細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課程教案(1)

1、細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課程教案（1）實驗題目 血涂片的制備及細(xì)胞大小的測量實驗學(xué)時3 實驗?zāi)康?. 掌握血涂片的制備方法2. 認(rèn)識紅細(xì)胞及各種白細(xì)胞的典型形態(tài)3掌握顯微測微尺的使用方法實驗原理 將血液樣品制成單層細(xì)胞的涂片標(biāo)本，經(jīng)瑞氏染液染色后，不同白細(xì)胞中的顆?？梢猿尸F(xiàn)不同的顏色。堿性粒細(xì)胞的顆粒呈藍(lán)紫色，酸性粒細(xì)胞的顆粒呈橘紅色，中性粒細(xì)胞的顆粒呈粉紅色。根據(jù)細(xì)胞中顆粒的顏色、大小及多少，再結(jié)合細(xì)胞的大小及細(xì)胞核的形態(tài)，就可以將白細(xì)胞進(jìn)行分類計數(shù)。實驗儀器顯微鏡、粗天平、載玻片、滴管、離心管、離心機(jī)、醫(yī)用一次性采血針、酒精棉球、鑷子、載玻片、目鏡測微尺和鏡臺測微尺等實驗材料雞血細(xì)胞實驗內(nèi)

2、容與實施過程備 注1.血涂片的制備與血細(xì)胞的觀察（50分鐘）: 采血前用70酒精棉球消毒人的指腹采血推片：擠出第二滴血置于載玻片的右側(cè)再取另一張邊緣光滑的雙凹片，斜置于血滴的前緣，先向后稍移動輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端展開成線狀兩玻片的角度以3045°為宜，輕輕將雙凹片向前勻速推進(jìn)，即涂成血液薄膜染色：用天平稱取去皮的土豆塊莖2g+10mlPBS緩沖液，浸泡2h粗提液中含有可溶性土豆凝集素。2. 顯微測微尺的使用（35分鐘）：以無菌方法抽取雞血注射器中抽取3.8%檸檬酸鈉1ml抽取雞靜脈血液2ml，用生理鹽水洗5次，每次2000r/min，離心5min，最后按壓積紅細(xì)胞體積用生理鹽

3、水配成2%紅細(xì)胞液。3.細(xì)胞的觀察與討論（50分鐘）：淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、堿性粒細(xì)胞和酸性粒細(xì)胞4、實驗小結(jié)（15分鐘）：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。共150分鐘。實驗作業(yè)1.繪制各種不同類型的血細(xì)胞,并說明它們的主要作用？2.任選20個紅細(xì)胞，測量其直徑，并計算出平均值. 。參考資料（含參考文獻(xiàn)、期刊、雜志等）實驗總結(jié) 對于涂片的厚度一定要掌握，不然太厚不方便觀察細(xì)胞，對于各種白細(xì)胞的染色一定要把握好，適度的染色可容易的區(qū)分開五種白細(xì)胞，并進(jìn)行大小的測量和繪圖。細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課

4、程教案（2）實驗題目 細(xì)胞化學(xué)實驗實驗學(xué)時3 實驗?zāi)康?熟悉細(xì)胞脂類的顯示技術(shù)，了解其在細(xì)胞中的分布；學(xué)習(xí)區(qū)別定位細(xì)胞DNA、RNA的顯示方法實驗原理 （1）蘇木精為堿性染料染細(xì)胞核，蘇丹紅為偶氮脂溶性染料，可顯示細(xì)胞中的脂類的分布及量； （2）甲基綠與DNA雙螺旋外側(cè)的磷酸根基團(tuán)結(jié)合力強(qiáng)，結(jié)合后阻止派洛寧從堿基之間插入。甲基綠與DNA的結(jié)合產(chǎn)物為綠色。派洛寧與RNA的結(jié)合力強(qiáng)，RNA結(jié)構(gòu)較松散，派洛寧可以插入，從而中和磷酸基團(tuán)，阻止甲基綠染色，派洛寧與RNA的結(jié)合物呈紅色，根據(jù)顏色的部位可以判斷DNA和RNA的定位并且判斷兩種核酸的相對含量。實驗儀器水浴鍋、冰凍切片機(jī)、載玻片等；實驗材料豬肝

