考力代綿羊選育與種質(zhì)資源開發(fā)利用技術(shù)報(bào)告

1、.考力代綿羊選育與種質(zhì)資源開發(fā)利用項(xiàng)目技術(shù)報(bào)告一、研究的目的意義考力代綿羊是貴州半細(xì)毛羊培育的主要父本，已適應(yīng)在山區(qū)高寒、高濕條件下生長，成為畢節(jié)市本土化綿羊品種，深受老百姓喜愛。由于農(nóng)戶飼養(yǎng)方式較傳統(tǒng)，品種選育意識(shí)不高，以致該品種出現(xiàn)退化現(xiàn)象，生產(chǎn)性能在下降，存在養(yǎng)殖比較效益不高的問題，所以，開展考力代綿羊的提純復(fù)壯，對(duì)推進(jìn)畢節(jié)市養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展具有重要意義。二、主要研究內(nèi)容1、開展提純復(fù)壯研究。采取傳統(tǒng)選育及分子標(biāo)記輔助選育相結(jié)合的方法，使考力代羊生產(chǎn)速度、繁殖性能有所提高。2、開展?fàn)I養(yǎng)調(diào)控研究。組建試驗(yàn)羊群，設(shè)計(jì)營養(yǎng)配方，進(jìn)行飼料配方篩選。3、開展雜交試驗(yàn)研究。導(dǎo)入生長速度快、繁殖性能高的外

2、血品種雜交，觀察后代生產(chǎn)性能，為新品系培育奠定基礎(chǔ)，為考力代羊開發(fā)探索新路子。三、項(xiàng)目研究內(nèi)容完成情況（一）考力代綿羊提純復(fù)壯研究1、核心群的組建項(xiàng)目經(jīng)過初步選擇標(biāo)準(zhǔn)選擇后，建立了核心群。核心群成員除了以上的種羊外，以后不斷地從其后代羊群中挑選成績優(yōu)秀的個(gè)體，對(duì)核心群進(jìn)行補(bǔ)充和擴(kuò)大，不斷提高核心群的總體水平，核心群組建后，由于有后代的參與，要做好每只羊的檔案記錄和配種安排，避免近交衰退。通過選種選配和后裔選擇，在貴州新烏蒙生態(tài)牧業(yè)發(fā)展有限公司種羊場建立了核心群（表1）。表1 考力代綿羊種羊選擇標(biāo)準(zhǔn) 單位：kg、cm類別體重毛量毛長備注成年公羊554.511.0群體要求羊毛主體細(xì)度50-58支，

3、凈毛率50%，產(chǎn)羔率100%。成年母羊353.09.0一歲公羊403.511.0一歲母羊282.59.0 2、生產(chǎn)性能 （1）體重水平項(xiàng)目實(shí)施后，核心群周歲公、母羊體重55.76kg、45.69kg，比選育前提高15.66%、15.76%；核心群成年公、母羊體重65.86kg、49.72kg，比選育前提高24.24%、17.26%。（表2）。表2 實(shí)施前后核心群體重統(tǒng)計(jì) 單位：kg、只類別性別周歲成年種羊?qū)嵤┣皩?shí)施后實(shí)施前實(shí)施后核心群公羊48.21±0.6855.76±4.3553.01±1.2265.86±5.15母羊39.47±1.2545

4、.69±3.8442.4±1.0549.72±4.72（2）產(chǎn)毛量、羊毛長度及細(xì)度根據(jù)測定，成年公、母羊產(chǎn)毛量分別為5.88kg、4.86kg，提高5.76%、17.96%，羊毛長度分別為12.78±5.23cm、11.23±4.95cm，羊毛細(xì)度分別為28.44±5.1um、27.86±5.72um（表3）。表3 產(chǎn)毛量、羊毛長度及細(xì)度測定統(tǒng)計(jì) 單位：kg、cm、um類別成年公羊成年母羊（kg）實(shí)施前實(shí)施后實(shí)施前實(shí)施后產(chǎn)毛量（kg）5.565.88±0.884.124.86±1.52羊毛長度（cm）9-

5、1312.78±5.239-1311.23±4.95cm羊毛細(xì)度（um）28.44±5.127.86±5.72（3）屠宰率測定屠宰周歲羯羊3只，周歲羊屠宰率為51.01%，凈肉率34.54%（表4）。表4 考力代綿羊屠宰測定年齡編號(hào)宰前活重（kg）胴體重（kg）凈肉重（kg）屠宰率凈肉率（%）（%）周歲羯羊155.528.219.250.81 34.59 256.428.919.851.24 35.11 355.728.418.950.99 33.93 平均55.87 28.50 19.30 51.01 34.54 （4）產(chǎn)羔率項(xiàng)目點(diǎn)產(chǎn)羔統(tǒng)計(jì)，平均產(chǎn)羔率

