酶分離純化的評價PPT精選文檔

1、1第二章第二章 酶的生產(chǎn)與分離純化酶的生產(chǎn)與分離純化(2學時，共4學時)2主要內(nèi)容主要內(nèi)容w 酶分離、純化的評價w酶的劑型與保存w酶的分子結(jié)構(gòu)與催化功能34 酶分離、純化的評價酶分離、純化的評價w酶經(jīng)分離、純化后要確定該純化步驟是否適宜，必須經(jīng)過對有關(guān)參數(shù)的測定及計算才能確定。酶的產(chǎn)量是以活力單位表示，因此在整個分離過程中每一步始終貫穿比活力和總活力的檢測、比較。4基本概念基本概念1w酶活力(Enzyme activity)：酶活力是指酶催化反應(yīng)的能力，它表示樣品中酶的含量。w1961年國際酶學會規(guī)定：l min催化lmol分子底物轉(zhuǎn)化的酶量為該酶的一個活力單位 ( 國際單位 ) ，溫度為25

2、 ，其它條件 (pH、離子強度) 采用最適條件。重要5w酶的總活力為樣品的全部酶活力。 總活力 = 酶活力 總體積 (mL) 或 = 酶活力 總質(zhì)量 (g)6w比活力比活力 (Specific activity) ：比活力是指單位蛋白質(zhì) (毫克蛋白質(zhì)或毫克蛋白氮) 所含有的酶活力 (單位/毫克蛋白) 。w比活力是酶純度指標，比活力愈高表示酶愈純，即表示單位蛋白質(zhì)中酶催化反應(yīng)的能力愈大。w但是，比活力仍然是個相對酶純度指標。要了解酶的實際純度，尚需采用電泳等測定方法。7 w回收率回收率 (Yield percent) ：回收率是指提純前與提純后酶的總活力之比。它表示提純過程中酶的損失程度，回收率

3、愈高，其損失愈少。 w提純倍數(shù)提純倍數(shù)：提純倍數(shù)是指提純前后兩者比活力之比。它表示提純過程中酶純度提高的程度，提純倍數(shù)愈大，提純效果愈佳。8酶純化評價實例酶純化評價實例 95 酶的劑型與保存酶的劑型與保存w酶制劑通常有下列四種劑型：n液體酶制劑n固體粗酶制劑n純酶制劑n固定化酶制劑（見書中第五章）105.1 液體酶制劑液體酶制劑 w包括稀酶液和濃縮酶液。一般除去固體雜質(zhì)后，不再純化而直接制成，或加以濃縮而成，一般需要加穩(wěn)定劑。這種酶制劑不穩(wěn)定，且成分復(fù)雜，只用于某些工業(yè)生產(chǎn)。115.2 固體粗酶制劑固體粗酶制劑 w發(fā)酵液經(jīng)殺菌后直接濃縮或噴霧干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工業(yè)生產(chǎn)。有的經(jīng)

4、初步純化后制成，如用于洗滌劑、藥物生產(chǎn)。用于加工或生產(chǎn)某種產(chǎn)品時，務(wù)須除去起干擾作用的雜酶，才不會影響質(zhì)量。固體酶制劑適于運輸和短期保存，成本也不高。125.3 純酶制劑純酶制劑 w包括結(jié)晶酶，通常用作分析試劑和醫(yī)療藥物。要求較高的純度和一定的活力單位數(shù)。用作分析工具酶時，除了要求沒有干擾作用的雜酶存在外，還要求單位質(zhì)量的酶制劑中酶活力達到一定的單位數(shù)。用作基因工程的工具酶要求不含非專一性的核酸酶，或完全不含核酸酶， 13酶的保存方法酶的保存方法w(1) 溫度。w(2) pH與緩沖液。 w(5) 為提高酶穩(wěn)定性，常加入下列穩(wěn)定劑：n 底物、抑制劑和輔酶，它們的作用可能是通過降低局部的能級水平，

5、使酶蛋白處于不穩(wěn)定狀態(tài)的扭曲部分轉(zhuǎn)入穩(wěn)定狀態(tài)。n 對巰基酶，可加入SH保護劑。如二巰基乙醇、GSH(谷胱甘肽)、DTT(二硫蘇糖醇)等。n 其他如Ca2+能保護淀粉酶，Mn2+能穩(wěn)定溶菌酶，Cl能穩(wěn)定透明質(zhì)酸酶。(3) 酶蛋白濃度。(4) 氧。146 酶的分子結(jié)構(gòu)與催化功能酶的分子結(jié)構(gòu)與催化功能156.1 酶分子組成酶分子組成1. 酶蛋白酶蛋白雖然少數(shù)有催化活性的RNA分子已經(jīng)鑒定，但幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì)。酶蛋白有三種組成形式：單體酶，僅有一個活性部位的多肽鏈構(gòu)成的酶分子質(zhì)量為1335 k Dalton，為數(shù)不多，且都是水解酶；寡聚酶，由若干相同或不同亞基結(jié)合而組成的酶，亞基一般無活性，必須