5、、花生子葉實驗內(nèi)容與實施過程備 注1. 脂類顯示（65分鐘）：用豬肝切片和花生的超薄切片，學(xué)習(xí)掌握使用冰凍切片機(jī)的操作技術(shù)，獲得理想的切片；2. 細(xì)胞中DNA和RNA的顯示（70分鐘）：材料選用豬肝印片，學(xué)習(xí)如何制備肝印片的片子，而后進(jìn)行固定、浸洗、染色等即可顯示二者在細(xì)胞中的分布。3、實驗小結(jié)（15分鐘）：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。共150分鐘。凝集素是一類含糖、并能與糖專一結(jié)合的蛋白質(zhì),被認(rèn)為與糖的運輸、儲存物質(zhì)的積累、細(xì)胞間的互作以及細(xì)胞分裂的調(diào)控有關(guān)。實驗作業(yè)細(xì)胞中脂類和核酸顯示的原理是什

6、么？參考資料（含參考文獻(xiàn)、期刊、雜志等）實驗總結(jié)植物材料兩種化學(xué)成分的顯示結(jié)果都比較好，但是豬肝的效果較差，這可能與切片的厚度有很大的關(guān)系，豬肝組織柔軟不像花生子葉好切。細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課程教案（3）實驗題目 細(xì) 胞 凝 集 反 應(yīng)實驗學(xué)時3 實驗?zāi)康?. 學(xué)習(xí)制備土豆凝集素2. 掌握細(xì)胞凝集反應(yīng)的實驗方法及細(xì)胞凝聚的原理。3. 觀察凝集的現(xiàn)象實驗原理 細(xì)胞質(zhì)膜外表面的一層黏性多糖物質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞全委會被在細(xì)胞間的聯(lián)系和識別、細(xì)胞的生長分化、免疫反應(yīng)及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要作用。 動物細(xì)胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖鏈伸向膜表面，它們是細(xì)胞識別、細(xì)胞免疫及細(xì)胞接觸抑制現(xiàn)象的必要組分。凝集

7、素是一類含糖的(少數(shù)例外)并能與糖專一性結(jié)合的蛋白質(zhì)，它具有凝集細(xì)胞和刺激細(xì)胞分裂的作用。凝集使細(xì)胞凝集是由于它與細(xì)胞表面的糖分子連接，在細(xì)胞間形成“橋”的結(jié)果。凝集素與糖分子結(jié)合有一定的專一性和結(jié)合價，并與細(xì)胞膜上受體的分布有關(guān)。實驗儀器顯微鏡、粗天平、載玻片、滴管、離心管、離心機(jī)等實驗材料土豆塊莖、雞血細(xì)胞實驗內(nèi)容與實施過程備 注1.凝集素粗提液制備（50分鐘）：用天平稱取去皮的土豆塊莖2g+10mlPBS緩沖液，浸泡2h粗提液中含有可溶性土豆凝集素。2.雞紅細(xì)胞懸液制備（35分鐘）：以無菌方法抽取雞血注射器中抽取3.8%檸檬酸鈉1ml抽取雞靜脈血液2ml，用生理鹽水洗5次，每次2000r

8、/min，離心5min，最后按壓積紅細(xì)胞體積用生理鹽水配成2%紅細(xì)胞液。3.細(xì)胞凝集反應(yīng)現(xiàn)象的觀察與討論（50分鐘）：用滴管吸取土豆凝集素和2%紅細(xì)胞液各一滴，置載玻片上，充分混勻，靜置20min后于低倍顯微鏡下觀察血球凝集現(xiàn)象。本實驗過程很簡單，只需要將植物凝集素與紅細(xì)胞混合后用低倍顯微鏡觀察現(xiàn)象即可。具體如下：實驗組凝集素1滴紅細(xì)胞懸液1滴對照組PBS液1滴紅細(xì)胞懸液1滴4、實驗小結(jié)（15分鐘）：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。共150分鐘。凝集素是一類含糖、并能與糖專一結(jié)合的蛋白質(zhì),被認(rèn)為與糖的運

