動(dòng)感地帶作品MM論文

1、第七屆云南省大中專學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽參賽作品灰霉菌胞外大分子毒素分離及其是否為糖蛋白的定性鑒定摘要：灰霉菌（Botrytis cinerea）能侵染1000多種植物，危害多種糧食和經(jīng)濟(jì)作物，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失?；颐咕a(chǎn)生的毒素可導(dǎo)致植物萎蔫、褪綠和組織壞死等病癥，而目前報(bào)道的灰霉菌毒素大多數(shù)為小分子物質(zhì)，對(duì)灰霉菌分泌的大分子毒素了解不多。因此，分離純化灰霉菌分泌的大分子毒素，鑒定其性質(zhì)對(duì)于認(rèn)識(shí)灰霉菌致病的分子機(jī)制具有重要意義。本研究利用過濾、離心、透析和冷凍干燥等方法對(duì)灰霉菌培養(yǎng)液中的大分子物質(zhì)進(jìn)行了提取分離，并對(duì)其進(jìn)行了植物毒性鑒定。用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對(duì)分離出來的大分子毒素進(jìn)行了

2、純化，回收蛋白條帶，滲入植物葉片進(jìn)行毒素鑒定，將有毒性的條帶進(jìn)行二次聚丙烯酰胺凝膠電泳并用高碘酸-希夫試劑進(jìn)行染色鑒定是否為糖蛋白的蛋白性質(zhì)。結(jié)果表明，灰霉菌胞外的大分子毒素為糖蛋白。關(guān)鍵詞：灰霉菌；擬南芥；胞外毒素；糖蛋白Purification of High-Molecular Toxins from Culture of Botrytis cinerea and Their Glycoprotein Property IdentificationAbstract:Botrytis cinerea can infect more than 1000 species of plants.

3、And it harms a variety of food and economic crops, which could cause great economic loss. The toxic compounds produced by Botrytis cinerea can cause wilting, chlorosis and tissue necrosis etc, disease symptom in plants. Previous literature showed that a number of toxic metabolites have been isolated

4、 from Botrytis cinerea, but these toxins mostly are low molecule organic substances. The high-molecules toxins from Botrytis cinerea are poorly understood. The molecular mechanisms of pathogenicity by this fungal. In this study, the macromolecule compounds from culture of Botrytis cinerea were extra

5、cted and separated by using methods of filtration, centrifugal, freeze, dialysis and drying. The plant toxicity of these extracts was identified. Next, these toxinic compounds were purified using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). The glycoprotein banding were recollected, and were infiltrat

6、ed into plant leaves to check their toxicity. Next,protein toxins are polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) again and these protein toxins are glycoprotein or not were checked with periodic acid-Schif(PAS) regent. The results showed that the macromolecular toxins produced by Botrytis cinerea are

7、 kinds of glycoprotein.Key words :Botrytis cinerea,;Arabidopsis thaliana; extracellular toxin; glycoprotein灰霉菌又名灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是灰霉病的病原物，屬于半知菌亞門，絲孢目，淡色孢科，葡萄孢屬是一種腐生型病原菌。近年來隨著保護(hù)地蔬菜種植面積的擴(kuò)大，其發(fā)生危害有嚴(yán)重的趨勢，產(chǎn)量損失很大，特別是在生產(chǎn)田中或產(chǎn)后貯藏過程中蔓延速度快，灰霉病成為生產(chǎn)上一種世界性的主要病害1Williamson B. Tudzynski B. Tudzynski P. et al.

8、2007, Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease. Molecular Plant Pathology 8:561580.?；颐咕鷮儆趬乃罓I養(yǎng)型病原菌，其侵染植物的方式存在兩種可能，或是先分解寄主的表面細(xì)胞壁，以便更為有利地進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)寄生；或是一開始就分泌毒素，將周圍的細(xì)胞殺死，然后以此作為生存的養(yǎng)分2Elad Y., Kohl J., Fokkema N.J. Control of infection and sporulation of Botrytis cinerea on bean and tomato by sapro

