基因工程的基本操作程序PPT課件

1、 目的基因第1頁/共46頁C下列不是基因載體必須具備的條件的是下列不是基因載體必須具備的條件的是 ( )( ) A A、能自我復(fù)制、能自我復(fù)制 B B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)、有多個(gè)限制酶切點(diǎn) C C、具有標(biāo)記基因、具有標(biāo)記基因 D D、它是環(huán)狀、它是環(huán)狀DNADNAD第2頁/共46頁第3頁/共46頁真核生物的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)前體信使RNA成熟的信使RNA第4頁/共46頁第二節(jié)基因工程的基本操作程序第5頁/共46頁（一）獲得目的基因（二）構(gòu)建基因表達(dá)載體形成重組DNA分子（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作程序第6頁/共46頁用

2、用DNADNA合成儀人工合成合成儀人工合成利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增已知序列：已知序列：從基因文庫獲得從基因文庫獲得未知序列：未知序列：（一）目的基因的獲?。耗康幕蚣次覀兯枰?基因?；蚪M文庫：含某種生基因組文庫：含某種生物的全部基因物的全部基因部分基因文庫：含某種部分基因文庫：含某種生物的部分基因生物的部分基因（如（如cDNAcDNA文庫）文庫）第7頁/共46頁cDNA文庫基因組文庫從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因第8頁/共46頁鳥槍法：散彈射擊法供體細(xì)胞DNA限限制制酶酶許多DNA片段載入載體導(dǎo)入受體細(xì)菌擴(kuò)增產(chǎn)生特定性狀分離目的基因構(gòu)建基因組文庫并獲得目的基

3、因：第9頁/共46頁 基因組DNADNA文庫的構(gòu)建 將總DNADNA經(jīng)過酶解，分離不同長(zhǎng)短的DNADNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，轉(zhuǎn)染細(xì)菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構(gòu)成了該生物的基因組文庫。第10頁/共46頁目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄單鏈DNA合成雙鏈DNA（目的基因）逆轉(zhuǎn)錄法構(gòu)建cDNA文庫并獲得目的基因載入載體導(dǎo)入受體細(xì)菌擴(kuò)增產(chǎn)生特定性狀分離目的基因第11頁/共46頁第12頁/共46頁第13頁/共46頁蛋白質(zhì)氨基酸序列推測(cè)mRNA的核苷酸序列推測(cè)結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列（單鏈）根據(jù)已知氨基酸序列直接合成DNA化學(xué)合成人工合成核苷酸序列已知，把將要合成的DNA序列輸入到D

4、NA合成儀，用化學(xué)方法直接人工合成第14頁/共46頁聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCRPCR是由美國科學(xué)家是由美國科學(xué)家第15頁/共46頁 PCR的反應(yīng)體系的反應(yīng)體系 模板：模板：DNA 原料：原料：四種四種 脫氧核苷酸；脫氧核苷酸； 酶：酶：Taq酶（酶（ TaqDNA聚合酶）聚合酶）嗜熱細(xì)菌中分離得到嗜熱細(xì)菌中分離得到 引物：引物：DNA片段片段 MgMg2+2+（維持酶活性所必需）（維持酶活性所必需） PCRPCR緩沖液：緩沖液：維持PH恒定，保護(hù)Taq酶 第16頁/共46頁1變性 雙鏈模板DNA解離為單鏈結(jié)構(gòu)。（9095）DNA雙鏈DNA單鏈變性第17頁/共46頁2退火 引物與模板互補(bǔ)

5、成雙鏈。 （5560） (由于引物濃度高，序列短，所以易與模板結(jié)合。)引物第18頁/共46頁3延伸 在Taq酶作用下，合成特異DNA序列。7075延伸第19頁/共46頁變性變性第二次循環(huán)第20頁/共46頁退火退火第二次循環(huán)第21頁/共46頁延伸延伸第二次循環(huán)第22頁/共46頁 PCRPCR反應(yīng)曲線反應(yīng)曲線 理論上，理論上，PCRPCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)增長(zhǎng)，但這種增長(zhǎng)形式在擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)增長(zhǎng)，但這種增長(zhǎng)形式在擴(kuò)增25-3025-30個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)。此時(shí)擴(kuò)增個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)。此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長(zhǎng)。產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而