9、輸、儲存物質(zhì)的積累、細(xì)胞間的互作以及細(xì)胞分裂的調(diào)控有關(guān)。實驗作業(yè)1.細(xì)胞間凝集的原理是什么？2.簡圖表示血細(xì)胞凝集原理。參考資料（含參考文獻(xiàn)、期刊、雜志等）實驗總結(jié)1.為什么對照組有PBS液作對照呢？沒什么巧，因為凝集素中本身含PBS緩沖液，當(dāng)含本身凝集素是不含PBS的，只是因為本實驗中凝集素的提取時用到了PBS.2.那么紅細(xì)胞懸液是怎么制備的呢？其實也不難，無菌抽取動物靜脈血液，當(dāng)然血液抽出來后肯定要先加抗凝劑了，然后再加生理鹽水。那么怎么從血液中將紅細(xì)胞分離出來呢？想想，血液中有血清、紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，按道理來講紅細(xì)胞應(yīng)該最重吧(有待查證)，用離心機(jī)在2000r/min下離心5min

10、，去掉上清液，得到的應(yīng)該就是紅細(xì)胞了，再加適量生理鹽水洗滌幾次后，加一定量是(按壓積紅細(xì)胞體積算)生理鹽水即可配成相應(yīng)濃度的紅細(xì)胞懸液了。除了土豆中有凝集素外，還有韭菜葉片也有。凝集素使細(xì)胞凝集是因為它與細(xì)胞表面的糖分子連接,在細(xì)胞間形成“橋”的結(jié)果,加入與凝集素互補的糖可以抑制細(xì)胞發(fā)生凝集。大多數(shù)凝集素存在于儲藏器官中,作為一種氮源；對某些植物而言,受到危害時,凝集素作為一種防御蛋白發(fā)揮作用。細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課程教案（4）實驗題目 細(xì)胞膜的滲透性實驗學(xué)時3 實驗?zāi)康牧私饧?xì)胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度。實驗原理細(xì)胞膜為一種半透膜，對物質(zhì)的通透具有選擇性。當(dāng)紅細(xì)胞放入低滲溶液中時

11、，細(xì)胞吸水膨脹而發(fā)生溶血。當(dāng)紅細(xì)胞放入含不同溶質(zhì)的等滲溶液中時，由于細(xì)胞膜對不同溶質(zhì)的透性不同，細(xì)胞發(fā)生溶血的時間也會不同，故發(fā)生溶血現(xiàn)象時間長短可作為測量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的一種指標(biāo)。實驗儀器離心機(jī)、移液槍、試管、試管架實驗材料雞血實驗內(nèi)容與實施過程備 注1.雞血細(xì)胞懸液的制備：一份雞血+10份0.17mol/L氯化鈉，形成一種不透明的紅色液體，此即稀釋的雞血。2.低滲溶液：一支試管中，加入10ml蒸餾水+1ml稀釋的雞血，觀察溶液顏色的變化？3.雞紅細(xì)胞的滲透性觀察：在10種等滲溶液中觀察細(xì)胞溶血現(xiàn)象及時間。實驗作業(yè)將觀察到的現(xiàn)象列入下表，對實驗結(jié)果進(jìn)行比較和分析。附表：不同低滲溶液下的溶

12、血現(xiàn)象。試管編號是否溶血時間結(jié)果分析1.10ml氯化鈉+1ml稀釋羊血2.10ml氯化銨+1ml稀釋羊血3.10ml醋酸銨+1ml稀釋羊血4.10ml硝酸鈉+1ml稀釋羊血5.10ml草酸銨+1ml稀釋羊血6.10ml硫酸鈉+1ml稀釋羊血7.10ml葡萄糖+1ml稀釋羊血8.10ml甘油+1ml稀釋羊血9.10ml乙醇+1ml稀釋羊血10.10ml丙酮+1ml稀釋羊血參考資料（含參考文獻(xiàn)、期刊、雜志等）實驗總結(jié)溶血時間及現(xiàn)象的觀察比較困難，可采用離心輔助的方法來判別雞血在哪些等滲液中最易溶血，哪些較慢，做一些定性的分析。經(jīng)過離心之后，若上清液無色，證明在這個時間段血細(xì)胞沒發(fā)生溶血，若上清液略