6、為112.32，繁殖成活率達(dá)91.6%。可見考力代綿羊產(chǎn)羔率低，還需加強(qiáng)雙羔母羊的選擇（表5）。表5 考力代綿羊繁殖性能統(tǒng)計(jì)年度母羊胎次（胎）產(chǎn)羔數(shù)（只）成活羔數(shù)（只）成活率（%）產(chǎn)羔率（%）2016.12017.132636433291.2111.662017.12017.1258365760491.9112.69平均45551146891.6112.32（二）生長速度、繁殖性能和毛用性狀相關(guān)基因分子標(biāo)記研究對(duì)影響毛羊的生長性狀的基因GHSR、CIS、繁殖力性狀的基因GDF9、BMP15、ESR、毛用性性狀的KRT26為侯選基因進(jìn)行篩選，采用PCR產(chǎn)物直接測序法對(duì)上述基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢

7、測，以期尋找到與高繁殖力，高生長，毛用性能好相關(guān)的SNPS，確定基因效應(yīng)，探求與三個(gè)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為考力代綿羊的進(jìn)一步選育提供理論依據(jù)。（1）實(shí)驗(yàn)樣品：考力代綿羊選自馬干山種羊場，自繁自養(yǎng)，健康狀況良好的基礎(chǔ)經(jīng)產(chǎn)母羊共36只。（2）實(shí)驗(yàn)方法采集樣品：每只羊通過頸靜脈采集血液，裝在真空抗凝采血管中，快速振蕩混勻，放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室-20冰箱保存?zhèn)溆谩Ｑ蚧蚪MDNA的提?。翰捎肊ZUP柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，并用紫外分光光度計(jì)測量其濃度測OD值，計(jì)算 OD 260 / OD 280 比值，若比值接近 1.8 ，說明樣品中的蛋白質(zhì)去除的比較干凈；若比值小于 1.6 ，說明樣

8、品含有較多的蛋白質(zhì)或其它離子， DNA抽提效果不好，需重新提取。引物：根據(jù) GenBank 發(fā)表的綿羊GDF9基因(登錄號(hào)：NC_019462)的第二外顯子、BMP15基因(登錄號(hào): NC_019484.1)的第二外顯子、ESR基因(登錄號(hào):NC_019465.1)部分外顯子序列，GHSR(登錄號(hào): NM_001009760.1)，CISH (登錄號(hào):NC_019476.1)、KRT26(登錄號(hào): XM_004012872.1)第一、二外顯子，采用Primer5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表6 。表6 引物序列、產(chǎn)物長度及退火溫度引物產(chǎn)物長度上游引物序列

9、( 53)下游引物序列( 53) GDF9768bpGCTCCATACTCATTTACCTATGAAGATATGATAGCCACTBMP15774bpCTTCACCTAACTCATTCCCACTACTCCCATACTAACGGGTCAG ESR712bpATTCGCTCGCTCGGTTCTATAGGGGGAGGTGAGGCTTGGTTGHSR549bpTCACTCATTATTCTACACCAGAAGCACACCCAATFTCCAAATTAAGG CISH765bpCCAGGGAGAGGTGAGGAGAATTTACTGGGTGCCCTAGCAGKRT26841bpGGGCCAGCTTTCCACC

10、TACCCAAGCGCTGGGAATGTAGT 使用真空冷凍干燥的OligoDNA為白色粉末，附在離心管內(nèi)壁上。稀釋前，將引物管離心數(shù)秒使 DNA 聚集到管底，加入100倍摩爾數(shù)的雙蒸水，蓋好管蓋，渦旋震蕩混勻并使其充分溶解，然后再離心數(shù)秒，保存4冰箱過夜。第二天取出放入-20保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物檢測：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4µl,同時(shí)用DL2000DNAMarker作參照，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120V，電泳25min。電泳結(jié)束后將瓊脂糖凝膠放在凝膠成象系統(tǒng)上觀察并記錄擴(kuò)增片段的大小和濃度，選取擴(kuò)增效果好且量足的樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。測序和BLAST分析：將特異性好、產(chǎn)量高的PCR