9、phytic yeasts. Phytopathology,1994,84(10):1193-1200。在植物病程中，植物病原菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物統(tǒng)稱為植物毒素，其中起決定作用的有毒物質(zhì)主要包括非蛋白質(zhì)氨基酸、生物堿、蛋白質(zhì)毒素、不含氮毒素和生氰糖苷類毒素等五類3楊紅玉,李湘,張一凡,李然.灰霉菌培養(yǎng)及其對(duì)擬南芥的侵染J.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2005,18(4): 431-434.。迄今已經(jīng)分離出大約17種灰霉菌毒素，均為低分子量的有機(jī)化合物。我們的研究主要集中于灰霉菌分泌的大分子毒素，對(duì)其進(jìn)行了分離和純化，并對(duì)其是否為糖蛋白的蛋白性質(zhì)進(jìn)行了鑒定，這項(xiàng)研究對(duì)于了解灰霉菌產(chǎn)生哪些植物毒素以及他們是如何

10、危害植物的具有一定意義。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 灰霉菌（Botrytis cinerea）：由中國著名大學(xué)植物生理實(shí)驗(yàn)室提供；1.1.2 擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia生態(tài)型種子：由美國Lehle seeds公司提供；1.2 儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)振蕩箱：TS-100B Shaker incubator（上海天星實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）、循環(huán)水式多用真空泵：SHB-（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）離心機(jī)：LD4-2A（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）、Eppendorf centrifuge 5415D高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf centrifuge 5804 R

11、超凈工作臺(tái)：Air Tech（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造）磁力加熱攪拌器：90-2型恒溫磁力攪拌器電子天平：METTLER TOLEDO AL204（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）電熱恒溫水浴鍋：HH·S11-2、HH·S21-4（北京長安科學(xué)儀器廠）透析袋：壓平寬度（半周長）34mm，截留分子量14000，pH穩(wěn)定范圍5-9，5米/卷（USA）電泳設(shè)備：蛋白電泳槽Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System，電泳儀Power/pAC 300（Bio-Rad微型凝膠電泳系統(tǒng)）冰箱（Haier）、超低溫冰箱368升立式（Czech Repub

12、lic JOUAN SA）濾膜濾器（milipore）：上海申越公司提供1.3 方法1.3.1 擬南芥培養(yǎng) 取適量的擬南芥種子于1.5ml的離心管中，加入1ml無菌水浸泡30分鐘，然后分別用1ml95%酒精和0.1%HgCl消毒5分鐘，無菌水洗滌5次。然后將消毒好的種子均勻散到滅過菌的MS培養(yǎng)基上，封口膜封口，標(biāo)上日期，放到4度冰箱春化2天。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中（12h光照，22°C）培養(yǎng)直到長出2片真葉時(shí)將幼苗移栽到裝有滅菌腐殖土的小花盆中，花盆放在托盤中，托盤內(nèi)盛有水，用保鮮膜覆蓋小花盆4天后揭開保鮮膜。溫度保持在22左右，光照時(shí)間為12h/d。1.3.2 灰霉菌的培養(yǎng)將灰霉

13、菌菌種接到馬鈴薯培養(yǎng)基中22，黑暗，倒置培養(yǎng)10天，將馬鈴薯培養(yǎng)基上生長的灰霉菌接種于裝有馬鈴薯培養(yǎng)液的三角瓶中，用棉塞封口置于180轉(zhuǎn)/分振蕩恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，溫度保持在25-28。1.3.3 灰霉大分子毒素的提取將三角瓶中的培養(yǎng)液于4，5000r/min離心15分鐘，收集上清液，用布氏漏斗、真空水循環(huán)泵和定性濾紙（快、中、慢各一次）抽濾上清液，濾出液-80冷凍干燥，然后用無菌水溶解，溶解液在4滅菌水中透析2天，其中每8h換一次水，截留分子量大于14,000Da的大分子物質(zhì),透析袋里的即為大分子毒素。1.3.4 大分子毒素的濃縮由于透析袋中存留大量的水分，我們采用兩種方法去除：方法一：將

14、灰霉大分子毒素經(jīng)濾膜濾器慮過后放到冷凍干燥儀冷凍干燥2天，得到濃縮的蛋白。方法二:用蔗糖包埋透析袋。1.3.5灰霉菌胞外大分子毒素的毒性鑒定我們采用針刺滲入法來進(jìn)行胞外大分子毒素的毒素鑒定。首先選擇生長到4周齡并且長勢大致相同的健康的擬南芥植株兩株，每株5片葉片，用沾有75% 酒精的棉球輕輕擦拭擬南芥葉片，進(jìn)行表面消毒，然后用解剖針在一株擬南芥的兩片大小大致相同的葉片上的相同位置各扎一個(gè)小孔，再用兩個(gè)量程為10微升的微量注射器分別吸取10微升的胞外大分子毒素粗提液和10微升的無菌蒸餾水（作為對(duì)照），分別滲入到剛才扎有孔的葉片中，分別做上標(biāo)記，另一株擬南芥也是進(jìn)行相同的處理，接種后的擬南芥用黑布