13、紅，證明有溶血發(fā)生。當(dāng)然這個方法不很精確，但卻快速、便于觀察。細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課程教案（5）實驗題目 線粒體和液泡系的超活染色與觀察實驗學(xué)時3 實驗?zāi)康?觀察動、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體和液泡系的形態(tài)、數(shù)量及分布； 掌握細(xì)胞超活染色技術(shù)及原理； 學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。實驗原理活體染色：應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯示活細(xì)胞內(nèi)某些細(xì)胞結(jié)構(gòu)而又很少影響細(xì)胞生命活動的染色方法。詹納斯綠B：詹納斯綠B能專一的對線粒體進(jìn)行活體染色。線粒體中細(xì)胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)，即有色狀態(tài)，呈藍(lán)綠色，而在周圍的細(xì)胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)中性紅：中性紅對高爾基體、液泡系的染色具有專一性。只將

14、活細(xì)胞中的液泡系當(dāng)成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色(這可能與液泡系中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。實驗儀器顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、解剖盤載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。 實驗材料人口腔上皮細(xì)胞、洋蔥、小麥種子或黃豆幼根根尖實驗內(nèi)容與實施過程備 注1.人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色與觀察清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上 滴2滴1/5000詹納斯綠B染液 用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞 刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中 染色10-l5min(注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液) 蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察 2. 植物細(xì)胞液泡系的超活染色與觀察

15、 取小麥種子發(fā)芽的根尖 用刀片縱切根尖 放入中性紅染液滴中，染色510min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢(鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察) 實驗結(jié)果：在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點的細(xì)胞，可見細(xì)胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細(xì)胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細(xì)胞中，一般只有一個淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細(xì)胞的絕大部分，將細(xì)胞核擠到細(xì)胞一側(cè)貼近細(xì)胞壁處。實驗作業(yè)（1）繪口腔上皮細(xì)胞示線粒體的形態(tài)與分布 （2）繪小麥根尖細(xì)胞示液泡的形態(tài)與分布 參考資料（含參考

16、文獻(xiàn)、期刊、雜志等）實驗總結(jié)人口腔上皮細(xì)胞的線粒體的超活染色與觀察效果很好，但是洋蔥表皮細(xì)胞和小麥根尖細(xì)胞的染色效果不是很理想。細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課程教案（6）實驗題目 葉綠體的分離與熒光觀察實驗學(xué)時3 實驗?zāi)康?.通過植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法；2.觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。實驗原理組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間

17、，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。實驗儀器普通離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、粗天平、熒光顯微鏡。燒杯2個, 250ml量筒1個, 滴管20支, 10ml刻度離心管20支, 試管架5個，紗布若干，無熒光載片和蓋片各4片。 實驗試劑 0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。實驗材料新鮮菠菜實驗內(nèi)容與實施過程備 注（一）葉綠體的分離與觀察 1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。 2. 利用組織搗碎機(jī)低速(5000r/mi

18、n)勻槳3-5min。 3. 將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。 4. 取濾液4ml在1000r/min下離心2min，棄去沉淀。 5. 將上清液在3000r/min下離心5min。棄去上清液，沉淀即是葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。 6. 將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮。 7. 取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。在普通光鏡下觀察。在熒光顯微鏡下觀察。取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙熒光染料，在熒光顯微鏡下觀察。（二）實驗結(jié)果：普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。在選用B

19、（blue）激發(fā)濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。加入丫啶橙后，葉綠體可發(fā)出橘紅色熒光，其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒光。實驗作業(yè)1.在倒置顯微鏡相連的電腦軟件支配下，測量一下葉綠體的長軸和短軸，分別測量510個葉綠體，求其平均值。2.在分離葉綠體時應(yīng)注意些什么問題？參考資料（含參考文獻(xiàn)、期刊、雜志等）實驗總結(jié)實驗結(jié)果非常理想，提醒學(xué)生們在使用熒光顯微鏡時應(yīng)注意保護(hù)眼睛，避免紫外線的傷害。細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課程教案（7）實驗題目 細(xì)胞器的分離與觀察實驗學(xué)時3 實驗?zāi)康?.通過植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法；2.觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法