6、相互結(jié)合才有活性，分子質(zhì)量為35 k Dalton以上到數(shù)百萬單位；多酶復(fù)合體，指多種酶進行連續(xù)反應(yīng)的體系。前一個反應(yīng)產(chǎn)物為后一反應(yīng)的底物。162. 輔基或輔酶輔基或輔酶僅有少部分酶是由單一蛋白質(zhì)所組成，而大部分酶則為復(fù)合蛋白質(zhì)，或稱全酶，是由蛋白質(zhì)部分(酶蛋白)和非蛋白質(zhì)部分所組成，即酶蛋白本身無活性，需要在輔因子(Cofactor)存在下才有活性。有機輔因子可依其與酶蛋白結(jié)合的程度分為輔酶(Prosthetic enzyme)和輔基(Prosthetic group)。17（1）鐵）鐵卟啉卟啉w鐵卟啉是細胞色素氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等氧化酶的輔基。w氧化酶的鐵卟啉的功能在于靠鐵的價

7、電子變化（Fe2+Fe3+）來傳遞電子，催化氧化還原反應(yīng)。SCHH3CCH3HCNH3CCHNCH2CH2COOHCH3HOOCH2CH2CNFe2+CHSCH3CHCH3NCH組苯丙賴蘇精半胱谷亮半胱 蘇賴谷圖 3-1 鐵卟啉與酶蛋白的連結(jié)方式18（2）黃素核苷酸黃素核苷酸 (FMN和和FAD等等)w黃素核苷酸為維生素B12 (核黃素) 的衍生物，為黃素酶類 (如氨基酸氧化酶、琥珀酸脫氫酶等) 的輔基。NNNHNH3CH3COOOH OHOOCH2-(CHOH)3-CH2O-P-O-P-O- CH2OHOOHNNNNNH2FMNFAD圖 3-2 FMN與FAD的分子結(jié)構(gòu)19w在酶的催化作用下

8、，F(xiàn)MN和FAD的功能是傳遞氫(傳遞質(zhì)子和電子2H2H+2e)，亦稱氫載體而自成氧化還原體系，反應(yīng)主要表現(xiàn)在6,7二甲基異咯嗪基團中的第1位及第10位N原子的脫氫與加氫。其反應(yīng)式如圖33。7 NNNHNH3CH3COOR1234910568+2H-2HNHNNHHNH3CH3COOR圖 3-3 FMN與FAD的氧化 - 還原體系氧化型(FMN或FAD)還原型FAD. H2）(FMN. H2 或20（3）煙酰胺核苷酸煙酰胺核苷酸(NAD及及NADP)w煙酰胺核苷酸是許多脫氫酶 (如異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、乙醇脫氫酶等) 的輔酶。主要有兩種：煙酰胺腺膘呤二核苷酸 (NAD、輔酶) 和煙酸胺腺

9、膘呤二核苷酸磷酸 (NADP、輔酶)。OOHNNNNNH2OOHCH2OPOOHOPOOO-H2COHN+CONH2OOHNNNNNH2OOHCH2OPOOHOPOOO-H2COHN+OPO3H2OHCONH2NADNADP圖 3-4 NAD與NADP的分子結(jié)構(gòu)21wNAD及NADP在脫氫酶催化過程中參予傳遞氫的作用，其氧化還原作用體現(xiàn)在煙酰胺環(huán)的第4位碳原子上的加氫或脫氫。在中性環(huán)境中其氧化還原的反應(yīng)式如圖35。N+CONH2RH4NCONH2RH4H+ H+2H-2H氧化型還原型或：NAD(P)+2H-2HNAD(P)H+ H+圖 3-5 NAD及NADP傳遞氫過程22（4）硫辛酸硫辛酸(

10、6，8 二硫辛酸二硫辛酸) w硫辛酸在生物體廣泛存在，呈黃色。它與酶蛋白呈牢固的結(jié)合狀態(tài)，水解后為自由態(tài)。存在氧化型和還原型兩種狀態(tài)，其結(jié)構(gòu)式如下：CH2 HSCH2HCHS(CH2)4COOHCH2SCH2HCS(CH2)4COOH氧化型還原型+2H-2H當兩者互相轉(zhuǎn)變時，起傳遞氫的作用。另外，在酮酸氧化脫羧反應(yīng)中，還起傳遞?；淖饔谩?3（5）泛醌泛醌 (輔酶輔酶Q，簡寫為，簡寫為UQ) w泛醌是生物體中廣泛存在的一種醌類衍生物。它是呼吸鏈上的一個組成成分，其功能是傳遞氫和電子，在氧化磷酸化作用中起重要作用。其結(jié)構(gòu)式為：OOH3COH3COCH3(CH2CHCCH3CH2)nH24（6）輔