15、蓋住，黑暗培養(yǎng)一天后，轉(zhuǎn)到光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度控制在2224，光照時(shí)間12h/d，觀察并記錄照相。獨(dú)立重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。1.3.6 灰霉菌胞外毒素蛋白的糖蛋白定性染色鑒定1.3.6.1 工作液配制（1）溶液A(丙烯酰胺儲(chǔ)存液)：稱30g丙烯酰胺和0.8g雙丙烯酰胺用超純水配成100ml,在通風(fēng)櫥內(nèi)操作；（2）溶液B（4×分離緩沖液）即5mol/LTris-HCl（PH=8.8）：18.2gTris溶于40ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)PH至8.8后加蒸餾水至100ml；(3)溶液C（4×堆積緩沖液）即5mol/LTris-HCl（PH=6.8）：6.0gTris溶于40ml蒸餾水中，用

16、鹽酸調(diào)PH至8.8后加蒸餾水至100ml；（4）10%過硫酸銨；（5）電泳緩沖液（PH=8.8）：3gTris和14.4g甘氨酸加蒸餾水至1L；（6）5×樣品緩沖液：5ml甘油，0.5ml 1%溴酚藍(lán)，3.1ml 1mol/L Tris-HCl(PH=6.8)加蒸餾水至10ml。1.3.6.2 制膠步驟4汪家政,范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊M.科學(xué)出版社,2000,8:111-122.清洗制膠板，烘干；組裝凝膠模具。分離膠：將A液3.3ml、B液2.5ml、蒸餾水4.2ml在50ml三角瓶中混合，加入10%過硫酸銨50µl、TEMED 5µl，輕輕攪拌；用1000

17、1;l槍將液體沿隔片緩慢加入模具內(nèi)，無氣泡，距梳子齒約0.5cm；輕輕加入15mm水層，使凝膠表面平整；等待3060min（與小燒杯中的作對(duì)照），凝膠聚合，出現(xiàn)清晰界面，微微傾斜，檢測凝膠是否聚合，吸盡覆蓋在分離膠上的水。濃縮膠：將A液0.67ml、C液1.0ml、蒸餾水2.3ml在50ml三角瓶中混合。加入10%過硫酸銨30µl、TEMED 5µl，輕輕攪拌使其混合；用1000µl槍將濃縮膠加至分離膠上面，直至達(dá)玻璃板頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，無氣泡；等待30min凝膠聚合；拔出梳子放入電泳槽內(nèi)；將電泳緩沖液加入內(nèi)、外電泳槽中，使凝膠的上、下端均浸泡在緩沖液中，接

18、好Bio-Rad微型凝膠系統(tǒng)電極。檢查：加樣孔無氣泡，凝膠底部無氣泡，保持電流暢通；加樣前用電泳緩沖液沖一下加樣孔，去污物。1.3.6.3 上樣取組分樣品20µl于Eppendorf管中，加入5µl 5×樣品緩沖液；水浴100加熱210min；離心1s，有大量碎片則延長離心時(shí)間；用微量注射器將樣品加入樣品孔中，無氣泡（蒸餾水、緩沖液沖洗注射器）；在最外側(cè)加樣孔中加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品；保持相同上樣量10µl。1.3.6.4 電泳將電極插頭與對(duì)應(yīng)的電極相接，電流應(yīng)流向陽極。電壓調(diào)至200V（保持恒壓）兩塊0.75mm膠，電流開始時(shí)100mA，結(jié)束時(shí)60mA