20、。實驗原理細(xì)胞由細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組成，細(xì)胞質(zhì)中含有若干細(xì)胞器和細(xì)胞骨架等，這些也稱作亞細(xì)胞組分。對于細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的研究，是細(xì)胞生物學(xué)的基本課題，其重要的研究手段之一是分離純的亞細(xì)胞組分，觀察它們的結(jié)構(gòu)或進(jìn)行生化分析。分離亞細(xì)胞組分的方法主要有差速離心和密度梯度離心。差速離心（differential centrifugation）在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降

21、顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)23次效果會好一些。差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。對于精細(xì)的分離，則是密度梯度離心效果更好。密度梯度離心（density gradient centrifugation）用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。實驗儀器普通離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、粗天平、熒光顯微鏡。燒杯2個, 250ml量筒1個, 滴管20支, 10ml刻度離心管20支, 試管架5個，紗布若干，無熒光載片和蓋片各4片。 實驗試劑

22、 0.35mol/L氯化鈉溶液實驗材料新鮮菠菜實驗內(nèi)容與實施過程備 注（一）葉綠體的分離與觀察 1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，裝入組織搗碎機(jī)。 2. 利用組織搗碎機(jī)低速(5000r/min)勻槳3-5min。 3. 將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。 4. 取濾液4ml在1000r/min下離心2min，棄去沉淀。 5. 將上清液在3000r/min下離心5min。棄去上清液，沉淀即是葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。 6. 將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮。 7. 取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在

23、顯微鏡下觀察。在普通光鏡下觀察。在熒光顯微鏡下觀察。取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙熒光染料，在熒光顯微鏡下觀察。（二）實驗結(jié)果：普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。在選用B（blue）激發(fā)濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。加入丫啶橙后，葉綠體可發(fā)出橘紅色熒光，其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒光。實驗作業(yè)1.在倒置顯微鏡相連的電腦軟件支配下，測量一下葉綠體的長軸和短軸，分別測量510個葉綠體，求其平均值。2.在分離葉綠體時應(yīng)注意些什么問題？參考資料（含參考文獻(xiàn)、期刊、雜志等）實驗總結(jié)實驗結(jié)果非常理想，提醒學(xué)生們在

24、使用熒光顯微鏡時應(yīng)注意保護(hù)眼睛，避免紫外線的傷害。細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課程教案（7）實驗題目 植物原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)實驗學(xué)時6 實驗?zāi)康脑|(zhì)體是除去細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞。在適宜的條件下，分離的原生質(zhì)體能夠再生細(xì)胞壁，進(jìn)行細(xì)胞分裂，并再生完整植株。通過實驗，掌握原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的基本方法，并對培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行觀察和分析。實驗原理植物原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁后為原生質(zhì)所包圍的“裸露細(xì)胞”，是開展基礎(chǔ)研究的理想材料。其中酶解法分離原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù)，其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分，除去細(xì)胞壁而使原生質(zhì)體釋放出來。原生質(zhì)體

25、分離純化或融合后，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上應(yīng)用合適的培養(yǎng)方法，能夠再生細(xì)胞壁，并啟動細(xì)胞持續(xù)分裂，直至形成細(xì)胞團(tuán)，長成愈傷組織或胚狀體，再分化發(fā)育成苗。其中，選擇合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法是原生質(zhì)體培養(yǎng)中最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。實驗儀器三角瓶、離心管、燒杯、200目不銹鋼濾網(wǎng)、解剖刀、長、短鑷子、培養(yǎng)皿、濾紙、0.2m濾膜、濾器、培養(yǎng)瓶（注：以上用品要進(jìn)行高壓滅菌）、臺式離心機(jī)、高壓滅菌鍋、倒置顯微鏡、超靜工作臺實驗材料煙草幼苗的葉片、新鮮菠菜的葉實驗內(nèi)容與實施過程備 注1、實驗原理的講解；（15分鐘）2、液體培養(yǎng)基的配制；（實驗前由教師完成）3、酶液的制備：（20分鐘）1纖維素酶、1果膠酶、0.6mol