11、產(chǎn)物委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行純化和雙向測序，測序結(jié)果利用 DNASTAR 軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行校正，BLAST分析確定SNPs。（3）結(jié) 論根據(jù)綿羊GDF9基因序列的第二外顯子、BMP15基因序列的第二外顯子、ESR基因部分外顯子、GHSR基因的第二外顯子、CISH基因的部分外顯子、KRT26基因的第二外顯子序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR產(chǎn)物直接測序法檢驗(yàn)在品種中的基因多態(tài)性，并與產(chǎn)仔數(shù)，生長性能，毛用性能進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)論如下：一是對(duì)六個(gè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確立了最佳PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，對(duì)PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行直接測序，測序結(jié)果顯示考力代綿羊品種的三個(gè)性轉(zhuǎn)的六個(gè)基因中，影響繁殖性狀

12、及生長性狀的五個(gè)基因均為中度多態(tài)，而影響毛用性能的KRT26基因比較穩(wěn)定。二是檢測GDF9基因在第2外顯子的562 bp處有 1個(gè)AC的單堿基突變,堿基突變導(dǎo)致谷氨酰胺突變?yōu)楦彼??？剂Υd羊產(chǎn)羔數(shù)在兩個(gè)基因型之間呈現(xiàn)出AC>AA，差異極顯著( P<0.01 ) 。三是檢測BMP15基因外顯子2的480bp處發(fā)現(xiàn)CG 堿基突變，堿基突變導(dǎo)致谷氨酰胺突變谷氨酸?？剂Υd羊BMP15基因產(chǎn)羔數(shù)在兩個(gè)基因型之間呈現(xiàn)出CG>CC，差異顯著(P<0.05 ) 。四是在ESR基因中檢測出2個(gè)單堿基突變，在第841位點(diǎn)發(fā)生了由GA堿基突變;第1018位點(diǎn)發(fā)生了由GT堿基突變，堿基突變

13、沒有引起氨基酸的改變。ESR基因產(chǎn)羔數(shù)在三個(gè)基因型之間呈現(xiàn)出GA>GG，差異顯著( P<0.0 5) ； 產(chǎn)羔數(shù)在三個(gè)基因型之間呈現(xiàn)出TT>TG>GG，差異極顯著(P<0.01 ) 。五是在GHSR基因中檢測出2個(gè)單堿基突變。T70G和G229T均引起氨基酸同義突變。突變前后GHSR基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最小自由能由-378.3 KCal/mol變?yōu)?377.6 KCal/mol，并影響到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。六是在CISH基因中檢測出第二外顯子的213bp處有一個(gè)TC的單堿基突變，為同義突變，沒有引起氨基酸的改變。七是影響毛用性能的基因KRT26沒有突變

14、發(fā)生，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，不會(huì)引起考力代綿羊毛用性能發(fā)生改變。（三）考力代綿羊?qū)胪庋岣呱a(chǎn)性能的雜交組合試驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)施中開展兩個(gè)雜交試驗(yàn)，分別利用陶賽特綿羊和薩福克綿羊與考力代綿羊雜交，陶考雜F1代、薩考雜F1代3.5月齡斷奶體重分別為16.34±2.94kg、18.75±4.53kg，比考力代15.19±4.28kg分別提高了7.57%、23.44%，雜交試驗(yàn)效果顯著（表7）。表7 雜交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)父本品種母本品種初生重（kg）3.5月斷奶重（kg）雜交F1比純繁提高比例考力代考力代3.65±4.4315.19±4.28陶賽特考力代4.12±

15、;4.6716.34±2.947.57%薩?？丝剂Υ?.75±5.4218.75±4.5323.44%（四）設(shè)計(jì)配方，篩選飼料配方 根據(jù)貴州新烏蒙生態(tài)牧業(yè)發(fā)展有限公司飼料原料情況篩選出的相關(guān)飼料配方見表8-16。表8 考力代綿羊種公羊非配種期全混日糧配方及營養(yǎng)成分原料配比/%營養(yǎng)素含量/%玉米42.0干物質(zhì)85.38麥麩10.0消化能/（兆焦/千克）11.50玉米秸稈35.0代謝能/（兆焦/千克）9.43豆餅10.0粗蛋白11.07磷酸氫鈣1.0粗脂肪2.73石粉1.0中性洗滌纖維35.74食鹽0.5酸性洗滌纖維24.83預(yù)混料0.5鈣0.62合計(jì)100磷0.44