6、呈指數(shù)增長(zhǎng)。第23頁/共46頁P(yáng)CR儀程序設(shè)定第24頁/共46頁P(yáng)CR的應(yīng)用 PCRPCR具有省時(shí)、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、效率高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。具有省時(shí)、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、效率高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。PCRPCR技術(shù)在技術(shù)在分子生物學(xué)、醫(yī)分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和案件偵破學(xué)和案件偵破等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。第25頁/共46頁實(shí)例 1： 1、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈?zhǔn)牵?） A.從基因文庫中獲取目的基因 B.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 C.反轉(zhuǎn)錄法 D.通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成第26頁/共46頁（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建形成重組DNA分子切割目的

7、基因和質(zhì)粒的限制酶是同一種限制酶嗎？同一種第27頁/共46頁目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代，使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用。第28頁/共46頁目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為定和表達(dá)的過程，稱為轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化。常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、 土壤農(nóng)桿菌、酵母菌、動(dòng)植物細(xì)胞等土壤農(nóng)桿菌、酵母菌、動(dòng)植物細(xì)胞等 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第29頁/共46頁主要借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。主要借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方式：（三）將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)

8、胞第30頁/共46頁導(dǎo)入微生物細(xì)胞將目的基因克隆到大腸將目的基因克隆到大腸桿菌細(xì)胞中的操作步驟：桿菌細(xì)胞中的操作步驟：1)1)獲得目的基因和質(zhì)粒載體；獲得目的基因和質(zhì)粒載體；2)2)形成重組質(zhì)粒；形成重組質(zhì)粒；3)3)制備制備感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞，用重組質(zhì)，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；4)4)培養(yǎng)大腸桿菌，讓重組質(zhì)粒培養(yǎng)大腸桿菌，讓重組質(zhì)粒形成大量拷貝；形成大量拷貝；5)5)篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞。細(xì)胞。第31頁/共46頁導(dǎo)入植物細(xì)胞：導(dǎo)入植物細(xì)胞：土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法土壤農(nóng)桿菌：具有趨化性（酚），感染雙子葉植物和裸子植物土壤農(nóng)桿菌：具有趨化性（酚

9、），感染雙子葉植物和裸子植物第32頁/共46頁基 因 槍 法：?jiǎn)巫尤~植物常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但成本較高?；ǚ酃芡ǖ婪ǎ菏趾?jiǎn)便經(jīng)濟(jì)的方法。我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用此方法獲得。第33頁/共46頁 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法程序：程序： 重組DNA提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵發(fā)育 新性狀動(dòng)物第34頁/共46頁轉(zhuǎn)基因動(dòng)物第35頁/共46頁1.1.篩選含有目的基因的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的受體細(xì)胞通過檢測(cè)標(biāo)記基因的有無，來判斷目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。通過檢測(cè)標(biāo)記基因的有無，來判斷目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。（1）抗藥性篩選法：菌株為某種

10、抗生素缺陷型， 而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如抗氨芐青霉素，抗卡拉霉素等）。如何篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞？（這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出。）（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定第36頁/共46頁pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如果外源如果外源DNA插入，插入，氨卞青霉素氨卞青霉素抗性基因失抗性基因失活活標(biāo)記基因標(biāo)記基因進(jìn)行篩選進(jìn)行篩選限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列識(shí)別序列外源基因連接外源基因連接PStPSt自主復(fù)制自主復(fù)制第37頁/共46頁（2 2） DNA分子雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNADNA上是否插入了目的基因首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA用含目的基因的DNA片

11、段（單鏈）用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中過程:第38頁/共46頁利用DNA分子雜交篩選含有目的基因的細(xì)菌克隆檢測(cè)方法：DNA分子雜交技術(shù)第39頁/共46頁DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNADNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 第40頁/共46頁2.檢測(cè)目的基因的表達(dá)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志體現(xiàn)特定性狀檢測(cè)性狀第41頁/共46頁 （3 3）鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）：（1 1）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA（2 2）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法: :分 子 雜 交方法: :抗原抗體雜交過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA第42頁/共46頁第43頁/共46頁回答問題：1、基因工程的別名：2、操作環(huán)境：3、