生化制品中還原糖的測定柱前衍生高效液相色譜法編制說明

1、國家標準生化制品中還原糖的測定柱前衍生高效液相色譜法編制說明（一）工作簡況，包括任務來源、協(xié)作單位、主要工作過程、國家標準主要起草人及其所做的工作等；1、任務來源本標準根據(jù)國標委公布的2018 年第四批國家標準計劃項目（國標委綜合83號），本項目計劃編號為20184459-T-469，名稱為生化制品中還原糖的測定柱前衍生高效液相色譜法。本標準由全國生化檢測標準化技術委員會（SAC/TC 387）提出并歸口。本標準由聯(lián)合起草。2、目的和意義目前，糖的測定主要是滴定法（直接滴定法、高錳酸鉀滴定法、鐵氰化法、奧氏試劑滴定法）、色譜法（ PMP衍生法、 RID、ELSD）、分光光度法（硫酸苯酚法和硫酸

2、蒽酮法）。食品中還原糖測定的最新標準為GB5009.7-2016食品安全國家標準食品中還原糖的測定，將原有標準 GB/T5009.7-2008食品中還原糖的測定 、GB/T5513-2008糧油檢驗糧食中還原糖和非還原糖測定中還原糖測定部分和NY/T1751-2009甜菜還原糖的測定進行了合并。新標準由原先的“推薦使用”變?yōu)榱恕皬娭剖褂谩?；將原標準中的還原糖測定方法分別命名為第一法直接滴定法、第二法高錳酸鉀滴定法、第三法鐵氰化法和第四法奧氏試劑滴定法。新標準擴大了適用范圍、完善了檢測方法，使之在實際應用中更加廣泛合理。 GB/T 30986-2014 生化制品中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測定液

3、相色譜示差折光法，直接測定含量較大的3 種糖，對含量較小的糖無標準辦法測定。 藥典 2015第一部中規(guī)定了鐵皮石斛中甘露醇的PMP衍生試劑法 ,測定的糖的種類只針對一種糖。SC/T3049-2015 刺參及其制品中海參多糖的測定高效液相色譜法。 SN/T 4260-2015 出口植物源食品中粗多糖的測定苯酚- 硫酸法等標準中多糖的測定采用的是硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法，兩種方法大同小異。已有的國家標準對于糖的測定主要是對糖的總量和較大含量糖的測定，不能同時兼顧到含量較小的糖，對于生化制品的質控有一定的局限性。為此，以操作簡單、靈敏度高、準確性好、線性范圍寬、所用試劑毒性小等為原則，建立適合生化試劑

4、中不同含量的還原糖的測定方法迫在眉睫，皆在為更為準確的評價生化試劑等級和功效進行評價，為生化制品的發(fā)展解決基礎技術問題。13、協(xié)作單位4、標準編制過程和主要工作過程4.1 項目預研（1）2017 年2月至2018年3 月，標準起草單位組織相關技術人員對標準項目進行了預研，課題組成員廣泛收集了國內(nèi)外相關標準、文獻，了解了國內(nèi)外相關技術動態(tài)，并且明確了工作思路和進程安排。（2）2018年4月標準起草單位在收到全國生化檢測標準化技術委員會2 號文件后，提交了項目建議書以及國家標準草案。（3）2018年 9月，起草小組對全國生化檢測標準化技術委員會匯報了生化制品中還原糖的測定柱前衍生高效液相色譜法標準

5、的起草工作，與會專家就生化制品中還原糖的測定柱前衍生高效液相色譜法標準（草案）進行了討論，提出了寶貴的意見和建議。主要意見包括適用對象、檢測濃度范圍對應的檢測方法等。標準起草小組根據(jù)專家意見進行了修改和完善。4.2 項目立項（ 3） 2018年12 月收到全國生化檢測標準化技術委員會生檢標2019 1 號文件以及該標委會轉發(fā)的國標委綜合83 號國家標準委關于下達2018年第四批國家標準制修訂計劃的通知立項文件，計劃編號：20184459-T-469。（4） 2018 年 9月至 2020 年 4 月，進行 生化制品中還原糖的測定柱前衍生高效液相色譜法 標準的起草研制工作。完成了生化制品中還原糖