19、；（約5h）；關(guān)閉電源，從電極上拔掉電極插頭；從電泳槽中取出凝膠玻璃板；小心移動(dòng)兩玻璃板之間的隔片，將隔片插入玻璃板一角。輕輕撬開，使凝膠在一板上。1.3.6.5 染色將其中一塊凝膠固定液（50%乙醇）中固定30min,蒸餾水漂洗5次，再放入0.1%偏重亞硫酸鈉+10mmol/L鹽酸溶液中漂洗2次，每次10min,放入希夫試劑中避光染色1h,再放入0.1%偏重亞硫酸鈉+10mmol/L鹽酸溶液中避光漂洗1h,最后用0.5%偏重亞硫酸鈉溶液漂洗3次，每次20min5張世雄,程立均.一種改進(jìn)的糖蛋白染色鑒別方法的建立J.中國生物制品學(xué)雜志,2012,25(1):108-110. 另一塊凝膠置考馬斯

20、亮藍(lán)染液中浸搖24h，棄去染液后，將凝膠在超純水中漂洗數(shù)次；加入考馬斯亮藍(lán)脫色液（約50ml），震蕩脫色3d，期間更換數(shù)次脫色液，直到背景顏色脫凈為止。倒掉脫色液用超純水清洗，繼續(xù)搖蕩至條帶清楚為止。1.3.7 電泳凝膠上蛋白質(zhì)的回收使用PAGE膠蛋白微量回收試劑盒，將凝膠上清晰的蛋白質(zhì)條帶回收。產(chǎn)品組成：溶液A、溶液B、干粉、DTT（DL-Dithiothreitol，二硫蘇糖醇）。試劑配制：使用前將干粉和DTT完全溶解于溶液A中，使用完后4保存，每次使用時(shí)30加熱，混合好的溶液A用于實(shí)驗(yàn)操作。操作方法：用手術(shù)刀片將膠塊中含有目的條帶部分切下，放入1.5ml的離心管中，用研磨杵將離心管中的膠

21、體研磨成細(xì)小的碎片，加入400µl的溶液A，在室溫條件下，脫色搖床上震蕩過夜（1618小時(shí)），期間取出，偶爾震蕩幾次。室溫12000rpm，離心15分鐘，轉(zhuǎn)移上清液到另外一個(gè)2ml的離心管中，加入2ml的4預(yù)冷的溶液B，混勻，4放置30分鐘。室溫12000rpm，離心15分鐘，去除上清，再將離心管放置在通風(fēng)櫥中，待殘留的液體揮發(fā)干凈。選用緩沖液溶解沉淀的蛋白質(zhì)，得到蛋白回收液。1.3.8 回收蛋白質(zhì)的致病性檢驗(yàn)蛋白質(zhì)致病性檢測方法：先用 75% 酒精對(duì)擬南芥葉片表面消毒，后采用針刺滲入接種法，即用微量注射器沿針刺創(chuàng)面將蛋白質(zhì)滲入擬南芥葉片，每片葉子滲入10µl，以等量無蛋白

22、質(zhì)條帶的凝膠回收液滲入擬南芥葉片實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照，觀察擬南芥致病性。2 結(jié)果與分析2.1 灰霉菌胞外大分子物質(zhì)粗提液的毒性鑒定我們采用針刺滲入法將灰霉菌胞外毒素粗提液滲入到擬南芥葉片內(nèi)，在48小時(shí)后觀察植物葉片的病癥，結(jié)果如圖2.1。圖2.1 A為滲入無菌水的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，48h后擬南芥葉片無明顯變化；而圖B為滲入胞外大分子粗提液48h，可見沿滲入部位出現(xiàn)黃白色“枯斑”和輕微的卷曲。 圖2.1灰霉菌胞外大分子毒素粗提液對(duì)擬南芥葉片的影響A：為滲入無菌水；B：為滲入粗提液2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白條帶的糖蛋白定性鑒定預(yù)實(shí)驗(yàn)希夫（Schiff）試劑能與醛基反應(yīng)生成紅色不溶性復(fù)合物，若PAGE膠染色后蛋

23、白質(zhì)的條帶若出現(xiàn)紫紅色或者粉紅色，則可以說明該蛋白質(zhì)為糖蛋白；若不顯色，則說明不是糖蛋白。為了摸索用希夫試劑染色的濃度、時(shí)間以及蔗糖包埋對(duì)糖蛋白定性鑒定的影響，我們選擇了典型的糖蛋白辣根過氧化物酶，非糖蛋白但經(jīng)過蔗糖包埋濃縮的牛血清蛋白質(zhì)、未經(jīng)蔗糖包埋的牛血清蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素C、溶菌酶等，用凝膠濃度為10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳，然后用Schiff試劑染色進(jìn)行染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，只有辣根過氧化物酶被染上了紫紅色，而其他的非糖蛋白細(xì)（胞色素C、溶菌酶和有或沒有經(jīng)過蔗糖包埋的牛血清蛋白等）都沒有染上紫紅色（圖2.2所示）,說明Schiff試劑能夠很好地指示糖蛋白，因此可以用來檢測胞外毒素蛋白是

