性利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進行定性鑒定。鑒定。二、蛋白質(zhì)分離和純化二、蛋白質(zhì)分離和純化研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。首先需要得到純的蛋白質(zhì)樣品。(1)(1)蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動蛋白質(zhì)來源：微生物細(xì)胞、動物細(xì)胞和植物細(xì)胞；物細(xì)胞和植物細(xì)胞；(2)(2)隨時測定蛋白質(zhì)活性并檢測蛋隨時測定蛋白質(zhì)活性并檢測蛋白質(zhì)

8、含量。白質(zhì)含量。(3)(3)分離和純化過程都必須在溫和分離和純化過程都必須在溫和的條件下進行。的條件下進行。1 1蛋白質(zhì)的分離步驟蛋白質(zhì)的分離步驟(1)(1)生物組織的機械破碎。常用的方法有研生物組織的機械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。(2)(2)根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進行抽提。行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等?；钚詣┏樘岬?。(3)(3)粗提粗提: : 離心除去固

9、體雜質(zhì)后，可通過沉離心除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。質(zhì)粗制品。(4)(4)精制：可用層析法、電泳法等進行精制。精制：可用層析法、電泳法等進行精制。(5)(5)成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。成品。2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)境發(fā)生改變時，蛋白質(zhì)會發(fā)生沉淀作境發(fā)生改變時，蛋白質(zhì)會發(fā)生沉淀作用用(Precipitation)。因為蛋白質(zhì)分子量大小不同、表面所因為蛋白質(zhì)分子量大小不同、表面所代電荷不同、表面的親

10、水和疏水區(qū)域代電荷不同、表面的親水和疏水區(qū)域不同，所以可以通過可逆沉淀法將蛋不同，所以可以通過可逆沉淀法將蛋白質(zhì)分離出來。白質(zhì)分離出來。沉淀法具有部分純化、濃縮特點。沉淀法具有部分純化、濃縮特點。沉淀法沉淀法膜分離法膜分離法萃取法萃取法層析法層析法電泳法電泳法2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)在高濃度的中性鹽溶液中，由蛋白質(zhì)在高濃度的中性鹽溶液中，由于水化層被破壞和表面電荷被中和，于水化層被破壞和表面電荷被中和，容易發(fā)生沉淀容易發(fā)生沉淀陰離子化合物的效果是：陰離子化合物的效果是：NHNH4 4+ +KK+ +NaNa+ +陽離子化合物的效果是：陽

11、離子化合物的效果是：POPO4 43-3-SOSO4 42-2- ClCl- -常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質(zhì)由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時所需的鹽的濃度也不相同，因而可時所需的鹽的濃度也不相同，因而可以將不同的蛋白質(zhì)加以分離。以將不同的蛋白質(zhì)加以分離。2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法在蛋白質(zhì)溶液中，加入一定量的與水在蛋白質(zhì)溶液中，加入一定量的與水互溶的有機溶劑，由于這些溶劑與水互溶的有機溶劑，由于這些溶劑與水的親和力強，能夠破壞蛋白質(zhì)的水化的親和力強，能夠破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而沉淀。層，使蛋白質(zhì)的

12、溶解度降低而沉淀。常用的有機溶劑有乙醇、甲醇和丙酮常用的有機溶劑有乙醇、甲醇和丙酮等。為了防止蛋白質(zhì)在分離過程中發(fā)等。為了防止蛋白質(zhì)在分離過程中發(fā)生變性，有機溶劑濃度不能太高生變性，有機溶劑濃度不能太高(30%-50%)(30%-50%)，而且需要在低溫條件下，而且需要在低溫條件下進行。進行。2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)分子在等電點時，凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子在等電點時，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。易聚集形成沉淀。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物溶液的當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物溶液的pH pH 被調(diào)到某被調(diào)到某一成分的等電點時，則該蛋白質(zhì)大部一成

13、分的等電點時，則該蛋白質(zhì)大部或全部將沉淀出來。而那些等電點高或全部將沉淀出來。而那些等電點高于或低于該于或低于該pH pH 的蛋白質(zhì)仍然留在溶的蛋白質(zhì)仍然留在溶液中。液中。該法適用于在等電點該法適用于在等電點pHpH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法DialysisDialysis此法是利用蛋白質(zhì)分子不能透過此法是利用蛋白質(zhì)分子不能透過半透膜，而使它與其它小分子化合物，如半透膜，而使它與其它小分子化合物，如無機鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小肽以及無機鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小肽以及表面活性劑等分離。表面活性劑等分離。常用的半透膜有玻璃紙或高分子合成材料，常用的半透膜