6、的測定柱前衍生高效液相色譜法 標準的編制說明，并對全國生化檢測標準化技術委員會匯報了生化制品中還原糖的測定柱前衍生高效液相色譜法標準（草案）進一步完善和修改情況。（5） 2020 年 4 月 9 日，全國生化檢測標準化技術委員會就生化制品中還原糖的測定 柱前衍生高效液相色譜法標準向全體委員專家（ 44 位專家）征求意見。共收集44位委員專家回函，其中收到？份有意見或建議的單位回函。起草小組已按照專家意見建議進行修改完善。詳見“國家標準反饋意見匯總表生化制品中還原糖的測定柱前衍生高效液相色譜法 標準征求意見稿?！?020 年 5 月 14 日-2020 年 7 月 13 日在國家標準制修訂系統(tǒng)征

7、求意見。(6)年月至月，標準起草小組根據(jù)專家意見， 對標準（征求意見稿）進行修改和完善，形成送審稿，報全國生化檢測標準化技術委員會行審定。2(7)年月日至月日，全國生化檢測標準化技術委員會就標準送審稿組織審查。本 TC 全體委員人數(shù)為44 人，參與投票 44 人，投票同意本標準通過審查人，通過。全體委員中，有人為起草組成員。(8)年月日至月日，標準起草組針對函審專家提出的意見建議進行了匯總整理，主要是單位、格式等一般編輯性的建議，已按專家意見建議修改。有幾條技術性意見修改情況如下：(9)年月日，會后起草小組對標準文本進行了進一步修改和完善。形成了報批稿。報全國生化檢測標準化技術委員會。5、國家

8、標準主要起草人及其所做的工作（二）國家標準編制原則和確定國家標準主要內(nèi)容（如技術指標、參數(shù)、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規(guī)則等）的論據(jù)（包括試驗、統(tǒng)計數(shù)據(jù)） ，修訂國家標準時，應增列新舊國家標準水平的對比；1、標準編制原則本標準的編制依據(jù) GB/T 1.1-2009標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫 ，并參照 GB/T 6379.1-2004測量方法與結果的準確度（正確度與精密度）第1部分 總則與定義和 GB/T 6379.2-2004測量方法與結果的準確度（正確度與精密度）第2部分 確定標準測量方法重復性與再現(xiàn)性的基本方法。2、確定國家標準主要內(nèi)容（如技術指標、參數(shù)、公式、性能要求、

9、試驗方法、檢驗規(guī)則等）的論據(jù)（包括試驗、統(tǒng)計數(shù)據(jù)）2.1分析結果計算與表示式中：X-樣品中還原糖的含量， g/100g ；K-樣品稀釋系數(shù)；C-從標準工作曲線上得到的被測組分溶液濃度，g/mL；V-樣品溶液定容體積， mL；m-所稱試樣的質量， g。2.2 參數(shù)確定3標準規(guī)定了用液相色譜 -紫外法法測定生化樣品中甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖的含量測定。本標準主要技術內(nèi)容：方法原理：生化制品中還原糖經(jīng)水提取，與 1-苯基 -3-甲基 -5-吡唑啉酮在堿性條件下反應，生成糖衍生物，經(jīng)液相色譜紫外檢測器測定，外標法定量。 (1) 儀器條件 : 色譜柱：

10、Alltima C18，5.0 m，4.6*250mm (2) 流動相：A 相為含 20 mM 甲酸銨水溶液（氨水調(diào)節(jié) pH=8.5）； B 相為乙腈 (3) 流速： 0.4 mL/min (4) 柱溫： 20 (5) 檢測器波長： 245nm (6) 進樣量： 10 L； 標準曲線的制作： 分別稱取各還原糖標準樣品 0.025g 于 25mL 容量瓶中，純水定容，混合標準溶液母液濃度為 1000g/mL 。分別取 0.05mL 、0.10mL 、0.25mL、0.5mL、1mL 、2mL 混合標準溶液母液定容至 10mL 容量瓶，配制成 5g/mL 、10 g/mL、25g/mL、 50g/