26、/L甘露醇 、0.1%MES、0.05mol/LCaCl2·2H2O、 pH6.87.0 3、植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)：（ 課內(nèi)完成，150分鐘）取充分展開的嫩葉，用自來水沖洗干凈；將葉片在0.1%升汞溶液中浸泡滅菌10min，然后用無菌蒸餾水漂洗5次；用鑷子撕去葉的下表皮，然后將葉放有酶液的培養(yǎng)皿或帶蓋三角瓶，每10ml酶液放2g葉片；在2528黑暗條件下，酶解23h,用200目網(wǎng)過濾除去未完全消化的殘渣。在1000rpm條件下離心5分鐘，棄上清。加入3 4ml 0.2mol/LCaCl2·2H2O洗液，用注射器向離心管底部緩緩注入20蔗糖溶液6ml，在1000rpm條件

27、下離心510分鐘，由于密度梯度離心的作用，生活力強(qiáng)狀態(tài)好的原生質(zhì)體漂浮在20的蔗糖與0.2mol/LCaCl2·2H2O之間，破碎的細(xì)胞殘渣沉入管底。用200l移液器輕輕將狀態(tài)好的原生質(zhì)體吸出(注意盡可能不要吸入下層的蔗糖溶液)，放入另一干凈的離心管中加4ml 0.2mol/LCaCl2·2H2O懸浮，1000rpm離心25分鐘，棄上清將收集的原生質(zhì)體懸浮在適量的DPD培養(yǎng)基中，用血球計數(shù)板調(diào)整原生質(zhì)體密度為5×104/ml（請參考細(xì)胞計數(shù)）之間。用帶皮頭的移液管將原生質(zhì)體懸液分裝在培養(yǎng)皿中，每皿放5ml。用石蠟?zāi)Х饪?。?6左右條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)。4、培養(yǎng)結(jié)果的

28、觀察（活力檢查，細(xì)胞壁再生的觀察，細(xì)胞分裂的觀察）。（在課外由教師指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行）5、實驗小結(jié)：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。（10分鐘）共195分鐘教學(xué)重點、難點重點：無菌操作；原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)。難點：酶解去壁，原生質(zhì)體培養(yǎng)方法的選擇實驗內(nèi)容與實施過程備 注實驗的意義：植物原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)在理論和實踐上都有很大的意義，在植物遺傳工程和育種研究上具有廣闊的應(yīng)用前景。它是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一，它不僅能克服遠(yuǎn)緣雜交有性不親和障礙，也可克眼傳統(tǒng)的通過有性雜交誘導(dǎo)多倍體植株的麻煩，最終將野生種的遠(yuǎn)緣基因?qū)朐耘喾N中，原生質(zhì)體融合技術(shù)可望成為作物改良的

29、有力工具之一。      植物原生質(zhì)體培養(yǎng)方法起源于植物單細(xì)胞的培養(yǎng)方法。1954年，植物單細(xì)胞培養(yǎng)才獲得成功。Mllir 培養(yǎng)的萬壽菊及煙草懸浮細(xì)胞植入到長有愈傷組織的培養(yǎng)基上得到了它們的單細(xì)胞克隆，并建立了看護(hù)培養(yǎng)的方法；1960年Jones等建立了微室培養(yǎng)法。同年，Cocking應(yīng)用酶法分離原生質(zhì)獲得成功，從而在實驗條件下很容易獲得大量的原生質(zhì)體。隨著多種適用于原生質(zhì)體分離的商品酶的出現(xiàn)，原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法也得到了不斷地改進(jìn)，現(xiàn)在常用的原生質(zhì)體培養(yǎng)方法有：液體淺層培養(yǎng)法、雙層培養(yǎng)法、瓊脂糖包埋法、瓊脂島培養(yǎng)法以及使用條件培養(yǎng)基或飼喂培養(yǎng)等。實驗作業(yè)