24、否是糖蛋白。54321圖2.2 Schiff試劑對(duì)經(jīng)聚丙烯酰胺電泳的不同蛋白質(zhì)的染色泳道1：蔗糖包埋過的牛血清蛋白質(zhì)；泳道2：未經(jīng)蔗糖包埋的牛血清蛋白質(zhì)；泳道3：細(xì)胞色素C；泳道4：辣根過氧化物酶；泳道5：溶菌酶。2.3 灰霉菌胞外毒素蛋白是否為糖蛋白的染色鑒定 我們采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，將經(jīng)過分離的灰霉菌胞外毒素大分子進(jìn)一步分離純化。電泳開始上樣前，在同一塊凝膠上將毒素樣品的點(diǎn)樣重復(fù)一次，電泳結(jié)束后，將凝膠切開，得到兩個(gè)重復(fù)膠塊，然后分別用考馬斯亮藍(lán)染液和Schiff試劑進(jìn)行染色。結(jié)果如圖2.3所示，辣根過氧化物酶和經(jīng)電泳分離的灰霉菌胞外大分子中有4條蛋白帶被染成紅色，而標(biāo)準(zhǔn)蛋白沒有被染

25、成紅色，說明這4條蛋白為糖蛋白。AB圖2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖圖A： 希夫試劑染色；圖B：考馬斯亮藍(lán)染色泳道1、2：大分子毒素分離樣品經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，泳道3：辣根過氧化物酶，泳道4：標(biāo)準(zhǔn)蛋白，泳道5、6：大分子毒素分離樣品經(jīng)希夫試劑染色，泳道7：辣根過氧化物酶經(jīng)希夫試劑染色。分子量的測定：電泳、染色結(jié)束后，測量蛋白質(zhì)及示蹤染料的遷移距離，并計(jì)算遷移率Rf值。Rf = 蛋白質(zhì)的遷移距離/示蹤染料的遷移距離（注：蛋白質(zhì)的遷移距離是指從分離膠的起始位到蛋白質(zhì)條帶的前緣；示蹤染料的遷移距離是從點(diǎn)樣孔到蛋白質(zhì)條帶的前緣。）根據(jù)表2.3數(shù)據(jù)，以蛋白質(zhì)分子量為縱坐標(biāo)，Rf為橫坐標(biāo)繪圖，得到一條直線；通

26、過測定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出它的分子量，見圖2.4。表2.3 蛋白質(zhì)的遷移距離分子量（KDa） 20011697.266.444.3遷移率0.30.480.550.650.74 圖2.4 分子量及其遷移距離標(biāo)準(zhǔn)曲線灰霉毒素蛋白被希夫試劑染成紅色的四條條帶的遷移率分別是0.54、0.57、0.62、0.64，根據(jù)y=-352.27x+296.42公式求得四條條帶的蛋白分子量大約為106.2KD、95.6KD、78KD、71KD。2.4 毒素糖蛋白的回收使用PAGE膠蛋白微量回收試劑盒，將前述的凝膠上前三條糖蛋白條帶進(jìn)行回收。試劑盒組成：溶液A、溶液B、干粉、DTT（DL-Dithiothreitol，二硫蘇糖醇）。用手術(shù)刀片將膠塊中前三條條帶依次切下，分別放入1.5ml的離心管中，用研磨杵將離心管中的膠體研磨成細(xì)小的碎片，加入400µl的溶液A，在室溫條件下，脫色搖床上震蕩過夜（1618小時(shí)），期間取出，偶爾震蕩幾次。室溫12000rpm，離心15分鐘，轉(zhuǎn)移上清液到另外一個(gè)2ml的離心管中，加入2ml的4預(yù)冷的溶液B，混勻，4放置30分鐘。室溫12000rpm，離心15分鐘，去除上清，再將離心管放置在通風(fēng)櫥中，待殘留的液體揮發(fā)干凈。選用緩沖液溶解沉淀的蛋白質(zhì)，得到蛋白回收液。將回收液經(jīng)PAG