11、mL 、100g/mL 和 200g/mL 標準溶液濃度系列。 試樣的測定： 分別吸取待測試樣和不同濃度的標準溶液各 200L 置于 15mL 具塞試管中，加入 1mol/L NaOH 溶液 100L ， 0.5mol/L PMP 衍生化試劑 500L ，于 70恒溫水浴 90min，冷卻至室溫，加入 1mol/L HCl 溶液 100L ，減壓蒸餾后加入 2mL 水溶解定容，再加入 2mL 三氯甲烷萃取，充分震蕩、離心，棄去下層有機相，重復此操作 2 次，取上層水相 1mL 經(jīng) 0.45m 濾膜過濾用于 HPLC 分析。以峰面積為縱坐標，混合標準工作溶液濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，用標準工

12、作曲線對樣品進行定量。（三）主要試驗（或驗證）的分析、綜述報告，技術經(jīng)濟論證，預期的經(jīng)濟效果；1、實驗材料及儀器1.1 試劑總體要求本方法所用試劑均為分析純，除特殊說明外，實驗用水均為GB/T 6882 規(guī)定的一級水。乙腈：色譜純?nèi)燃淄椋悍治黾儽交?-3- 甲基 -5- 吡唑啉酮 (PMP)衍生溶液稱取 87.1 g PMP ，加甲醇溶解并稀釋至1L。溶液稱取 40.0 g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1L。鹽酸溶液取 83.2mL 濃鹽酸 , 加水溶解并稀釋至1L。4甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖。標準物質： 99%。標準儲備液稱取 0.1 g糖，精

13、確至 0.0001 g，用水溶解并定容至100 mL ，配置成濃度約為1 000 g/mL的標準儲備液，儲存于 4 條件下，應在 1個月內(nèi)使用。工作曲線的配置分別取 0.05mL 、 0.10mL 、 0.25mL、 0.5mL、 1mL、2mL混合標準溶液母液定容至10mL容量瓶，配制成 5g/mL、10g/mL、 25g/mL、50g/mL、 100g/mL和 200g/mL標準溶液濃度系列。1.2 儀器與設備除實驗室常用儀器設備外，應有下述儀器設備：高效液相色譜儀配紫外檢測器或二極管陣列檢測器分析天平：感量0.1mg數(shù)顯恒溫水浴鍋電熱恒溫干燥箱樣品粉碎機2、實驗方法2.1 試樣制備移取一

14、定量生化制劑，在 100水浴中浸提 30分鐘超聲， 浸提完成后趁熱過濾，用容量瓶定容至 （根據(jù)需要決定稀釋倍數(shù)），經(jīng)0.45 m濾膜過濾后待用。樣品前處理：固體樣品：將樣品粉碎，研細，稱取研細后樣品5g（精確到 0.01g ）于 50mL離心管中，加入 20mL水，在沸水浴中提取30min，超聲提取10min，加入正己烷5mL，振搖或渦旋2min，于5000 轉 /min 離心 5min。得到最上層為正己烷層，中間為水層，最下面為固體沉淀。取中間水層清液待用（可以根據(jù)需要進行稀釋）。含油脂及蛋白類液體樣品：稱取樣品 5g（精確到 0.01g ）于 50mL離心管中， 加入 20mL水，在沸水浴

15、中提取30min，超聲提取10min，加入正己烷5mL，振搖或渦旋2min，于 5000 轉 /min 離心 5min。得到最上層為正己烷層，中間為水層，最下面為蛋白沉淀。取中間水層清液待用（可以根據(jù)需要進行稀釋） 。不含油脂及蛋白類液體樣品：稱取樣品5g（精確到 0.01g ）于 50mL離心管中，加入20mL5水，在沸水浴中提取30min，超聲提取 10min，加入正己烷5mL，振搖或渦旋2min，于 5000 轉/min離心 5min。得到最上層為正己烷層，中間為水層，最下面為蛋白沉淀。取中間水層清液待用（可以根據(jù)需要進行稀釋） 。2.1.3 試樣衍生：分別吸取試樣和不同濃度的標準溶液2