30、1酶解液及原生質(zhì)體起始培養(yǎng)基中，為何要保持較高滲透壓？2.如何判斷分離原生質(zhì)體的活力和新壁再生？參考資料（含參考文獻(xiàn)、期刊、雜志等）實驗總結(jié)將原生質(zhì)體培養(yǎng)分化過程進(jìn)行顯微攝影，并分析結(jié)果。以植物根、莖、葉、葉柄作為原生質(zhì)體的分離材料,經(jīng)過分離收集在一定條件下才能培養(yǎng)獲得完整的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體培養(yǎng)基的滲透壓應(yīng)與酶液的滲透壓相等.細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課程教案（8）實驗題目 動物血細(xì)胞的電融合技術(shù)實驗學(xué)時3 實驗?zāi)康膭游锏挠坞x細(xì)胞以及植物成微生物去壁后的原生質(zhì)體，在電刺激下進(jìn)行細(xì)胞融合，且融合率高、無毒性，操作簡便及融合后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)成活率高等優(yōu)點，是細(xì)胞工程手段的又一進(jìn)展。本實驗使學(xué)生在了

31、解電融合原理的基礎(chǔ)上，學(xué)會掌握各種細(xì)胞懸液的制備及電融合過程的操作。實驗原理制備的游離細(xì)胞或原生質(zhì)體，置于電融合室中，在高頻交流電場的作用下，細(xì)胞被極化，成為偶極子，造成細(xì)胞之間相互連接，如果施加的高頻交流電壓(即正弦波的p-p值)過高或作用時間過長，則細(xì)胞連接成串珠狀，應(yīng)適當(dāng)控制以上條件，盡量使兩細(xì)胞處于點接觸狀態(tài)，然后施加方波脈沖予以刺激，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細(xì)胞接觸點部位的質(zhì)膜，此時質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組，同時由于細(xì)胞表面的張力作用，使兩細(xì)胞融合逐步完全。 動物的游離細(xì)胞在電刺激下可進(jìn)行細(xì)胞融合，且具有融合率高、無毒性、操作簡便及融合后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)成活率高等特點，是

32、細(xì)胞工程手段的又一進(jìn)展。實驗儀器CRY-3型細(xì)胞融合儀、細(xì)胞融合池、倒置顯微鏡、刻度離心管、移液槍、血細(xì)胞計數(shù)板、實驗材料雞 的 紅 細(xì) 胞實驗內(nèi)容與實施過程備 注（一）動物血細(xì)胞的制備1.用滅菌的注射器先吸入Alsver液(葡萄糖2.05g，枸椽酸鈉0.88，NaCl0.42g，加重蒸水至100mil）lml，再從雞的翼下靜脈取血0.5-1ml，取出后放入刻度離心管中，再加入2-3ml Alsver液，使總量為4-5ml，混勻并封口，置于4冰箱內(nèi)可供一周內(nèi)使用；2.實驗時取貯備的雞血細(xì)胞lml，加入4ml0.85生理鹽水，混勻后以1200r/min離心5min，去上清液后，最后用0.6mol

33、/L的甘露醇液(或0.6mol/L蔗糖溶液)混勻后以上述離心條件洗滌兩次，最后用0.6mol/L的甘露醇液將雞細(xì)胞稀釋并調(diào)整成每毫升含2×105個。如采用傳代培養(yǎng)的骨髓或腹水瘤細(xì)胞，可先用0.9的生理鹽水洗滌兩次，離心速度為800-1000r/min，每次5min，再用0.6mol/L的甘露醇或蔗糖液洗滌兩次，每次600-800r/min，離心5min，最后用甘露醇調(diào)整成每毫升含瘤細(xì)胞1×105個。（二）細(xì)胞電融合 1.介紹CRY-3型細(xì)胞融合儀的結(jié)構(gòu)和使用方法； 2.電融合操作：用移液管吸取0.1ml調(diào)整好的血細(xì)胞懸液于融合小室中，將融合池置于倒置顯微鏡載物臺上，并將兩電

34、極的輸出端與儀器的輸出電纜接通，然后用低倍鏡找出融合室中央兩電極間的焦面，此時可觀察到血細(xì)胞呈平均分布狀態(tài)，互不接觸；開啟電源，此時可根據(jù)實驗需要，將正弦額度選擇在11.3MHz，脈沖寬度為0.1ms，脈沖電壓為250V，脈沖頻率為1次/s，并依次按下各標(biāo)定按鍵，最后調(diào)整成串交流電壓(即正弦幅度)旋扭，使電壓表處于10-15V處，待細(xì)胞成串相接觸后，按下脈沖觸發(fā)按鈕，此時電融合結(jié)束，關(guān)閉電源。實驗結(jié)果：在倒置顯微鏡下可觀察到由同種細(xì)胞融合形成的細(xì)胞，稱為同核體 (homokaryons)，利用不同親本的不同細(xì)胞彼此融合所形成的細(xì)胞，稱為異核體 (heterokaryons)，還可觀察到3個以上