14、有玻璃紙或高分子合成材料，截止分子量一般為一萬。截止分子量一般為一萬。 透析法透析法2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法透析是將待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在用半透膜制成透析是將待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在用半透膜制成的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液（通常是蒸的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液（通常是蒸餾水或緩沖液）中進行透析。餾水或緩沖液）中進行透析。通透動力為半透膜兩側(cè)的物質(zhì)濃度差。通透動力為半透膜兩側(cè)的物質(zhì)濃度差。 透析法透析法2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法超過濾技術(shù)是在一定的密封容器，施超過濾技術(shù)是在一定的密封容器，施加一定壓力使一定分子量的物質(zhì)透過加一定壓力使一定分子量的物質(zhì)透過超濾膜。超

15、濾膜。其中包括有：中空纖維超濾器、圓筒其中包括有：中空纖維超濾器、圓筒式超濾器板式超濾器。式超濾器板式超濾器。超濾膜的截止分子量有超濾膜的截止分子量有100100萬、萬、5050萬、萬、3030萬、萬、1010萬、萬、5 5萬、萬、1 1萬、萬、5 5千和千和1 1千千2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法兩種親水性高分子或一種高分子聚合兩種親水性高分子或一種高分子聚合物與一種鹽溶液混合后，因疏水性差物與一種鹽溶液混合后，因疏水性差異而分層。不同的蛋白質(zhì)在疏水層的異而分層。不同的蛋白質(zhì)在疏水層的溶解能力不同而被萃取。溶解能力不同而被萃取。目前主要采用兩種體

16、系目前主要采用兩種體系聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇磷酸鉀聚乙二醇磷酸鉀雙水相萃取法雙水相萃取法2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法由于蛋白質(zhì)表面電荷性質(zhì)、疏水性質(zhì)不同，用有由于蛋白質(zhì)表面電荷性質(zhì)、疏水性質(zhì)不同，用有機溶劑、表面活性劑、水構(gòu)成的反相膠束提取某機溶劑、表面活性劑、水構(gòu)成的反相膠束提取某些蛋白質(zhì)。些蛋白質(zhì)。將表面活性劑溶解于有機溶劑中，等體積加入到將表面活性劑溶解于有機溶劑中，等體積加入到蛋白質(zhì)水溶液內(nèi)，混合后可使某些蛋白質(zhì)萃取到蛋白質(zhì)水溶液內(nèi)，混合后可使某些蛋白質(zhì)萃取到反相膠束內(nèi)。反相膠束內(nèi)。2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法最常用的是二氧化碳，在最常用的是二氧化碳，

17、在78.378.3M Mpapa壓壓力下，力下，COCO2 2處于液體狀態(tài)，溫度為處于液體狀態(tài)，溫度為31.131.1C C，當(dāng)壓力或溫度發(fā)生改變時，當(dāng)壓力或溫度發(fā)生改變時，COCO2 2處于氣液中間態(tài)，具有溶劑性能，處于氣液中間態(tài)，具有溶劑性能，可以使許多蛋白質(zhì)及有機物質(zhì)溶解在可以使許多蛋白質(zhì)及有機物質(zhì)溶解在某一狀態(tài)。經(jīng)過泵出、升溫等步驟即某一狀態(tài)。經(jīng)過泵出、升溫等步驟即可分離出來?？煞蛛x出來。2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質(zhì)進行分離的物，將帶有不同電

18、荷的蛋白質(zhì)進行分離的方法。方法。離子交換樹脂可以分為陽離子交換樹脂離子交換樹脂可以分為陽離子交換樹脂（如羧甲基纖維素等），陰離子交換樹脂（如羧甲基纖維素等），陰離子交換樹脂（如二乙基氨基乙基纖維素等）。（如二乙基氨基乙基纖維素等）。帶正電荷多的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合較強，而帶正電荷多的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合較強，而帶正電荷少的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合則較弱。帶正電荷少的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合則較弱。用不同濃度的陽離子洗脫液，如用不同濃度的陽離子洗脫液，如NaClNaCl溶液溶液進行梯度洗脫，通過進行梯度洗脫，通過NaNa+ +的離子交換作用，的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的蛋白質(zhì)進行分離?？梢詫в胁煌姾傻牡?/p>