16、00L 于 15mL具塞試管中，加入 1mol/L氫氧化鈉，0.5mol/L 的 PMP 衍生試劑 0.5mL，在 70恒溫水浴中反應90min，冷卻至室溫，加入1mol/L 鹽酸溶液 100L，搖勻后， 70恒溫水浴中氮氣吹干，加入2mL 蒸餾水定容，再加入1mL 三氯甲烷，充分渦旋后靜置或離心，使溶液分層，棄去下層有機層，重復此操作三次，取上層水相過0.45 m濾膜后進入液相色譜分析。2.3儀器參考條件色譜柱： Alltima C18 ， 250*4.6 mm ， 5.0 m；流動相： A相為含 20 mM甲酸銨水溶液（氨水調(diào)節(jié)pH=8.5）； B相為乙腈流速： 0.6 mL/min柱溫：

17、 20檢測器波長： 245nm進樣量： 10 L2.4標準曲線的制作將標準曲線工作液從低到高依次注入液相色譜儀中，測定相應的響應值（峰面積），以標準工作液中糖的濃度為橫坐標，以響應值（峰面積）為縱坐標，繪制標準曲線。標準溶液色譜圖參見附錄A 中圖 A.1。2.5樣品溶液的測定將待測樣品液上機測定。 若待測樣品液中木二糖含量超出標準工作曲線5.0g/mL 200 g/mL范圍，應稀釋合適倍數(shù)后重新測定，記錄色譜圖。根據(jù)保留時間定性，記錄峰面積，根據(jù)標準曲線計算待測樣品液中糖的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次。表 1液相色譜梯度洗脫參考條件時間 /min流速 /(mL/min)流動相 A/%流動相 B

18、/%00.49010350.48020370.41090420.41090430.4901063 分析結果計算與表示式中：X- 樣品中還原糖的含量，g/100g ；K- 樣品稀釋系數(shù)；C- 從標準工作曲線上得到的被測組分溶液濃度，g/mL；V- 樣品溶液定容體積，mL；m-所稱試樣的質量，g。33 實驗結果表 2回收率及精密度（ 5 g/mL 加標）序號化合物回收率RSD%(N=3)備注1甘露糖86.2-95.3%4.222核糖87.3-92.0%3.673鼠李糖84.9-91.1%3.554乳糖84.7-92.3%4.155麥芽糖83.8-92.0%3.126葡萄糖81.3-94.3%2.9

19、67半乳糖81.2-92.5%3.348阿拉伯糖82.3-97.3%2.379木糖85.1-96.8%3.7510巖藻糖86.0-91.2%3.28試驗結論： 加標濃度較低時收校準曲線影響較大。表 3 檢出限結果序號化合物檢出限（ g/mL ）定量限（三倍檢出限）備注（ g/mL ）1甘露糖0.2340.7022核糖0.2370.7113鼠李糖0.2410.7234乳糖0.4511.3535麥芽糖0.4541.3626葡萄糖0.2140.6427半乳糖0.3230.9698阿拉伯糖0.1930.5799木糖0.2100.6310巖藻糖0.3180.9547表 4 線性范圍序號化合物線性范圍R2

20、備注1甘露糖5g/mL-200 g/mL0.99932核糖5g/mL-200 g/mL0.99953鼠李糖5g/mL-200 g/mL0.99914乳糖5g/mL-200 g/mL0.99965麥芽糖5g/mL-200 g/mL0.99976葡萄糖5g/mL-200 g/mL0.99947半乳糖5g/mL-200 g/mL0.99928阿拉伯糖5g/mL-200 g/mL0.99969木糖5g/mL-200 g/mL0.999410巖藻糖5g/mL-200 g/mL0.99924.方法驗證課題組對回收率、線性方程、樣品數(shù)據(jù)結果等參數(shù)進行了驗證，實驗驗證樣品由本標準起草單位提供，將驗證樣品送至甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司、四川省