16、表9 考力代綿羊空懷和妊娠前期母羊混合精料配方原料配比/%營養(yǎng)素含量/%玉米58.0干物質(zhì)83.43豆粕5.0消化能/（兆焦/千克）13.20麥麩10.0代謝能/（兆焦/千克）10.76米糠10.0粗蛋白15.10菜籽粕13.0粗脂肪4.24磷酸氫鈣0.5中性洗滌纖維15.37石粉2.0酸性洗滌纖維7.04食鹽0.5鈣0.88預(yù)混料1.0磷0.65合計(jì)100表10 考力代綿羊妊娠后期母羊精料配方原料配比/%營養(yǎng)素含量/%玉米58.0干物質(zhì)84.02豆粕8.0消化能/（兆焦/千克）13.23麥麩6.5代謝能/（兆焦/千克）10.85米糠8.0粗蛋白16.97菜籽粕16.0粗脂肪3.84磷酸氫鈣0

17、.5中性洗滌纖維14.73石粉1.5酸性洗滌纖維7.23食鹽0.5鈣0.72預(yù)混料1.0磷0.64合計(jì)100表11 考力代綿羊泌乳后期混合精料配方及營養(yǎng)成分原料配比/%營養(yǎng)素含量/%玉米60.0干物質(zhì)87.36大豆粕8.0消化能/（兆焦/千克）13.06麥麩16.0代謝能/（兆焦/千克）10.71菜籽粕12.0粗蛋白15.72磷酸氫鈣1.0粗脂肪2.95石粉1.5中性洗滌纖維15.84食鹽0.5酸性洗滌纖維6.56預(yù)混料1.0鈣0.83合計(jì)100磷0.67表12 考力代綿羊羔羊代乳料配方及營養(yǎng)成分原料配比/%營養(yǎng)素含量/%玉米20.0干物質(zhì)61.24麥麩10.5消化能/（兆焦/千克）9.01大

18、豆30.0代謝能/（兆焦/千克）7.39石粉1.0粗蛋白24.66食鹽0.5粗脂肪11.65預(yù)混料1.0中性洗滌纖維8.29豬脂5.0酸性洗滌纖維3.96干脫脂奶粉30.0鈣0.83酵母2.0磷0.63合計(jì)100表13 考力代綿羊哺乳期羔羊補(bǔ)料配方及營養(yǎng)成分原料配比/%營養(yǎng)素含量/%玉米25.5干物質(zhì)84.16豆粕31.0消化能/（兆焦/千克）12.63麥麩10.0代謝能/（兆焦/千克）10.35花生仁粕15.0粗蛋白26.25高粱10.0粗脂肪2.38磷酸氫鈣1.0中性洗滌纖維13.92石粉1.0酸性洗滌纖維7.36食鹽0.5鈣0.76預(yù)混料1.0磷0.66糖蜜5.0合計(jì)100表14 考力代

19、綿羊育肥前期精料配方原料配比/%營養(yǎng)素含量/%玉米59.0干物質(zhì)87.82大豆粕25.0消化能/（兆焦/千克）12.65小麥麩6.5代謝能/（兆焦/千克）10.37磷酸氫鈣0.5粗蛋白16.94石粉0.5粗脂肪2.99食鹽1.0中性洗滌纖維10.79預(yù)混料4.0酸性洗滌纖維4.72米糠3.5鈣0.39合計(jì)100磷0.47表15 考力代綿羊育肥中期精料配方原料配比/%營養(yǎng)素含量/%玉米58干物質(zhì)87.51麥麩15消化能/（兆焦/千克）12.85菜籽粕18代謝能/（兆焦/千克）10.53豆粕5粗蛋白16.79磷酸氫鈣0.5粗脂肪2.76石粉1.5中性洗滌纖維13.13食鹽1.0酸性洗滌纖維5.79預(yù)混料1.0鈣0.74合計(jì)100磷0.64表16 考力代綿羊育肥后期精料配方原料配比/%營養(yǎng)素含量/%玉米70.0干物質(zhì)88.11大豆餅10.0消化能/（兆焦/千克）13.27菜籽餅14.5代謝能/（兆焦/千克）10.88磷酸氫鈣1.0粗蛋白13.57石粉1.0粗脂肪4.29食鹽1.5中性洗滌纖維12.14預(yù)混料1.0酸性洗滌纖維5.20尿素1.0鈣0.73合計(jì)100磷0.56四、項(xiàng)目取得成效及創(chuàng)新（一）品種