19、白質(zhì)進行分離。離子交換層析法離子交換層析法2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法離子交換層析法離子交換層析法2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所用的此法又稱為分子篩層析。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。SephadexSephadex- -葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G10-G200G10-G200SepharoseSepharose- -瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠2 2B,4B,6BB,4B,6BSephacrylSephacr

20、yl- -丙烯酰胺葡聚糖凝膠丙烯酰胺葡聚糖凝膠S100,S200,S300,S400S100,S200,S300,S4002 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法利用蛋白質(zhì)表面存在的疏水區(qū)域的強度、利用蛋白質(zhì)表面存在的疏水區(qū)域的強度、大小不同，而被吸附到連接有疏水基團的大小不同，而被吸附到連接有疏水基團的層析介質(zhì)上。層析介質(zhì)上。離子強度增大可增強吸附能力，因此常常離子強度增大可增強吸附能力，因此常常在在2mol/L或或3mol/LNaCl溶解樣品，洗脫時溶解樣品，洗脫時可通過降低鹽濃度、增加乙二醇濃度進行可通過降低鹽濃度、增加乙二醇濃度進行梯度洗脫。梯度洗脫

21、。正丁基正丁基-Sepharose、正辛基正辛基-Sepharose苯基苯基-Sepharose2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體理是不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識別和結(jié)合能力。上的特殊配基具有不同的識別和結(jié)合能力。選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識別和結(jié)合選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識別和結(jié)合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載體共價連接。將這種連接有配基的載與載體共價連接。將這種連接有配基的載體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化的

22、蛋白質(zhì)體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)溶液通過層析柱時，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性結(jié)合在層它蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。液洗脫。2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法 常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋常用的配基有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底物和抑制劑等。層析柱載體為白、酶的底物和抑制劑等。層析柱載體為瓊脂糖凝膠等。瓊脂糖凝膠等。2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法在外

23、電場的作用下，帶電顆粒將向著與其在外電場的作用下，帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)溶液的pHpH值不等于等電點時，蛋白值不等于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。由于不同蛋白質(zhì)顆粒均帶有不同的電荷。由于不同蛋白質(zhì)的分子量不同，所帶的電荷不同，因而質(zhì)的分子量不同，所帶的電荷不同，因而在電場中移動的速度也不相同。在電場中移動的速度也不相同。在外加電場作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆粒在在外加電場作用下，帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動的速度（電場中移動的速度（v v）取決于電場強度取決于電場強度( (E)E)，所帶的凈電荷所帶的凈

24、電荷( (q)q)以及與介質(zhì)的摩擦以及與介質(zhì)的摩擦系數(shù)系數(shù)( (f)f)。2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法SDSSDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約基酸殘基按大約1 1 2 2比例結(jié)合。比例結(jié)合。這樣，每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許這樣，每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的多的SDSSDS而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分而帶有大量的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的負(fù)電荷，而且它們白質(zhì)顆粒都帶有大

25、量的負(fù)電荷，而且它們的電荷密度也大體相同，因此，的電荷密度也大體相同，因此，E E q q值接近值接近一個常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分一個常數(shù)。所以該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。2 2蛋白質(zhì)的純化方法蛋白質(zhì)的純化方法將兩性電解質(zhì)將兩性電解質(zhì)( (pH3-9,pH3-9,或其它范圍的或其它范圍的如如pH5-7)pH5-7)同蛋白質(zhì)樣品一起加入到已同蛋白質(zhì)樣品一起加入到已經(jīng)鋪好的凝膠上，在電場下，兩性電經(jīng)鋪好的凝膠上，在電場下，兩性電解質(zhì)首先達(dá)到它的等電點而平衡，蛋解質(zhì)首先達(dá)到它的等電點而平衡，蛋白質(zhì)樣品根據(jù)它自身的等電點分別向白質(zhì)樣品根據(jù)它自身的等電點分別向兩極移動，最后也達(dá)到平衡。兩極移動，最后也達(dá)到平衡。3.3.蛋白質(zhì)含量的測定蛋白質(zhì)含量的測定定氮法：靈敏度較低定