35、細(xì)胞融合在一起的合胞體。細(xì)胞融合率系指在顯微鏡的視野內(nèi)，已發(fā)生融合的細(xì)胞其細(xì)胞核總數(shù)與該視野內(nèi)所有細(xì)胞(包括已融合的細(xì)胞)的細(xì)胞核總數(shù)之比，稱為融合率，通常以百分比表示，而且要進(jìn)行多個視野測定，再加以平均統(tǒng)計，更為準(zhǔn)確。電融合發(fā)展于20世紀(jì)80年代，是使細(xì)胞在電場中成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強(qiáng)度、短時程的電脈沖擊破細(xì)胞膜，膜的脂類分子發(fā)生重排，由于表面張力作用，兩細(xì)胞發(fā)生融合。實驗作業(yè)1. 繪圖表示所觀察到的融合細(xì)胞。2. 請寫出細(xì)胞電融合的注意事項。參考資料（含參考文獻(xiàn)、期刊、雜志等）實驗總結(jié)思考題：1、說明細(xì)胞電融合的原理2、在細(xì)胞電融合中，設(shè)對細(xì)胞產(chǎn)生可逆性電擊穿的總能量為Q

36、，如何理解各項電參數(shù)之間及其與Q值的關(guān)系?實驗結(jié)果不是很理想，融合率低。原因可能有一下幾點：動物細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)比原生質(zhì)體具有更大的電刺激耐受性，要造成細(xì)胞接觸點處的膜擊穿，需要適當(dāng)加大各種電融合參數(shù)。此外還可在細(xì)胞懸液中加入鏈霉蛋白酶，可改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，并增強(qiáng)膜活性。影響細(xì)胞電融合因素：一、用于供原生質(zhì)體或動物細(xì)胞懸浮的介質(zhì)，必須滿足兩個條件：一是為了保持細(xì)胞的生物活性，使融合后的細(xì)胞能繼續(xù)存活，并通過培養(yǎng)能繼續(xù)分裂和分化，其介質(zhì)要求與細(xì)胞本身具有等滲性；二是為了保證融合之前所施加的各項電參數(shù)充分發(fā)揮作用，其介質(zhì)應(yīng)具有高純度的非離子溶液，如果在溶液中存在Na+、 K+、Ca2+等金屬離子或Cl離

37、子，將使介質(zhì)的導(dǎo)電性增加，當(dāng)施加脈沖波刺激時，據(jù)報導(dǎo)，其總能量Q將通過離子的傳導(dǎo)作用損失80以上，而直接通過細(xì)胞，用于擊穿膜接觸點使其細(xì)胞融合的能量僅占1020%，當(dāng)有離子存在并使電脈沖能量高度損失的情況下，將不能保證細(xì)胞進(jìn)行融合。在介質(zhì)中有金屬離子存在，當(dāng)施加高頻正弦波電場時，不能將細(xì)胞極化成偶極子，從而不能使細(xì)胞間相互接觸和連接，更談不上細(xì)胞間相互融合。為了解決以上存在的問題，一是采用高純度的蒸餾水(三蒸水或四蒸水)來配制介質(zhì)，二是選用適當(dāng)?shù)姆请娊橘|(zhì)溶質(zhì)如甘露醇、山梨醉或蔗糖等來配制供細(xì)胞懸浮的等滲溶液，另外，在清洗電融合室時，以要以高純度的蒸餾水用毛筆擦凈。細(xì) 胞 生 物 學(xué) 實驗課程教案（9）實驗題目 利用PEG為媒介物進(jìn)行動物血細(xì)胞融合實驗學(xué)時3 實驗?zāi)康恼莆绽镁垡叶紴榻閷?dǎo)物對各類細(xì)胞的融合方法實驗原理聚乙二醇分子能改變各類細(xì)胞的腆結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，使細(xì)胞發(fā)生融合。實驗儀器離心機(jī)