11、酶）輔酶A (CoA) w輔酶A在脂肪代謝中極為重要，其分子結(jié)構(gòu)中含有維生素B族的泛酸部分，此外，尚含有腺嘌呤核苷酸和氨基乙硫醇部分。OONNNNNH2H2COHPOOHOPOOHOOPHOOOHCH2CCH3CH3COHHCONHCH2CH2CONHCH2SH輔酶A圖 3-6 輔酶A的結(jié)構(gòu)式25輔酶A也可寫為CoASH。CoASH通過其巰基 (SH) 的受?；c脫酰基，參與轉(zhuǎn)?；饔茫浞磻?yīng)式為：CH3C-AOHAH-酶CH3C酶OCH3C酶OCH3C酶OCH3CSCoAOCoASHB上式A為?；墓w；B為?；氖荏w。乙酰輔酶A(CH3COSCoA)的硫酯鍵為一種高能鍵，當脫?；鶗r可放出大

12、量的自由能，供給合成反應(yīng)的需要，在?；瘯r則需要能量，因此，在?；c脫酰過程中有能量的轉(zhuǎn)移。脂肪酸的分解與合成也必須在酯酰輔酶A的參與下才能進行，所以，輔酶A在脂肪代謝上非常重要。26w磷磷酸腺苷及其它核苷酸類酸腺苷及其它核苷酸類 在代謝過程中起著重要作用，它們是許多轉(zhuǎn)磷酸基酶 (如磷酸激酶) 的輔酶。w焦磷酸硫胺素焦磷酸硫胺素(TPP) 酮酸脫羧酶和糖類的轉(zhuǎn)酮酶(催化自酮糖上轉(zhuǎn)2單位至醛糖上去的酶)的輔酶。w磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺 氨基酸的轉(zhuǎn)氨酶、消旋酶和脫羧酶的輔酶，磷酸吡哆胺與轉(zhuǎn)氨作用有關(guān)。w生物素生物素(維生素維生素H) 羧化酶的輔基，屬于維生素族，它與酶蛋白結(jié)合后

13、可催化CO2的摻入與轉(zhuǎn)移。w四氫葉酸四氫葉酸(輔酶輔酶F，THFA) 甲?；喖谆纫惶蓟妮d體，能參與一碳化合物的代謝。w金屬金屬 除卟啉環(huán)含鐵或銅離子外，還有許多酶尚含有銅、鎂、鋅、鈷等金屬離子作為輔基，為酶的催化作用中不可缺少的組分。27基本概念基本概念 2w酶分子修飾：n通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程。如金屬離子交換法、 大分子修飾法n例如，Bender和Kosland成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。重要6.2 酶的結(jié)構(gòu)與功

14、能酶的結(jié)構(gòu)與功能28酶分子的修飾方法酶分子的修飾方法w化學法化學法又可分為：金屬離子置換法、大分子修飾法、肽鏈有限水解法、蛋白側(cè)鏈基團的小分子修飾法等。w生物法生物法是通過基因工程的手段改變蛋白質(zhì)，即基于核酸水平對蛋白質(zhì)進行改造，利用基因操作技術(shù)對DNA或mRNA進行改造和修飾以期獲得化學結(jié)構(gòu)更為合理的蛋白質(zhì)。w物理修飾法物理修飾法的特點是不改變酶的組成和基團，酶分子的共價鍵不發(fā)生變化。重要29酶原：酶原：n酶是在活細胞中合成的，但不是所有新合成的酶都具有催化活力，這種新合成酶的前體 (無催化活力) 稱為酶原 (Proenzyme) 。n就生命現(xiàn)象而言，酶原是酶結(jié)構(gòu)一種潛在的存在形式，如果沒有

15、這種形式，生命就會停止。重要30酶酶 原原分子構(gòu)象發(fā)生改變分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心形成或暴露出酶的活性中心 一個或幾個特定的肽鍵斷裂，水解一個或幾個特定的肽鍵斷裂，水解掉一個或幾個短肽掉一個或幾個短肽在特定條件下在特定條件下 酶原激活的機理酶原激活的機理31w例如，哺乳動物的胰臟分泌到消化系繞中的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原，每種酶原都是由二硫鍵交聯(lián)的單一多肽鏈組成，它們在到達十二指腸以前，一直是十分穩(wěn)定的，而到達十二指腸后則被另一種蛋白質(zhì)水解酶所活化，這種活化過程是從無活力酶原轉(zhuǎn)變成有活力酶的過程。該種酶原往往由該種酶所激活，稱為酶原的自我激活。3233w酶的多形性與同工酶n1

16、975年H. Harris提出酶的多形性概念，認為很多酶可催化相同的反應(yīng)，但其結(jié)構(gòu)和物理化學性質(zhì)有所不同，這種現(xiàn)象稱為酶的多形性。根據(jù) 其 來 源 可 分 為 異 源 同 工 酶 和 同 工 酶 (Isoenzyme) ，前者是不同來源的同工酶.重要34n例如，酵母菌中醇脫氫酶和動物肝臟中的醇脫氫酶，而后者是指來自同一生物體同一生活細胞的酶，能催化同一反應(yīng)，但由于結(jié)構(gòu)基因不同，因而酶的一級結(jié)構(gòu)、物理化學性質(zhì)以及其它性質(zhì)有所差別，稱為同工酶。測定同工酶最常用的方法是電泳法，此法對樣品純度要求不嚴格，分辨力強，而且簡便快速。35n例如天冬氨酸激酶 (AK) 有三種同工酶：AK1、AK2、AK3，磷酸葡萄